BIOLOGIA MOLECULAR UNIDADE 3

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BIOLOGIA MOLECULAR
UNIDADE 3
Inicialmente, você precisa entender que a genética forense é um ramo atual da ciência, que utiliza as técnicas moleculares para auxiliar na elucidação de crimes e outros aspectos que envolvem a Lei, como os testes de paternidade. Dessa maneira, iremos conversar sobre os aspectos da genética forense e as técnicas atualmente aplicadas para esse fim, bem como, iremos discutir sobre os aspectos da expressão e regulação gênica, importantes para o diagnóstico de diversas doenças e para o entendimento do porquê algumas pessoas ficam doentes e os aspectos envolvidos na gravidade dessas doenças. Além da genética forense e da expressão gênica, iremos debater sobre a clonagem de DNA e sobre como podemos aplicar essa técnica em prol da saúde humana. Tenho certeza de que algumas perguntas sugiram, por exemplo: como será que descobrimos a paternidade de alguém? Como uma pessoa tem um câncer mais agressivo que outras? Ou como clonaram a ovelha Dolly? 
Genética Forense
O termo genética pode ser descrito como uma ciência que busca estudar os mecanismos relacionados a transmissão de informações genéticas entre as gerações familiares, mas, quando os conceitos e técnicas da genética passam a ser utilizados para solucionar questões relativas ao Direito, o termo utilizado passa a ser genética forense. Atualmente, existem basicamente três tipos de perícias que englobam a genética forense e todas elas estão relacionadas a identificação genética de um material biológico, são elas: investigação de parentesco, criminalística e identificação individual. Podemos chamar uma investigação aplicada à genética forense de perícia, e todas as conclusões obtidas durante a investigação são descritas em um relatório pericial. Após a conclusão de um relatório, estes devem ser enviados aos seus respectivos solicitantes para que possam compor um conjunto de provas, que podem ser utilizadas durante um julgamento em tribunal. A criminalística biológica é um tipo de perícia caracterizada como o estudo dos indícios de materiais biológicos deixados no local do crime, que torna possível estabelecer a identidade do criminoso a partir da análise de compatibilidade genética. Essas amostras são coletadas na cena do crime e precisam ser, obrigatoriamente, de natureza biológica, já que o objetivo é identificar o DNA do suspeito, como todas as células nucleadas do corpo humano abrigam o mesmo tipo material genético, a possibilidade de amostras biológicas coletadas para análise aumenta (podendo ser sangue, sêmen, pelos em geral, saliva, restos de pele, entre outros).  Após a coleta da amostra (que pode ser encontrada em objetos da cena do crime, no corpo da vítima ou do suspeito, objetos pessoais pertencentes à vítima ou suspeito, na arma do crime, entre outros), o material é enviado ao laboratório, que passa a traçar o perfil genético do DNA encontrado na amostra, para investigar se esse apresenta compatibilidade com o perfil genético do suspeito. Já a perícia por investigação individual está relacionada principalmente a investigação de restos cadavéricos. Quando um corpo é encontrado em situação de decomposição ou carbonização, por exemplo, a sua identificação a partir das características físicas da vítima torna-se difícil, de forma que a avaliação de seu perfil genético é utilizada para a sua identificação. 
Mas, fique atento(a), pois a perícia por identificação individual não se restringe apenas a investigações criminais. Em casos de desastres aéreos, incêndios ou qualquer tipo de acontecimento de caráter acidental, que também prejudique a integridade física das vítimas, seus perfis genéticos também podem ser traçados com o objetivo de identificá-los.
