3 Células Tronco, Terapia Gênica e Farmacogenética

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3 Descrição Células-tronco, terapia gênica e farmacogenética: suas aplicações e contribuições no diagnóstico e o tratamento de doenças.
Propósito
Reconhecer a importância das células-tronco, da edição gênica e da terapia individualizada, por meio da farmacogenética, na melhora da qualidade de vida de muitos pacientes.
Objetivos Módulo 1 Células-tronco Reconhecer as aplicações das células-tronco.
Módulo 2 Farmacogenética Reconhecer as práticas da farmacogenética.
Módulo 3 Terapia gênica Reconhecer o processo de terapia gênica.
Introdução
Muito se tem falado sobre testes moleculares, sequenciamento de DNA, transgênicos, vacinas, mas você sabia que todos esses produtos são frutos da Biotecnologia? Pois é, a Biotecnologia é uma área multidisciplinar que busca soluções para diversos problemas da humanidade pelo uso de organismos vivos ou partes destes. Suas aplicações na agropecuária, na área ambiental, industrial e alimentícia são bem reportadas. Você sabia que a Biotecnologia já salvou muitas vidas?
Na Saúde, a Biotecnologia tem contribuído para o entendimento de diversas doenças, bem como seu diagnóstico rápido, formas de prevenção e terapias mais adequadas e eficientes. Algumas das suas vertentes englobam os testes moleculares, como o sequenciamento de DNA para o diagnóstico de doenças genéticas, o uso e obtenção de células-tronco, capazes de se transformar em outras células no tratamento de doenças, a terapia gênica e a edição genômica, que permitem consertar defeitos genéticos em nossas células, e a farmacogenética, que possibilita o uso mais preciso de fármacos, de acordo com a capacidade de metabolização do nosso organismo, gerando uma otimização do tratamento.
Com essas e outras aplicações da Biotecnologia, a medicina tradicional tem sido revolucionada e a compreensão do material genético humano tem aberto novas possibilidades para o tratamento de doenças. Agora, vamos dar uma olhada nas metodologias mais inovadoras, como a utilização das células-tronco, a terapia gênica e a farmacogenética que são utilizadas nesta área.
Introdução ao uso das células-tronco
Terapia com células-tronco
O organismo humano é formado por diversos órgãos, como o coração, pulmão e rim, que desempenham funções determinadas. Cada órgão é formado por um conjunto de células que formam os tecidos. Há diversos tipos de tecidos com diferentes propriedades e características. Somos formados basicamente por células especializadas em determinados tecidos que, juntos, formam os órgãos. Doenças podem gerar danos nesses tecidos.
Uma das formas de curar danos ou traumas aos tecidos/membros ou órgãos é pelo uso de células-tronco. As células-tronco são células capazes de se diferenciar em outros tipos de células, restaurando aquele tecido.
Além disso, muitas doenças ocorrem em tecidos que não possuem a capacidade de se regenerar, como o tecido nervoso, os neurônios, e o tecido muscular cardíaco. Danos nesses tecidos são irreversíveis e o uso de células-tronco para restaurá-los (e consequente, o órgão também) tem sido promissor.
Células-tronco e sua capacidade de se transformar em tecidos para restituir órgãos.
O uso de células-tronco como terapia vai muito além. Podemos usar para restaurar traumas, reconstruir membros, testar novos medicamentos e entender como doenças se desenvolvem.
Agora, vamos ver o uso de células-tronco para tratamento.
Tipos de células-tronco
As células-tronco são consideradas células indiferenciadas, capazes de se diferenciar em outros tipos de tecidos e, portanto, de se transformar e de restaurar um tecido danificado. Seu uso tem ajudado a restaurar órgãos em que o transplante não é possível, a tratar órgãos de pacientes que poderiam morrer na fila de espera por um transplante e na compatibilidade da célula/tecido, uma vez que são retiradas células-tronco do próprio paciente, não tendo risco de rejeição.
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Curiosidade
Também tem sido demonstrada a capacidade de transformação das células-tronco em diversos tecidos, por exemplo: células cardíacas, células nervosas, células produtoras de insulina, da medula óssea, entre diversos outros tipos de tecidos.
As células-tronco são a base para a formação dos tecidos e órgãos do nosso organismo. Todas elas possuem a capacidade de autorrenovação e de se diferenciar (formar outros tecidos). Podem ter origem embrionária, de tecidos adultos ou ainda serem induzidas. A seguir, vamos compreender melhor cada uma dessa origens:
Células-tronco embrionárias
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São as células obtidas do embrião, formadas 3 a 5 dias após a fecundação do espermatozoide com o óvulo. Nesse estágio, o embrião é chamado de blastocisto e é composto por uma massa celular interna capaz de se diferenciar em todos os tecidos humanos, além dos tecidos da placenta e anexos embrionários.
Representação 3D de células-tronco embrionárias.
São as células-tronco mais potentes que podemos ter, capazes de formar um organismo vivo e todos os tecidos necessários ao seu desenvolvimento. São chamadas de células-tronco totipotentes. Essas células podem ser obtidas de embriões fertilizados in vitro e usadas para fins de pesquisa após consentimento informado.
Células-tronco adultas
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Alguns tecidos necessitam de células para sua renovação e crescimento. Ou seja, podemos obter algumas células-tronco de tecidos adultos, que estão lá com a função de renovar aquele tecido. Esse tipo de célula-tronco pode ser mais difícil de encontrar e cultivar em laboratório. Sua capacidade de autorrenovação é menor do que as células-tronco embrionárias, mas podem ser usadas no tecido específico. Por exemplo, podemos obter células-tronco na medula óssea que forma o sangue, as células do sistema imunológico e as plaquetas.
As células-tronco adultas podem ser extraídas da medula óssea.
Essas células podem ser usadas para tratar doenças que as afetam, mas não conseguem se diferenciar em outras células, como células do fígado, rim, coração, por exemplo. Assim como as células-tronco desses tecidos/órgãos não conseguem se transformar em células do sangue.
Alguns tipos de células-tronco adultas incluem as hematopoética (do sangue), epiteliais (tecidos de revestimento), mesenquimais (tecidos ósseos, cartilaginosos e adiposos), do cordão umbilical etc. Assim, as células-tronco adultas não são iguais e sua capacidade de diferenciação depende de qual parte do corpo elas foram isoladas.
Células-tronco pluripotentes induzidas (IPS)
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Como o nome sugere, as iPS são induzidas em laboratório, por meio de uma reprogramação genética da célula. Aqui, temos o DNA como alvo de estudos, uma vez que ele controla todas as funções de uma célula. Cientistas têm conseguido reprogramar o DNA para que a célula retorne ao ponto de indiferenciação e seja capaz de gerar outros tecidos. Qualquer tipo de célula pode ser reprogramado para ser uma iPS.
Embora não tenham as mesmas capacidades das células-tronco embrionárias, podem se transformar em todos os tecidos, com exceção dos embrionários. Esse tipo de célula-tronco foi criada em 2007 e muitas pesquisas têm sido realizadas para possibilitar seu uso como terapia.
Obtenção de células-tronco pluripotentes induzidas.
Na imagem, vemos em amarelo o cultivo de células-tronco embrionárias (1). A partir de um vetor (no exemplo um vírus), é possível introduzir meus genes de interesse e reprogramar as células para que elas tenham as características da célula vermelha, que será a nossa iPS (2). Assim podemos, a partir da expressão de proteínas, por exemplo, selecionar as células vermelhas, que foram reprogramadas (3). Após o isolamento, conseguimos ter um cultivo apenas com as nossas iPS (4).
Além da origem dessas células-tronco, elas também podem ser classificadas de acordo com a sua capacidade de transformação.
Células-tronco totipotentes
São aquelas células capazes de se transformar em todos os tipos de células, incluindo a placenta. Surgem logo após a fecundação e são as células-tronco com a maior capacidade de diferenciação que podemos ter.
Células-tronco multipotentes
São aquelas com capacidadede se diferenciar em uma família ou grupo de células relacionadas como, por exemplo, as células-tronco hematopoéticas.
Células-tronco pluripotentes
São aquelas com capacidade de se diferenciar em todos os tipos de tecidos com exceção da placenta.
Células-tronco onipotentes
São aquelas com capacidade de se transformar em um único tipo de célula.