A documentação de qualidade é essencial durante os procedimentos da perícia, visto que se trata de uma análise meticulosa e determinante para a resolução dos casos. A cadeia de custódia é um documento em que se registra toda a trajetória da amostra, o local e a forma de coleta, o coletador, a forma e o período de armazenamento e outras informações que garantam a credibilidade do laudo pericial final.  As principais técnicas de genética forense utilizadas atualmente usam polimorfismos DNA, que você já deve ter estudado anteriormente. Além disso, analisam as regiões VNTRs (variable number tandem repeat), também conhecidas como minissatélites, e as regiões STRs (short tandem repeats), também chamadas de microssatélites. Esses marcadores genéticos são encontrados em todas as células nucleadas do corpo e em todas essas células existem dois tipos de DNA, o nuclear e o mitocondrial. As diferenças entre as duas moléculas de DNA não se restringem apenas ao tamanho e a estrutura, mas, também, na forma de herança, já que o DNA mitocondrial é herdado exclusivamente das mães e o DNA nuclear é herdado dos dois progenitores e, por isso, é preferencialmente utilizado nas conclusões das análises periciais. Uma pequena parcela do genoma humano é composta por repetições tandem, ou seja, sequências de DNA que não são codificadas e que se repetem sucessivamente (VNTR e STR). Essas repetições podem ser utilizadas para diferenciar dois organismos da mesma espécie a partir da diferença do número de sequências repetidas, presentes em um par de cromossomos homólogos. Como as regiões VNTRs são maiores quando comparadas aos STRs, a sua análise torna-se mais difícil de ser interpretada, de forma que as regiões STRs (microssatélites), são as mais utilizadas para a identificação do perfil genético dos organismos de interesse. Como a maioria das regiões codificantes do DNA humano são praticamente idênticas em todos os indivíduos, essas regiões não podem ser utilizadas para uma avaliação pericial de compatibilidade genética, por isso, os STRs são as regiões de escolha para a análise, já que não são traduzidos em proteínas, então, a sua expressão não será influenciada por nenhuma patologia e a quantidade de repetições varia de indivíduo para indivíduo. As regiões STRs podem apresentar de dois a sete pares de base, sendo aqueles que possuem quatro pares de base os mais utilizados nos testes de identificação genética. Os STRs possuem alelos com tamanhos próximos e isso permite, dentre outras vantagens, a amplificação e análise de diferentes regiões do DNA, ou seja, a metodologia utilizada é a qPCR multiplex. Imaginando um cenário de análise de genética forense, os produtos obtidos após a qPCR multiplex representam sequências de tamanhos pequenos, o que também é uma vantagem, imaginando um cenário no qual o DNA, que está sendo amplificado, pertence a uma amostra degradada, como acontece em corpos carbonizados, por exemplo.
É possível resumir o fluxograma de uma perícia, a partir da seguinte sequência de atividades: a coleta da amostra no local do crime, a identificação do tipo de amostra que foi coletada, a extração e quantificação do DNA da amostra, que é feito por qPCR, à amplificação do DNA que foi extraído, a partir do uso de STRs e qPCR multiplex, a comparação dos resultados obtidos da amostra coletada com a das amostras dos suspeitos, a elaboração do laudo pericial e o envio para os seus determinados solicitantes. 
Existem outras possibilidades de técnicas, além daquelas que utilizam os STRs, como a análise do cromossomo Y, que é herdado de pai para filho e, por isso, é uma análise feita exclusivamente em indivíduos do sexo masculino. Esse tipo de análise é muito utilizado em casos de abuso sexual, em que a amostra que é coletada, na maioria dos casos, contém a mistura do DNA da vítima e do agressor. Outra possível técnica utilizada é a fenotipagem forense, que tem o objetivo de pressupor algumas características físicas do suspeito, a partir da identificação de certos tipos de genes. Esses genes são responsáveis por expressar algumas características fisionômicas, que permitem descartar alguns suspeitos que estão sendo investigados. 
Testes de paternidade 
Como já foi dito anteriormente, a técnica mais utilizada para o teste de paternidade é a que utiliza a amplificação do DNA a partir do uso de STRs.Como em muitos procedimentos da biologia molecular, o início da análise de paternidade começa com a extração do DNA de uma amostra biológica, nesse caso, as amostras da criança, da mãe e dos supostos pais. Dessa forma, a extração do DNA segue alguns procedimentos básicos, utilizados com o intuito de isolar e purificar o DNA presente na amostra. O primeiro passo é degradar as células da amostra para que o DNA, que anteriormente estava recluso ao meio intracelular, seja exposto. Esse processo é normalmente feito em um tubo específico, que possui uma membrana de retenção, que concentra o DNA após a lise das células, entretanto, esse material ainda possui contaminantes oriundos das outras estruturas celulares, como as proteínas que compõem a estrutura da membrana. O uso de detergentes, seguidos de uma etapa de centrifugação, removem esses resíduos, permitindo que, ao final da eluição do DNA, reste apenas a molécula purificada e pronta para ser utilizada. Após a etapa de extração do DNA, o produto obtido deve ser preparado para ser submetido a uma reação de PCR. Como a técnica utiliza STRs, a metodologia aplicada será a qPCR multiplex, que se baseia na amplificação de diferentes regiões do DNA, de forma simultânea, por utilizar vários pares de primers, específicos para cada região de interesse. Após o término da qPCR multiplex, os resultados da mãe e do filho devem ser comparados, com a finalidade de identificar qual o alelo da criança foi herdado da mãe, de forma que o alelo remanescente passe a ser chamado de alelo paterno obrigatório. Tanto a identificação do alelo materno, quanto do alelo do possível pai são identificados a partir da comparação entre o número de repetições STRs presentes no DNA, veja o exemplo abaixo (figura 2).
Após traçar o perfil genético da criança e dos supostos pais, é necessário fazer uma análise estatística para interpretar os resultados. Essa análise é baseada no cálculo do índice de paternidade (IP), que representa a probabilidade do suposto pai que foi analisado, seja o pai biológico da criança, em relação a probabilidade de que outro homem, pertencente a mesma raça, seja o pai biológico da criança. O cálculo se baseia na divisão da probabilidade da transmissão do alelo materno / probabilidade da transmissão do alelo paterno (referente ao suposto pai que está sendo analisado) e a probabilidade da transmissão do alelo materno / análise da frequência com que esse alelo paterno se repete em populações da mesma raça do suposto pai analisado, ou seja, a probabilidade de que outro homem seja o pai biológico da criança. É por essa razão que: os resultados dos testes de paternidades nunca podem ser expressos com 100% de compatibilidade, já que, para concretizar essa afirmação, todos os outros homens pertencentes a mesma raça deveriam ser testados também. 
Vale ressaltar que o teste de paternidade é o nome com o qual a técnica ficou popular, entretanto, a denominação correta é análise de vínculos genéticos. 
Clonagem de DNA
No inconsciente popular, o uso do termo clonagem está diretamente relacionado à criação de um organismo geneticamente idêntico a outro, como o famoso caso de clonagem da ovelha Dolly. As repercussões causadas pela criação de um organismo sem necessariamente a presença de um pai e uma mãe trouxe muita inquietação para a sociedade e incitou o imaginário para diversas possibilidades de aplicações igualmente impressionantes, que poderiam ser realizados com essa técnica (SBPC, 2001). Atualmente, pouco se conhece sobre os outros tipos de clonagem, como a terapêutica e a do DNA, que já são amplamente aplicadas em diversas áreas da biologia molecular. A metodologia que permitiu a clonagem foi proposta inicialmente pelo cientista alemão Hans Spermann em 1938, que demonstrou que o processo basicamente consistia na transferência de um núcleo integro de uma célula para um óvulo, tornando possível o seu desenvolvimento em outro organismo (SBPC, 2001).  Em 1984, uma ovelha foi produzida artificialmente a partir de células embrionárias por pesquisadores da Universidade de Cambridge. Na mesma década, cientistas conseguiram clonar uma vaca retirando células embrionárias jovens da mesma e na década seguinte, em 1995, pesquisadores do centro de reprodução na Escócia clonaram duas ovelhas com base em células embrionárias de 9 dias (SBPC, 2001). Em 1997, a mesma equipe conseguiu realizar a clonagem da ovelha Dolly a partir de células congeladas. O advento da clonagem feita a partir de células somáticas, e não mais embrionárias, tornou a clonagem da ovelha Dolly um marco no estudo dessa área da biologia molecular. As áreas relacionadas à biologia molecular apresentaram um crescimento rápido e significativo nos últimos anos. No Brasil, o único clone de que se tem registro foi em 2001: uma bezerra produzida pela Embrapa. Por outro lado, a técnica de clonagem do DNA vem sendo amplamente utilizada na agropecuária (SBPC, 2001). A possibilidade de clonagem de organismos trouxe consigo diversos questionamentos éticos que discutem as limitações do uso da técnica. Essas técnicas de biologia molecular permitiram a idealização de tecnologias de reprodução em série e um panorama em que as empresas de biotecnologia podem manipular as linhagens de animais, plantas e quem sabe humanos geneticamente modificados.  Nesse cenário, é inevitável que a ciência e a sociedade pensem e se questionem sobre quais são os limites dos avanços tecnológicos, em especial dessas técnicas, se tratando de uma discussão que vai além dos âmbitos acadêmicos e científicos. Ao Direito, por exemplo, cabe estabelecer as leis e os regulamentos que imponham limites ao uso das técnicas de engenharia genética, e também estipulem possíveis punições para quem ultrapassar esses limites (SBPC, 2001). As áreas de genética e biologia molecular estão frequentemente no foco das discussões éticas, por suas técnicas conflitarem constantemente com as percepções sobre os conceitos de vida apresentados pela sociedade, criando discursões a respeito da criação de organismos geneticamente modificados ou outros avanços envolvendo manipulação do DNA.  Particularmente, a clonagem envolve questões bem mais profundas, pois, apesar de ser uma ferramenta que nos ajuda a compreender a essência da nossa existência e proporciona tratamento para diversos tipos de doenças, podem trazer também potenciais consequências danosas para a sociedade. 