O que de fato acontece é que, durante a fecundação, os primeiros estágios do embrião dão origem a um conjunto de células, chamado blastocisto, que vai se diferenciar em todos os tipos de tecidos para formar um ser vivo. São ditas células-tronco embrionárias totipotentes, devido à sua capacidade de se transformar em todos os tipos de células. Conforme o desenvolvimento do embrião, essas células vão perdendo a capacidade de totipotência ao irem se transformando em células de diferentes tecidos, o que dará origem às células-tronco adultas, com capacidade menor de transformação.
Diferenciação entre as células conforme a capacidade de transformação.
Nos dias atuais, pesquisadores e cientistas têm utilizado células adultas para transformar em células pluripotentes, com capacidade de se transformar em todas as células novamente, mas não são células embrionárias.
Aplicações das células-tronco
Substituição de tecidos, órgãos ou membros (medicina regenerativa)
As células-tronco podem ser usadas para substituir órgãos ou tecidos danificados, restaurar a função do tecido/órgão e serem estimuladas a gerar células saudáveis para substituir as doentes ou mortas. Essa aplicação tem sido bem-sucedida para o tratamento de diferentes doenças, como:
· Doenças hematopoiéticas, como leucemia, linfomas, síndrome mielodisplásica, anemia falciforme, beta talassemia, imunodeficiências;
· Distúrbios metabólicos, como diabetes tipo 1;
· Doenças neurodegenerativas, como doença de Parkinson, esclerose múltipla, doença de Alzheimer;
· Diversas doenças cardíacas, como infarto e insuficiência cardíaca; queimaduras; câncer, entre outras.
Na imagem a seguir podemos ver uma aplicação das células-tronco em tratamento de doença crônica:
Terapia com o uso de células-tronco coletadas da medula óssea ou de tecido adiposo para tratar osteoartrite.
As células-tronco também podem ser estimuladas a formarem membros inteiros, tendo grande potencial em transplantes e na medicina regenerativa.
Essa última área surgiu como resposta ao uso de células-tronco para regenerar ou restituir tecidos/órgãos danificados.
Para o sucesso do tratamento, as células-tronco devem ser coletadas, sobreviver e se multiplicar in vitro, para então serem estimuladas a se transformar no tecido específico que vai ser colocado.
Nos dias atuais, a medicina regenerativa avançou e adicionou novos conceitos para além das células-tronco. É possível combinar a engenharia de tecidos, a engenharia de materiais e a microengenharia para o desenvolvimento de organoides.
Mas o que são organoides?
É o nome dado ao cultivo, em laboratório, de células-tronco para gerar um miniórgão, que embora não complete totalmente o órgão, ajuda a modular e reestruturar a sua função.
Para isso, são usadas culturas celulares 3D com células-tronco pluripotentes de origem embrionária ou induzidas (iPS), ou células adultas do órgão em questão, em que são fornecidos artificialmente todos os nutrientes e condições de crescimento celular.
Na cultura 3D, as células podem crescer em todas as direções, similar a um órgão no organismo.
Foto de um organoide intestinal criado a partir de células-tronco pluripotentes.
A medicina regenerativa também tem sido utilizada na estética para tratamentos rejuvenescedores e prevenção do envelhecimento dos tecidos.
Compreensão de doenças
Como as células-tronco se diferenciam para diversos tecidos, podendo formar até órgãos e membros, pesquisas têm sido desenvolvidas para entendimento de doenças. Nessa aplicação, é possível desenvolver em laboratório células humanas de determinado tecido e estudá-las. Os resultados com a compreensão de doenças ajudam a entender como elas ocorrem e, assim, se determinar formas de prevenção e tratamento. Esses avanços têm levado a uma melhor compreensão dos mecanismos celulares e moleculares do desenvolvimento de diversas doenças. Essa aplicação das células-tronco tem sido associada a metodologias de reprogramação celular e de edição de genes.
Esquema ilustrando as etapas para a utilização das células-tronco para a compreensão de doenças.
Muitas pesquisas necessitam das células e dos tecidos doentes para estudo, o que vem de pacientes e, nem sempre, eles estão disponíveis. As células-tronco têm ajudado a contornar esse problema, ao permitir que tecidos sejam formados e estimulados a desenvolver doenças para estudo, os chamados modelos de doenças.
Reprogramação das iPS para transformação em células-tronco e posterior transformação no tipo de tecido de interesse.
A compreensão de como as células se diferenciam em outras células especializadas permitiu a reprogramação e o surgimento das células-tronco induzidas (iPS).
As iPS são células adultas reprogramadas para se tornarem células-tronco, e depois transformadas no tipo de tecido de interesse.
Qualquer tipo de célula pode ser reprogramada e o uso dessas células também contribui para o entendimento de doenças, uma vez que são usadas as células do paciente para se recriar a doença em laboratório.
Assim, essas células têm sido utilizadas para entender como ficamos doentes. Diversas doenças neurológicas e distúrbios hematológicos são estudados por esses modelos.
Testes de medicamentos
O desenvolvimento de novos medicamentos leva tempo, pois diversos testes devem ser realizados para comprovar a sua eficácia, segurança e possíveis efeitos colaterais.
As células-tronco têm se mostrado aliadas nesse desenvolvimento, uma vez que podem ser transformadas nas células do tecido que o novo medicamento atua e, assim, verificar a sua eficácia em tecidos humanos antes de ser utilizada para tratamento.
Os testes com células-tronco também são importantes para se medir a toxicidade dos medicamentos, principalmente, sobre o tecido cardíaco e neurológico. Também permitem avaliar como o medicamento pode agir em diferentes pessoas, ao utilizar as células de diferentes indivíduos para mimetizar os tecidos e órgãos de cada um.
Novos medicamentos podem ser testado em células-tronco diferenciadas.
Nesse tipo de aplicação, podemos ter o uso de células-tronco para se obter tecidos específicos para triagem de novos compostos com ação farmacológica, eficácia e segurança de novos medicamentos, toxicidade dos compostos e entender como o medicamento age sobre as células.
Testes de medicamentos a partir das células-tronco.
O uso de animais para descoberta de novos medicamentos, muitas vezes, não corresponde ao efeito esperado em humanos. Já as células-tronco podem indicar de início esses problemas por se tratar de células humanas. Além disso, novas moléculas terapêuticas produzidas pelas próprias células daquele tecido cultivado em laboratório têm sido utilizadas para se reparar um tecido danificado.
Algumas limitações no uso de células-tronco incluem:
· Sua obtenção;
· Sua diferenciação em tecidos específicos (o que envolve o uso de moléculas estimulantes);
· O controle de qualidade para se evitar a contaminação com outras células;
· O crescimento em um número adequado para se realizar os testes.
No futuro, espera-se criar modelos de estudos com diferentes tipos de células que interajam entre si, formando sistemas; e assim, medir a ação do medicamento sobre diferentes interações, mimetizando um organismo.
A seguir vemos um esquema mostrando que a partir de organoides é possível recriar um ambiente imitando todas as condições fisiológicas para o seu funcionamento, como por exemplo, oferecer o aporte sanguíneo necessário. Dessa forma, conseguimos, por exemplo, criar um modelo in vitro que mimetizem a fisiologia de muitos órgãos, chegando mais perto da realidade de um organismo e compreendendo como acontece o desenvolvimento de uma determinada patologia ou então a ação de algum fármaco.chevron_left
Nas culturas 2D, as células crescem sobre as placas, fazendo com que elas expressem proteínas de adesão, cresçam horizontalmente e tenham uma interação limitada entre as células.
A partir da tecnologia dos organoides foi possível em uma cultura 3D cultivar vários tipos celulares, que interagem entre si, produzem vários mediadores que são capazes de modular as células ali presentes. Além disso, as células adquirem uma arquitetura que mimetiza o tecido e/ou órgão.
Os avanços da tecnologia permitem ainda que os organoides sejam colocados em dispositivos microfluídos recriando o ambiente fisiológico e melhorando as condições de cultivos.
Além disso, a tecnologia e os estudos na área estão evoluindo para a criação de modelos em laboratório que mimetizem os sistemas, a partir da interligação e comunicação entre esses organoides. A partir desses modelos, muitos estudos e pesquisa serão realizados para, por exemplo, avaliar durante as fases pré-clínicas do desenvolvimento de novas drogas, como uma possível droga atua no organismo humano, não precisando assim da etapa de estudo em animais e diminuindo algumas das limitações encontradas hoje.
Legislação e aspectos éticos no uso das células-tronco
O uso de células-tronco embrionárias levantou uma série de questionamentos, principalmente, pela forma como são obtidas: a partir de embriões, logo após a fecundação, gerando uma discussão ética quanto ao seu uso. O ponto principal gira em torno do questionamento sobre em que momento se inicia a vida, tema que apresenta dois pontos de vista distintos:
Acredita-se que o embrião é um ser humano vivo e que deve ter seus direitos à vida protegidos.
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Por outro lado, acredita-se que os embriões, no início da formação, ainda não são seres humanos e que seu uso teria consentimento do casal doador.
A Biotecnologia trouxe à tona diversas questões éticas e de segurança que deram origem a áreas como:
Bioética
Visa indicar os limites e finalidades do que é permitido realizar na medicina ou ciências biotecnológicas. Muitas vezes, referida como “ética da vida”.
Biossegurança
Visa à segurança do trabalhador, da população e do meio ambiente, referente às atividades de pesquisa, produção e desenvolvimento laboratorial.
Biodireito
Visa o cumprimento da bioética e biossegurança por meio da criação de normas e sanções para o seu descumprimento.
A obtenção de células-tronco embrionárias é polêmica e gera muita discussão em diversos países, nos quais cada um regulamenta leis e diretrizes para o seu uso com base nos princípios de cada sociedade.
As questões bioéticas que envolvem o uso de células-tronco embrionárias geram um conflito de valores entre aspectos culturais, econômicos, políticos, sociais, genéticos, antropológicos etc. Diante de todo esse dilema, existem países que permitem a pesquisa e o uso de células-tronco para tratamento e outros que proíbem essa técnica.
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Curiosidade
No Brasil, a Lei de Biossegurança nº. 11.105, de 2005, permite o uso de embriões obtidos por fertilização in vitro congelados por pelo menos três anos ou embriões inviáveis, com consentimento dos genitores, para fins de pesquisas, sendo proibida a sua comercialização.
Esses embriões são obtidos de clínicas de fertilização. Somente pessoas jurídicas podem ter autorização para trabalhar com qualquer tipo de célula-tronco e todo projeto precisa ser aprovado por comitês e órgãos antes de ser iniciado, tendo ainda um acompanhamento quanto às pesquisas.
Uma alternativa à questão ética do uso de embriões está no uso de células-tronco adultas e as iPS. Apesar disso, as células-tronco embrionárias são as de maior capacidade de diferenciação. Existem hoje, no Brasil, clínicas que coletam e congelam por criopreservação as células-tronco do cordão umbilical de recém-nascidos para possíveis tratamentos futuros.
Questão 1 As células-tronco são células com capacidade de se transformar em outros tipos de células. De acordo com a sua origem, podemos ter células-tronco embrionárias, células-tronco adultas e células-tronco induzidas. As células-tronco embrionárias são as que possuem a maior capacidade de diferenciação, sendo capazes de gerar qualquer tipo de células/tecidos, incluindo as da placenta e anexos embrionários. Essas células são denominadas:
A Totipotentes X
B Pluripotentes
C Multipotentes
D Oligopotentes
E Onipotentes
Questão 2 No mundo, existe uma enorme discussão ética quanto ao uso de células-tronco embrionárias, pela forma que são obtidas. No Brasil, a Lei de Biossegurança nº. 11.105, de 2005, estabelece as diretrizes para se trabalhar com este tipo de célula, o que determina:
A O uso de células-tronco embrionárias obtidas por fertilização in vitro de qualquer genitor que não as quiser.
B O uso de células-tronco embrionárias obtidas de clínicas de fertilização após 3 anos congelados ou embriões inviáveis, com consentimento dos genitores e para fins comerciais.
C O Brasil não possui diretrizes quanto ao uso de células-tronco embrionárias, cabendo a cada instituição privada ou particular determinar como deve obter e utilizar este tipo de célula.
D O uso de células-tronco embrionárias obtidas de clínicas de fertilização após 3 anos congelados ou embriões inviáveis, com consentimento dos genitores e para fins de pesquisa. X
E O Brasil proíbe o uso de células-tronco embrionárias para quaisquer fins.
2 Introdução à Farmacogenética/ Farmacogenômica
Conceitos iniciais
Com as metodologias de sequenciamento de DNA e seu aperfeiçoamento, muitos genes foram sequenciados e seu papel determinado em diversas doenças. Neste contexto, destaca-se a farmacogenética/farmacogênomica, uma ciência que se baseia na sequência do gene de cada indivíduo para se determinar qual opção terapêutica e a dose mais eficazes. A associação da farmacologia com dados genômicos é primordial para a escolha e o sucesso terapêutico, principalmente, para o tratamento do câncer.
Você lembra o que é sequenciamento de DNA?
Primeiro precisamos lembrar que o DNA é composto por duas fitas complementares de nucleotídeos, formados por uma molécula de fosfato, um açúcar de 5 carbonos, também chamado de pentose, no caso do DNA esse açúcar é do tipo desoxirribose, e uma base nitrogenada.
Existem quatro tipos de bases nitrogenadas e que dão nome aos nucleotídeos, são elas: Adenina (A), Timina (T), Citosina (C) e Guanina (G), que se enrolam e formam uma estrutura de hélice, por isso dizemos que o DNA é uma dupla hélice.
Esse processo é possível devido às ligações que os nucleotídeos fazem entre si para formar essa molécula.
Sabemos que os nucleotídeos encontrados são ligados entre si através de ligações de hidrogênio que ocorrem entre as bases nitrogenadas, onde:
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A se liga a T, por meio de duas ligações de hidrogênio.
G se liga a C por meio de três ligações de hidrogênio.
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chevron_left1 de 2chevron_right
Assim, se sabemos que uma fita de DNA é formada por ATCCGATTT, a fita complementar será composta por TAGGCTAAA, uma vez que o DNA é dupla fita e complementar. Além das ligações entre as bases nitrogenadas para formar a dupla fita do DNA, os nucleotídeos também são ligados uns aos outros por meio de ligações fosfodiéster, que ocorrem entre o açúcar do nucleotídeo anterior e o grupo fosfato do próximo nucleotídeo.
Relembrando como é a estrutura do DNA, conseguimos compreender que o sequenciamento dessa molécula é a determinação da sequência exata de nucleotídeos de um indivíduo, os componentes básicos do DNA.
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Saiba mais
Com o projeto do genoma humano, foi possível sequenciar 3,1 milhões de nucleotídeos que compõem o nosso material genético, permitindo a compreensão de como falhas ou alterações no DNA causam doenças. O sequenciamento de DNA tem sido utilizado para estudos evolutivos, filogenéticos, clonagem gênica, reprodução, diagnóstico, desenvolvimento de tratamentos e obtenção de conhecimentos.
A primeira metodologia de sequenciamento de DNA descrita, em 1977, foi chamada de método de Sanger, método didesoxi ou método de terminação decadeia.
O nome deste método se deve ao pesquisador Frederick Sanger, do laboratório de biologia molecular da Universidade de Cambridge, no Reino Unido. Seus achados foram tão importantes para a humanidade que renderam dois prêmios Nobel de química (em 1958 e em 1980, juntamente com o físico e bioquímico Walter Gilbert).
Frederick Sanger (1918 -2013).
Como ocorre o sequenciamento?
Para entendermos como ocorre o processo de sequenciamento de DNA desenvolvido por Sanger, precisamos entender como essa informação é passada adiante para as células. Assim, podemos dizer que a replicação celular está diretamente associada à replicação do DNA, sendo fundamental para o correto funcionamento de qualquer célula. A replicação de DNA requer uma série de enzimas e o próprio DNA como molde. Assim como uma célula surge de outra pré-existente, o DNA também surge de outro preexistente.
Ilustração de mecanismo de replicação do DNA.
Uma das enzimas que participam do processo de replicação é a DNA polimerase, responsável por formar a ligação fosfodiéster pela adição de novos nucleotídeos na cadeia que está sendo formada. Dizemos que a replicação de DNA é semiconservativa, pois metade do DNA é recém-sintetizado ou polimerizado, e a outra metade é antiga, que serve como molde para adição de novos nucleotídeos com base na complementariedade (A-T e C-G).
Tanto in vivo quanto in vitro, vamos precisar de todos esses componentes para replicação do DNA: condições ideais, os quatro nucleotídeos e a DNA polimerase.
Como falado anteriormente, a DNA polimerase desenvolve um papel importante nesse processo e na ligação fosfodiéster entre os nucleotídeos, e para entender como o sequenciamento de DNA ocorre, vamos precisar compreender melhor o papel dessa enzima. A DNA polimerase é capaz de:
Adicionar nucleotídeos à fita crescente de DNA, com base nos nucleotídeos do DNA da fita molde.
Adicionar novos nucleotídeos sempre no sentido 5’-3’.
Além disso, requer um pequeno seguimento de DNA na cadeia molde para poder realizar a ligação fosfodiéster. Esses pequenos seguimentos de DNA são chamados de primers ou iniciadores. A DNA polimerase tem ação exonucleotídica e gasta energia proveniente dos próprios nucleotídeos soltos.
A ligação fosfodiester ocorre no sentido 5’-3’, mas o que quer dizer isso?
Ligação fosfodiéster entre os nucleotídeos da mesma fita.
A DNA polimerase não consegue reconhecer apenas o molde de DNA e realizar a fita complementar. Para que a reação ocorra, é necessário adicionar pequenos seguimentos de DNA ou RNA (ácido ribonucleico) na fita a ser sintetizada para servir de ponto de partida para a reação fosfodiéster.
A DNA polimerase vai reconhecer o grupamento hidroxila (-OH) presente no carbono 3’ da desoxirribose e realizar a ligação com o fosfato presente no carbono 5’ na desoxirribose do nucleotídeo a ser adicionado. Assim, dizemos que o DNA “cresce” no sentido 5’ para o 3’.
Com base nesses conhecimentos, o pesquisador Frederick Sanger e seus colaboradores fizeram uma alteração química nos nucleotídeos do DNA. Podemos ter quatro tipos de nucleotídeos (A, T, C, G), que também podem ser chamados de desoxinucleotídeos (dNTP), por possuírem um açúcar do tipo desoxirribose. O que ele fez foi alterar este açúcar, retirando o grupamento hidroxila (-OH), importante na ligação fosfodiéster pela DNA polimerase, e gerando os nucleotídeos chamados de dideoxinucleotídeos (ddNTP). Diferentemente dos dNTPs, os ddNTPs não possuem o grupamento hidroxila no carbono 3’ do açúcar. Nas imagens a seguir, podemos ver a diferença entre estes nucleotídeos.
Desoxinucleotídeos (dNTP).
Dideoxinucleotídeos (ddNTP).
Sequenciamento de Sanger manual
O sequenciamento de Sanger manual foi o primeiro a ser desenvolvido, utilizando como bases os princípios da composição do DNA (A, T, C, G) e a forma como é copiado/replicado. O sequenciamento de Sanger permite sequenciar pequenos pedaços de DNA, geralmente em torno de 900 nucleotídeos. A reação de sequenciamento, que vai permitir saber a ordem exata de nucleotídeos, é bem similar a uma reação de amplificação de DNA em laboratório, conhecida como reação em cadeia da polimearase (PCR).
O que vamos precisar para realizar esse sequenciamento?
1. 1
A DNA polimerase, enzima responsável pela ligação fosfodiéster para adição de novos nucleotídeos na cadeia de DNA que está sendo formada.
2. 2
Primers ou iniciadores, que são pequenos seguimentos de DNA ou RNA complementar à região a ser sequenciada, servindo de ponto de partida para a DNA polimerase atuar.
3. 3
Os desoxinucleotídeos (dNTP), nucleotídeos contendo a hidroxila livre no carbono 3’ do açúcar de cada nucleotídeo, sendo quatro deles: adenina, timina, citosina e guanina.
4. 4
Os dideoxinucleotídeos (ddNTP), nucleotídeos alterados para não ter a hidroxila livre no carbono 3’ do açúcar.
5. 5
Uma solução tampão, que é uma solução líquida que vai fornecer as condições de pH ideais para que a reação aconteça.
Inicialmente, preparamos quatro tubos, com os seguintes componentes em cada um:
Tubo 1
DNA polimerase, DNA molde, dNTPs (A, T, C e G), solução tampão, primers, ddNTP do tipo adenina.
Tubo 2
DNA polimerase, DNA molde, dNTPs (A, T, C e G), solução tampão, primers, ddNTP do tipo timina.
Tubo 3
DNA polimerase, DNA molde, dNTPs (A, T, C e G), solução tampão, primers, ddNTP do tipo citosina.
Tubo 4
DNA polimerase, DNA molde, dNTPs (A, T, C e G), solução tampão, primers, ddNTP do tipo guanina.
Os quatro tubos são, então, submetidos à variação de temperatura para que ocorra a reação de amplificação do DNA no tubo. São utilizadas três temperaturas:
Desnaturação
Anelamento
Extensão
Temperatura elevada para que o DNA dupla fita se abra e se torne fita simples. Em torno de 95°C, temperatura suficiente para quebrar as ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas.
Essas três temperaturas formam um ciclo que se repete de 25 a 35 vezes, de forma que, a cada ciclo, a DNA polimerase aumente a quantidade de DNA em cada tubo de forma exponencial, ou seja, de 2 para 4, de 4 para 16, de 16 para 256, e assim por diante.
Após a reação, o resultado é visualizado por meio de uma eletroforese em gel de poliacrilamida. A eletroforese é uma técnica de separação de moléculas com base no seu tamanho e carga. O DNA tem carga negativa e será submetido a uma voltagem para que corra no sentido positivo (cargas opostas se atraem). Ao final da corrida eletroforética, o resultado é revelado e analisado. Os fragmentos menores vão migrar/correr mais rápido no gel, pela facilidade de locomoção, do que fragmentos maiores. Assim, de acordo com cada seguimento gerado pela reação, em cada tubo, podemos montar a sequência exata de nucleotídeos do DNA de interesse.
Eletroforese para separação dos fragmentos de DNA gerados pelo sequenciamento de Sanger.
Lembra que, em cada tubo, colocamos os quatro nucleotídeos normais, dNTP, e um para cada nucleotídeo alterado, ddNTPs?
Pois bem, a DNA polimerase vai adicionar novos nucleotídeos e parar de adicionar toda vez que ela encontrar um nucleotídeo alterado (ddNTP), gerando fragmentos de determinado tamanho, que vai ser visualizado posteriormente por eletroforese. Só que a reação não vai gerar um fragmento só, com determinado tamanho, porque também temos nucleotídeos normais na reação. Assim, teremos vários fragmentos de DNA amplificado que a reação parou toda vez que adicionou um ddNTP. Após a corrida, é só observar onde cada fragmento parou e juntar todas as quatro reações como um quebra-cabeça!
Sequenciamento de Sanger automatizado
Sequenciamento manual x automatizado
Com os avanços científicos, a técnica inicial de sequenciamento de Sanger sofreu alterações para melhorar a qualidade do sequenciamento e torná-lo mais fácil. Atualmente, utilizamos o sequenciamento de Sanger automatizado. Ele surgiu por volta dos anos 1980-1990 e ajudou no sequenciamento do genoma humano.
O processo de sequenciamento é bem semelhante ao manual, utilizando a DNA polimerase, a solução tampão, os primers ou iniciadores, os quatro nucleotídeos dNTPs (A, T,C e G) e os quatro ddNTP, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP. A diferença é que cada tipo de ddNTP é associado a uma molécula fluorescente com cor diferente. Isso permite colocar todos os componentes na mesma reação, uma vez que conseguimos diferenciar pela cor emitida qual dos quatro ddNTP está sendo adicionado ao DNA pela DNA polimerase. Este processo respeita as seguintes etapas:
O único tubo com todos os componentes é submetido ao equipamento que realizará a variação de temperatura: desnaturação, anelamento e extensão, formando um ciclo que se repete em torno de 30x.
A DNA polimerase atuará adicionando novos nucleotídeos com base na cadeia molde e reconhecendo o iniciador ligado.
A ligação fosfodiéster é realizada entre o grupamento hidroxila (-OH) presente no açúcar e o fosfato do próximo nucleotídeo. Enquanto a DNA polimerase adicionar um dNTP, que possui o grupamento -OH, a reação de amplificação continua. Toda vez que a DNA polimerase adicionar um nucleotídeo alterado, ddNTP, a reação para.
Como existem muitas cópias de DNA no tubo, diversos tamanhos de DNA diferentes serão formados conforme a reação vai cessando, devido à adição de um ddNTP.
Ao final da reação, teremos de milhões a bilhões de cópias do DNA molde com comprimentos diferentes.
Na hora de obter o resultado, no sequenciamento manual, cada tubo é submetido a uma eletroforese para separação dos diferentes fragmentos, de acordo com cada ddNTP adicionado. No sequenciamento automatizado, também será realizada uma eletroforese para separação dos fragmentos gerados, porém, em um único tubo, e a eletroforese ocorre no próprio equipamento de sequenciamento, dita eletroforese capilar em gel de poliacrilamida.
A eletroforese capilar, assim como a eletroforese, tem como objetivo separar fragmentos de DNA de acordo com seu tamanho e massa. Contudo, a eletroforese ocorre em um capilar, um fio muito fino por onde o gel de poliacrilamida e o DNA vão passar. Ao final deste capilar, existe um laser (que vai excitar o DNA que está passando naquele momento) e um detector de fluorescência (após a excitação, o detector vai captar a cor do ddNTP que está sendo emitida).
O equipamento é ligado a um computador, que converterá o sinal gerado em um gráfico com picos de fluorescência, chamado de cromatograma.
O primeiro fragmento de DNA a passar é o menor fragmento e o último, o maior. Assim, se os marcadores dos ddNTPs forem adenina verde, timina vermelho, citosina azul e guanina preto, a sequência de DNA: AATGCT será lida pelo equipamento da seguinte forma: vermelho, vermelho, verde, azul, preto, verde. O computador converte esse sinal então aos nucleotídeos correspondentes TTACGA.
Sequenciamento de Sanger automatizado: leitura dos picos de fluorescência para cada ddNTP pelo equipamento.
Na imagem a seguir, demonstramos as etapas do sequenciamento de Sanger automatizado:
Representação ilustrativa do processo de sequenciamento automatizado.
Repare que a DNA polimerase adicionará nucleotídeos complementares à fita molde e o equipamento vai ler somente os ddNTPs que forem adicionados à fita nova. Por isso, o que vemos no exemplo é o DNA complementar de AATGCT, que é TTACGA.
Análise de dados
O sequenciamento de Sanger, também é chamado de sequenciamento de primeira geração, e todos os novos tipos e metodologias que vieram após o de Sanger são chamados de sequenciamentos de nova geração (NGS ‒ do inglês Next-Generation Sequencing ). Apesar das novas metodologias de sequenciamento de DNA, o método de Sanger automatizado é amplamente utilizado para sequenciar pequenos seguimentos de DNA ( <900 pb) e permite o diagnóstico de muitas doenças genéticas.
O caso mais famoso de aplicação do sequenciamento de Sanger é o da atriz internacional Angelina Jolie. Há alguns anos, a atriz retirou os seios como forma de prevenção ao câncer de mama ao descobrir que possuía cerca de 90% de chances de desenvolver este tipo de câncer. Isso só foi possível por meio do sequenciamento genético dos genes BRAC1 e BRAC2 associados a este tipo de câncer. Ao se obter a exata sequência de nucleotídeos, foram descobertas mutações (alterações no DNA) que levavam a uma alta propensão ao câncer de mama.
O sequenciamento de DNA tem sido utilizado para diagnóstico de câncer e de doenças genéticas raras que possuem tratamento. Além disso, utilizado para determinar o melhor tratamento para aquele tipo de câncer, com base nas alterações genéticas (DNA) encontradas, a chamada farmacogenética/farmacogenômica.
O que, para nós, parece uma repetição de letras (A, T, C, G) sem sentido, para as nossas células é a ordem em que se apresentam os nucleotídeos que ditam todas as características. Sabemos hoje que, se alguma ordem desses nucleotídeos está errada ou gera uma informação defeituosa, pode-se ter o surgimento de doenças. Isso torna o sequenciamento de DNA uma ferramenta de diagnóstico.
E como é feito esse processo?
É necessário realizar uma análise detalhada e comparativa do resultado, para buscar alterações que possam ter sentido em alguma doença.
Para isso, é preciso baixar o cromatograma com as quatro cores dos nucleotídeos sequenciados, observar a qualidade do sequenciamento e, com auxílio de um software, realizar a análise.
A análise inicial envolve a qualidade do sequenciamento, visto pelos picos gerados pela fluorescência emitida. Os picos com qualidade aceitável para análise envolvem picos bem definidos, uniformes e espaçados.
A sobreposição de mais de um pico pode significar um sequenciamento de baixa qualidade e a amostra precisa ser repetida.
Representação das cores dos nucleotídeos.
A comparação envolve a procura por alterações no DNA que possam significar alguma doença ou propensão a determinadas doenças. Tais alterações são chamadas de mutações. As mutações que podemos encontrar no DNA são dos seguintes tipos:
Deleção
Deleção de um ou mais nucleotídeos.
Inserção
Adição de um ou mais nucleotídeos.
Duplicação
Duplicação de uma sequência de nucleotídeo.
Translocação
Troca do tipo de nucleotídeo, A-T por C-G, ou vice-versa.
Inversão
Inversão da posição do nucleotídeo, A-T por T-A ou C-G por G-C, ou vice-versa.
Essas mutações são determinadas comparando as sequências dos pacientes com sequências de DNA de células saudáveis e seu papel determinado com base em estudos clínicos e associação com doenças.
A partir de uma quantidade cada vez maior de dados fornecidos pelos sequenciamentos e de necessidades de armazenamento e análises, um novo campo surgiu: a bioinformática.
A capacidade e a diminuição dos custos do sequenciamento têm aberto diversas novas possibilidades, inclusive de atuação profissional, sendo uma importante ferramenta aplicada para melhoramento da qualidade de vida.
Juntamente à popularização do sequenciamento de DNA, que possibilitou um melhor diagnóstico de câncer e de doenças genéticas, há também o surgimento e crescimento da farmacologia, que é a ciência que investiga os medicamentos e suas interações com os organismos. De acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), fármaco é o composto químico ativo do medicamento, obtido por extração, purificação, síntese ou semi-síntese. Com isso, existem diversos tipos de fármacos usados pela população para tratar doenças com base em exames e observações clínicas.
Quando administramos medicamentos para uma população, é comum ouvirmos que o medicamento não fez efeito, que teve efeitos colaterais, apresentaram toxicidade, alergias, ou que tiveram os sintomas tratados, com o efeito farmacológico esperado.
Existem diversos fatores que podem explicar a variabilidade individual da resposta do fármaco no nosso organismo, como a idade, fatores imunológicos, fatores patológicos, interações farmacológicas (medicamentos) e fatores genéticos.
Com o grande número de dados obtidos do sequenciamento de DNA humano, hoje, conseguimos associar os fatores genéticos aos fatores farmacológicos, o que deu origem a duas novas áreas de estudo: a farmacogenética e a farmacogenômica.
Ambas estudam a influência das variações genéticas(DNA) de um paciente sobre o tratamento com medicamentos. Isso pode determinar qual a melhor opção terapêutica e a dose com base na sua informação genética. Esse campo de estudo combina a farmacologia com a genética ou genômica para determinar a eficácia e a segurança do fármaco. No entanto, existe uma diferença básica no enfoque de cada uma destas áreas em relação aos genes:
Farmacogenética Preocupa-se em compreender a interação de um gene com o fármaco.
Farmacogenômica Preocupa-se em compreender a interação de todos os genes, o genoma, com o fármaco.
E você sabe por que é importante a compreensão dessas interações?
Resposta
Todo fármaco atua em algum alvo no nosso organismo e vai ser metabolizado por proteínas e enzimas, e todas as proteínas e enzimas vêm de uma informação genética, ou seja, a informação para tudo que somos está contida no DNA. Assim, temos a associação do fármaco com o DNA, com os genes, pois dependendo da sequência de DNA, a proteína ou enzima que interage com o fármaco pode ter mais afinidade ou menos afinidade, ou ainda, ser tóxica para aquele indivíduo.
Nem sempre uma mutação na sequência de DNA é prejudicial. São as mutações que garantem toda a diversidade que temos hoje, incluindo no metabolismo de fármacos.
O genoma humano apresenta cerca 99,9% de similaridade, o que significa que se compararmos o DNA de todos nós, ele seria 99,9% idêntico entre os indivíduos, tirando os defeitos genéticos que geram as doenças genéticas raras, claro. A maioria das diferenças do nosso de DNA se dá pela variação de um único nucleotídeo (A, T, C, G), e quando presente em pelo menos 1% da população é chamado de polimorfismo de nucleotídeo único (PNU, em inglês SNP). A presença de PNU não é anormal, nem prejudicial, pelo contrário. É esta variação que garante a diversidade de indivíduos que nós temos.
Polimorfismo de nucleotídeo único entre a população.
Os PNU acontecem no DNA de todo indivíduo, garantindo uma diversidade de formas, metabolismos, características e fenótipos. Dessa forma, se um PNU ocorre na sequência do gene que codifica uma proteína ou enzima que participa do processamento de determinado fármaco, pode haver variações no seu metabolismo.
Todo medicamento, quando administrado, deve estar dentro do intervalo terapêutico para realizar sua função, cuja concentração do fármaco deve ser relativamente constante e dentro da dose esperada na corrente sanguínea. Quando tomamos um medicamento, podemos ter as seguintes respostas com base na variação genética:
Metabolizadores rápidos
Não vão apresentar efeito farmacêutico, uma vez que o fármaco é eliminado pelo metabolismo antes de alcançar o intervalo terapêutico. Os pacientes nesta categoria não apresentam melhoras com doses convencionais do medicamento. Podem apresentar PNU e aumento da expressão da enzima/proteína que está associada ao metabolismo do fármaco.
Metabolizadores intermediários ou normais
Pacientes que não apresentam alteração no DNA, nem PNU, que aumente ou diminua o metabolismo do fármaco. Neste tipo de indivíduo, a resposta adequada é conseguida pelas doses indicadas na bula.
Metabolizadores lentos
Pacientes que apresentam PNU que diminuem a ação da proteína/enzima sobre o fármaco, levando ao seu acúmulo no organismo acima da dose terapêutica indicada. Os efeitos colaterais podem ser imediatos ou cumulativos dependendo da enzima/proteína associada. A falta de metabolização do fármaco nesses indivíduos leva ao seu acúmulo e ao surgimento dos efeitos colaterais, que podem ser graves.
A prescrição atual de medicamentos é baseada no diagnóstico, informações do paciente e possíveis efeitos colaterais do medicamento, com informação das características genéticas dos indivíduos, obtidas pelo sequenciamento de DNA. Com isso, espera-se realizar um tratamento mais específico para cada doença, evitando os efeitos colaterais.
A imagem a seguir ilustra o tipo de resposta farmacológica com base no tipo de metabolismo do indivíduo.
Ação farmacológica sobre uma população e as variabilidades de respostas encontradas de acordo com o perfil genético de cada indivíduo.
Vale ressaltar que a farmacogenética/farmacogenômica também se dedica à descoberta de novos alvos terapêuticos.
Saiba mais
Os medicamentos que mais se beneficiariam com a farmacogenética/farmacogenômica seriam os antidepressivos, fármacos para asma, diabetes, artrites, Alzheimer e câncer. Assim, o enfoque tradicional de tratamento visa o mesmo medicamento para a mesma doença em diferentes indivíduos, enquanto a medicina personalizada visa um tratamento individualizado para cada indivíduo com base no perfil genético.
Questão 1 No sequenciamento de DNA pelo método de Sanger automatizado, são usados dois tipos de nucleotídeos: deoxinucleotídeo (dNTP) e os dideoxinucleotídeo (ddNTP). Qual a diferença entre os dNTP e os ddNTP?
A Os dNTPs possuem um grupamento fosfato que está ausente nos ddNTPs.
B Os ddNTPs possuem um açúcar a mais o que não permite sua adição ao DNA pela DNA polimerase.
C Os ddNTPs possuem moléculas fluorescentes acopladas, que por si só permitem o sequenciamento de DNA.
D Os ddNTPs não possuem o grupamento hidroxila (-OH) no carbono 3’ do açúcar, o que não permite a DNA polimerase realizar a ligação fosfodiéster, gerando fragmentos de DNA de diferentes tamanhos. X
E Os dNTPs não possuem o grupamento hidroxila (-OH) no carbono 3’ do açúcar, o que não permite a DNA polimerase realizar a ligação fosfodiéster, gerando fragmentos de DNA de diferentes tamanhos.
Questão 2 Com os avanços na área de genômica e das técnicas de sequenciamento de DNA, cada vez mais genomas humanos estão sendo sequenciados e as informações sobre o DNA decifradas. Inúmeras novas áreas da ciência foram beneficiadas, entre elas a farmacogenética. Diante disso, qual a melhor definição de Farmacogenética?
A Estudo sobre a descoberta e o desenvolvimento de novas estruturas celulares para alvo de medicamentos.
B Estudo de nanopartículas para o encapsulamento de fármacos e melhoramento da sua concentração no tecido de ação.
C O uso da informação genética do paciente para se determinar qual o melhor medicamento e dose. X
D O tratamento de determinada doença com o mesmo fármaco para todos que a possuem.
E Determinar os pacientes que metabolizam o medicamento de forma mais lenta e assim evitar os efeitos colaterais.
Introdução e tipos da terapia gênica
3 Introdução à terapia gênica
Com o entendimento de como o DNA mutado leva a expressão de proteínas defeituosas, surgiu uma possibilidade de tratamento dessas doenças: a terapia gênica ou genética.
A terapia gênica visa fornecer às células do paciente o gene normal para que a proteína associada à doença volte a ser produzida e, assim, a doença será diminuída ou curada. São as tecnologias experimentais mais promissoras no tratamento de muitas doenças. Além da terapia gênica, a grande quantidade de dados genéticos (DNA) disponíveis abriu a opção de otimização do tratamento.
Apesar de toda polêmica em torno dessa terapia, a ciência tem avançado a pontos nunca imagináveis. Hoje, é possível curar um defeito genético e realizar uma terapia específica para determinada doença.
Vamos detalhar o que a Biotecnologia tem feito nesses campos de pesquisa.
Tipos de terapia genética
Somos formados por trilhões de células que se conectam, se diferenciam, se comunicam e formam o organismo. O centro de comando de cada uma dessas células está dentro do núcleo, especificamente no DNA. Todas as nossas características, bem como a função que cada célula exerce, vêm de informações que estão contidas no DNA de cada indivíduo. Se uma dessas informações é passada errada, podemos ter um gene errado ou defeituoso, que pode então gerar uma doença. Um câncer, por exemplo, surge de uma única célula que teve seu DNA alterado para genes defeituosos.
Sabendo disso, e juntando o conhecimento sobre a sequência de DNA presente em cada gene, pesquisadores de todo o mundo têm investigado formas de tornar o gene saudável novamente, fornecendo para as células sequências do gene normal.
A substituiçãode um gene defeituoso por um gene normal é chamada de terapia gênica.
As alterações no DNA podem acontecer por mutações, que geram uma proteína defeituosa, ou pela ausência do gene, que não gera a proteína. Essas alterações podem estar presentes desde o nascimento ou ser desenvolvidas ao longo da vida. A introdução de genes nas células como tratamento tem duas funções principais: substituir genes defeituosos ou adicionar genes que vão ajudar o organismo a lutar contra a doença.
A primeira etapa da terapia gênica é identificar quais os tipos de células que estão alterados. Podemos ter dois tipos de células, de acordo com a quantidade de material genético que possuem:
Células somáticas
Possuem 46 (2n) cromossomos, no caso dos seres humanos. Estão presentes nos tecidos e órgãos, exceto as células germinativas.
Celulas germinativas
Possuem metade do número de cromossomos, 23 (n). Nos seres humanos, são o espermatozoide e o óvulo, responsáveis pela formação do embrião. Ao se juntarem, formam as células somáticas, que originarão os órgãos e tecidos.
Assim, a terapia gênica pode ser dividida em terapia das células somáticas de um paciente ou terapia das células germinativas, sendo que essa última pode ser passada para as gerações futuras, enquanto as somáticas não.
A terapia gênica com células germinativas pode ser útil para eliminar doenças genéticas de uma família, porém, eticamente, menos aceita e sem o real conhecimento das consequências nas futuras gerações. Já a terapia gênica em células somáticas pode ser realizada em qualquer indivíduo, em qualquer tipo de célula, e essas alterações não são passadas para gerações futuras, sendo considerada mais segura.
Saiba mais
Por essas questões, a maior parte dos estudos e das terapias disponíveis são voltadas para as células somáticas e o efeito de curta duração, uma vez que as células tratadas morrem e são substituídas por outras células; logo, o tratamento precisa ser realizado frequentemente para se manter o efeito.
Métodos para terapia gênica
Utilizando vetores para a transferência de genes
Após a determinação da doença, o paciente pode ser tratado de duas formas:
Ex vivo
Onde as células são coletadas, tratadas com genes e depois inseridas novamente no paciente.
In vivo
Onde o tratamento com os genes ocorre dentro do organismo do paciente. As células são tratadas no paciente, com o gene de interesse sendo inserido direto no paciente.
A forma mais comum tem sido a ex vivo, na qual as células do paciente são coletadas, geralmente, são priorizadas as células-tronco daquele tecido, tratadas e inseridas por injeção no paciente.
O gene normal ou de interesse é preparado e, para ser colocado dentro da célula-alvo, é necessário ser posto em um vetor. O vetor funciona como um veículo para que o gene seja transportado/transferido para dentro da célula-alvo. Existem dois tipos de vetores: os vetores de clonagem e os vetores de transporte. Vamos conhecê-los melhor?
Vetores de clonagem
São utilizados para se inserir o gene de interesse, e são compostos também de DNA. Os mais utilizados têm sido os vetores plasmidiais. Os plasmídeos são moléculas de DNA extracromossômico circular, isolados de bactérias, que podem ser alterados para conter qualquer gene de interesse. Isso já é realizado em muitos processos da Biotecnologia. Os plasmídeos podem ser inseridos diretamente na célula-alvo ou associado a um vetor de transporte. Podemos ver este processo na imagem a seguir
Vetor de clonagem e inserção do gene de interesse no plasmídeo.
Vetores de transporte
Podem ser classificados em vetores biológicos, como os vírus, vetores químicos, como os polímeros, lipossomas e outras moléculas, e os vetores físicos, como microinjeção, bombardeamento, entre outros.
Vamos conhecer melhor os tipos de vetores de transporte:
Vetores virais
Os vírus são um dos principais vetores de transporte gênico para as células-alvo, porque ele infecta naturalmente uma célula e coloca o seu material genético para dentro. Os vírus utilizados como vetores são alterados em laboratório, seu poder de virulência é retirado, o material genético natural do vírus alterado e o gene de interesse inserido. Os vírus são então colocados em contato com a célula-alvo para que infectem e coloquem o gene de interesse para dentro da célula. Existe uma variedade de vírus desenvolvidos para esse propósito, em que os principais incluem os adenovírus e os retrovírus.
Adenovírus
São vírus de DNA dupla fita, que não inserem o DNA no DNA da célula. Ao infectar e inserir o seu DNA no núcleo da célula, esta, por sua vez, passa a produzir as informações contidas no DNA viral, mas não transfere essas informações adiante quando a célula se replica.
Retrovírus
São vírus de RNA que possuem a enzima transcriptase reversa, capaz de transformar RNA em DNA. Esse tipo de vírus é capaz de integrar esse DNA no DNA da célula hospedeira. Passando a informação adicionada para todas as células filhas.
A escolha dos vírus é realizada com base no seu poder de infecção, tamanho do gene e se a alteração é permanente ou temporária na célula.
Injeção de DNA
O DNA pode ser preparado, geralmente inserido em plasmídeos, e injetado no paciente por injeção intramuscular. Essas são as chamadas vacinas de DNA. Os plasmídeos conseguem se inserir nas células, porém, com baixa eficiência. Essa é a principal forma de terapia gênica in vivo e estudos combinam este tipo de terapia com a terapia ex vivo para aumentar a eficiência da entrega do gene e produção da proteína.
A técnica tem se mostrado simples e de fácil aplicação, porém, as células alteradas ficam restritas à região da injeção.
Microinjeção de DNA
Esta metodologia envolve a inserção do DNA de interesse direto no núcleo da célula-alvo com auxílio de uma microagulha.
Processo de microinjeção de DNA no núcleo da célula.
Imagine você inserir um pedaço de DNA direto no núcleo de uma célula; pois é, não é nada fácil. Esse processo é realizado em um equipamento denominado micromanipulador e, apesar da alta eficiência, apresenta poucas células alteradas para conter o DNA, uma vez que é feito célula por célula. Essas células são então colocadas de volta no paciente.
Polímeros catiônicos
São moléculas que possuem carga positiva. Como o DNA tem carga negativa, o DNA de interesse e os polímeros catiônicos são atraídos. Os polímeros interagem com o DNA, ajudam na compactação do DNA e na sua entrega à célula-alvo. Por possuírem carga positiva, os polímeros interagem com estruturas com carga negativa da membrana plasmática celular, facilitando a endocitose, colocando então o DNA dentro dela. Muitos polímeros têm sido desenvolvidos com estas propriedades.
Saiba mais
A nanotecnologia tem contribuído bastante para a medicina e terapia gênica pelo encapsulamento do DNA e por ajudar a guiar e direcionar o tipo de célula que o DNA deve ser entregue.
Lipossomas
São vesículas formadas espontaneamente por lipídeos. Devido à sua característica anfifílica em meio aquoso, os lipídeos tendem a “se juntar para fugir da água”, formando uma bicamada lipídica. O DNA de interesse (muitas vezes, presente no plasmídeo) é colocado na solução aquosa e, logo após, são colocados os lipídeos, que formarão a vesícula com bicamada lipídica para “fugir da água,” os chamados lipossomas, e prender tudo que está no meio.
Representação 3D da estrutura de um lipossoma.
O uso de lipossomas catiônicos (com carga positiva) também ajuda a captar o DNA com carga negativa do meio. Os lipossomas são então colocados em contato com a célula-alvo e devido às propriedades semelhantes da membrana plasmática e dos lipossomos, eles se fundem colocando o DNA dentro da célula-alvo.
Bombardeamento de partículas
O gene de interesse pode ser transferido para a célula-alvo por meio do bombardeamento, no qual o gene é associado a partículas esféricas bem pequenas de ouro ou tungstênio, que interagem com o DNA pela carga, e são lançadas em alta pressão e velocidade sobre as células-alvo, atravessando as membranas celulares. Quando o gene de interesse entra na célulado paciente, a célula começa a produzir a proteína normal por meio da sua maquinaria celular, levando ao tratamento da doença.
Atenção!
Estudos apontam que esta técnica tem menos eficiência na entrega do gene às células, pois muitas células acabam morrendo.
Agora que já conhecemos os tipos de terapia gênica, vamos a um exemplo?
Após a coleta de células tronco da medula óssea por punção, a amostra é levada para o laboratório, onde são cultivadas, crescidas em meios de cultivo específicos para estas células. O vetor contendo o gene normal ou o gene de interesse é preparado, em um plasmídeo, colocado em uma forma de entrega para as células alvo. As células captam o vetor e colocam o gene alvo para dentro e, em seguida, as células são injetadas no paciente.
Essa terapia já foi realizada como ensaio clínico em pacientes graves e tem apresentado melhor prognóstico para doenças como imunodeficiência grave, hemofilia, cegueira causada por retinite pigmentosa, leucemia e diversos tipos de câncer agressivos.
Linfócitos T, tratados por terapia gênica, para conter células carcinogênicas.
A terapia gênica possui algumas limitações, dentre as quais:
· O risco de reação imunológica contra o vetor que está sendo inserido, uma vez que pode ser reconhecido como um corpo estranho;
· O risco do gene ser inserido em células normais, não defeituosas para o gene, o que pode alterar o funcionamento destas células;
· O gene inserido pode ser colocado em lugares errados dentro do genoma da célula, o que pode levar ao desenvolvimento de câncer;
· Se esse DNA for inserido, por acidente, em células germinativas, as alterações podem ser passadas para os descendentes.
Pesquisadores tem buscado resolver tais problemas para que a terapia gênica seja feita com mais segurança e eficácia.
Edição genética
Nos últimos anos, uma nova alternativa para terapia gênica surgiu: a edição genética.
Diferente da terapia gênica, que leva à adição de um gene inteiro nas células-alvo, a edição permite alterar diretamente uma sequência de DNA na célula. Assim, a edição gênica é mais uma alternativa que permite realizar alterações nos genes ou regiões específicas do genoma com fins terapêuticos. Na edição de genes, podemos realizar modificações no genoma da célula pela deleção de sequências de DNA, inserção de DNA ou consertar um gene defeituoso.
A técnica mais utilizada para este fim tem sido o CRISPR-Cas9, ou simplesmente CRISPR, que vem do inglês Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, que traduzido significa Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas.
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Curiosidade
O CRISP foi descoberto nas bactérias, durante a análise do genoma bacteriano, em 1993. No entanto, anos depois, cientistas entenderam que o CRISP fazia parte do sistema imunológico bacteriano para defesa de material genético estranho que entrasse na bactéria (DNA ou RNA), como o de bacteriófagos, que são os vírus que infectam bactérias. Até as bactérias precisam se proteger contra seus agressores, e o CRISPR é um desses mecanismos de defesa para sobrevivência bacteriana.
O CRISPR é composto por uma endonuclease (um grupo de enzimas responsáveis por cortar/clivar/quebrar DNA que funcionam como “tesouras moleculares”, capazes de cortar DNA), mais uma sequência de RNA guia, também chamado de iniciador ou primers (semelhantes ao usado na Reação em Cadeia da Polimerase – PCR). No genoma bacteriano, foram encontrados genes para endonucleases e regiões com sequências palindrômicas repetidas que eram espaçadas com sequências de DNA complementares a bacteriófagos, daí, o nome.
Assim, quando a bactéria precisa se proteger da infecção viral, ela produz a endonuclease mais as sequências RNA-guia, complementares às do vírus. A endonuclease encontrada no CRISPR utilizado como ferramenta biotecnológica é do tipo Cas e, por isso, o CRISPR-Cas9, sendo Cas9 um tipo específico de uma endonuclease. A imagem a seguir mostra a representação do genoma bacteriano com os genes para endonucleases do tipo CAS; a sequência promotora, que promove a expressão dos genes; sequências palindrômicas repetidas (SP); e as sequências interespaçadas que são complementares a de bacteriófagos.
Sequência do sistema CRISPR encontrado no genoma bacteriano.
Mas você sabe como o sistema CRISPR funciona para a bactéria?
Resposta
Quando a bactéria é infectada por um bacteriófago, ela pode reconhecer a infecção e criar um mecanismo de memória contra este vírus, que é o CRISPR. Esse sistema é composto por uma enzima chamada de endonuclease (enzimas que cortam DNA ou RNA) e um iniciador ou primers, que ajuda a direcionar a endonuclease para sequências de material genético do vírus que está infectando. Assim, com uma endonuclease e uma sequência de RNA guia (gRNA) para direcionar a enzima para sequências complementares, a bactéria acaba cortando todo material genético que é complementar ao gRNA e se protegendo da infecção.
Como o CRISPR é usado como ferramenta de edição genética?
Em 2012, duas pesquisadoras, Emmanuelle Charpentier e Jennifer Doudna, utilizaram o sistema CRISPR como ferramenta de edição gênica, o que lhes rendeu o prêmio Nobel de química de 2020. A ferramenta é relativamente simples, comparada a outras metodologias de edição genética, barata e com boa precisão e especificidade. A ferramenta utiliza a endonuclease do tipo Cas9 associada a um RNA guia; a Cas9 é ligada ao RNA guia e só vai cortar o DNA quando o RNA guia se ligar firmemente a uma sequência que seja complementar a ele.
Emmanuelle Charpentier, pesquisadora francesa, professora e pesquisadora da Universidade de Viena.
Jennifer Doudna, pesquisadora americana, professora da Universidade da Califórnia em Berkeley.
O que tem sido feito é desenhar em laboratório um RNA guia para o gene defeituoso ou que se quer alterar e associar a Cas9. Assim, o RNA guia vai se ligar por complementariedade às bases nitrogenadas presentes no DN e quando isso acontece, a Cas9 corta o DNA, eliminando aquela sequência alterada.  A edição genética tem sido realizada para deletar genes defeituosos, consertar genes defeituosos e inserir novos genes, tudo isso com base na complementariedade das bases nitrogenadas do DNA e do RNA.
O CRISPR pode ser utilizado para edição genética de qualquer ser vivo, uma vez que o DNA é o material genético de todos.
CRISPR-Cas9 utilizado na engenharia genética para edição de genomas.
A edição genética já foi realizada em humanos, primeiro, para tratar um paciente com câncer de pulmão agressivo, onde as células foram retiradas do paciente, cultivadas em laboratórios e o CRISPR utilizado para cortar e silenciar o gene PD-1, responsável por frear a resposta imunológica contra o câncer. As células foram depois injetadas novamente no paciente, que apresentou melhoras.
O caso mais impressionante e chocante para toda a humanidade aconteceu em 2018, quando um pesquisador chinês anunciou ter editado o genoma humano de um embrião in vitro e o seu desenvolvimento, originando gêmeas. O caso teve uma enorme repercussão mundial e o pesquisador foi condenado à prisão e multa milionária, além de estar impedido de exercer a profissão. As gêmeas possuem sua identidade preservada e são acompanhadas por médicos e pesquisadores.
E por que isso aconteceu?
Durante a formação do feto, o pesquisador usou o CRISPR contra o gene CCR5. Seu objetivo era cortar um pedaço do gene para gerar uma criança imune ao HIV.
Apesar de toda a repercussão, não se tem dados suficientes para se editar um embrião humano. Os estudos são promissores, porém são necessários mais dados sobre a eficácia da edição e de possíveis efeitos colaterais. Novamente, a Biotecnologia traz junto questões sobre biossegurança e de bioética quanto ao uso de suas técnicas em seres humanos.
Curiosidade
O CRISPR tem proporcionado diversos avanços na agricultura, agropecuária, melhoramento genético de animais e plantas. Na saúde humana, tem proporcionado conhecimentos e terapias para doenças genéticas hereditárias, tratamento de doenças infecciosas, como a curapara o HIV, tratamento de diversos tipos de câncer, tratamento de diabetes, edição de RNA, entre outras possibilidades.
CRISPR-Cas9: a ferramenta de edição gênica
Neste vídeo, explicamos o funcionamento do CRISPR, sua aplicação em diversos estudos e a polêmica envolvida na utilização de células humanas.
Questão 1 Para se inserir um material genético em uma célula cujo DNA está mutado ou defeituoso, é necessário colocar o material genético normal em um vetor, que vai funcionar como veículo, para que o material genético chegue até a célula-alvo. Sobre os vetores analise as afirmativas a seguir:
I. Os vírus são um dos principais vetores de transporte gênico para a célula-alvo.
II. Os polímeros aniônicos interagem com o DNA, ajudam na sua compactação e na sua entrega à célula-alvo, sendo assim vetores de clonagem.
III. O gene de interesse pode ser transferido para a célula-alvo pelo bombardeamento, onde o gene é associado a partículas esféricas bem pequenas de ouro ou tungstênio, que interagem com o DNA pela carga, e são lançados em alta pressão e velocidade sobre as células-alvo, atravessando as membranas celulares.
IV. Recentemente, as células-tronco têm sido relatadas como um excelente vetor de transporte pela sua capacidade de autorrenovação e crescimento.
É correto o que se afirma em:
A I e II.
B I e III. X
C I e IV.
D II e III.
E III e IV.
Questão 2 Todo organismo vivo é formado por células e, dentro delas, estão as informações genéticas para o funcionamento correto de todo o organismo. Quando uma célula apresenta um defeito genético, uma opção de tratamento seria a terapia gênica. Do que se trata esse tipo de terapia?
A Determinar a sequência de DNA de genes associados ao tratamento para se determinar a melhor opção terapêutica.
B Realizar a infusão de células-tronco do paciente na área danificada pela doença.
C Realizar a correção do gene defeituoso pela adição de um gene normal ou pela edição gênica. X
D Analisar os dados genéticos do paciente e aumentar a dose do fármaco.
E Usar células-tronco embrionárias para regenerar toda a área afetada.
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