As discussões e as preocupações sobre esse tema levaram à elaboração de um protocolo para a proibição de clonagem humana, denominado de “Protocolo in Prohibition of Cloning Human Beings”, como parte da Convenção Europeia sobre direitos humanos e biomedicina, assinado por 19 países membros do COE (Couincil of Europe) que se comprometeram a proibir, por lei, qualquer procedimento que envolva a clonagem de seres humanos. Por outro lado, outras técnicas de clonagem já são utilizadas com grande eficácia em outros campos, como a clonagem terapêutica, por exemplo, que visa formar células saudáveis para que elas possam substituir possíveis tecidos danificados, sendo uma das grandes expectativas desse processo a substituição de tecido medular lesado em casos de paralisia, seja paraplegia ou tetraplegia. Essa técnica da medicina, contudo, esbarra novamente em questões morais e éticas na medida em que sua eficácia está intimamente ligada ao uso de células tronco embrionárias retiradas de embriões descartados por clínicas de fertilização.  As discussões em torno desse tema ainda não chegaram a uma conclusão, mas o uso de células tronco retiradas de embriões é proibido no mundo inteiro. Pesquisadores utilizam outros tipos de células tronco contidas em tecido adultos, mas que não demonstram a mesma eficácia. 
Um exemplo já bem difundido é o uso de células tronco da medula para o tratamento de leucemias, na qual são retiradas células da medula de um doador e aplicadas em um receptor compatível, promovendo a diferenciação em novas células medulares. (SILVA, 2020).
Outra forma de clonagem é a de DNA. Esse tipo de clonagemnão tem relação com a reprodutiva ou a terapêutica e já é bem utilizada e estabelecida em alguns ramos da indústria ou medicina, porém, ainda fomenta muitas dúvidas em relação as possíveis consequências futuras. Em um contexto de frequente avanço da genômica, ou seja, da manipulação dos genes, especialmente para a criação de organismos geneticamente modificados (OGM) ou transgênicos, as discussões buscam conscientizar a sociedade sobre a ética em se produzir OGM’s em larga escala e sobre a segurança na transferência ou manipulação de genes em organismos vivos.
De acordo com Rubio (2012), os questionamentos éticos sobre o uso massivo de OGM’s existem e estão relacionados a alguns tópicos, como por exemplo:
-  Os OGM’s causam perda massiva da biodiversidade, até que ponto isso levaria a extinção de algumas diversidades vegetais no futuro;
-  Como remediar os impactos socioeconômicos, culturais e sociais, gerados pela introdução dos OGM’s em larga escala, nas comunidades camponesas, ribeirinhas e indígenas;
-  Como evitar que a contaminação de sementes contribua para a formação de monopólios por empresas que produzam sementes transgênicas patenteadas.
O processo de clonagem e recombinação gênica 
Existem basicamente duas formas de se caracterizar o termo “clonagem de DNA”, uma delas é a produção de cópias idênticas de um segmento específico de uma molécula de DNA, a outra está associada ao isolamento de um gene específico de interesse. É possível realizar a clonagem de uma molécula de DNA a partir de duas técnicas distintas, a reação em cadeia da polimerase (PCR) combinada a eletroforese é um procedimento utilizado quando o interesse da clonagem é apenas para a conferência da presença ou ausência de um gene específico na amostra, enquanto o uso de vetores plasmidiais é uma técnica de clonagem que se propõe a avaliar a produção de proteínas.  Para entender o conceito e as diferenças entre os processos de clonagem de DNA e de DNA complementar, é preciso relembrar alguns conceitos estruturais da molécula. As moléculas de DNA são formadas por éxons, caracterizadas como regiões codificantes, ou seja, participam do processo de transcrição e tradução do DNA, e os íntrons, que são as regiões não codificantes, que também participam do processo de transcrição da molécula, mas não são traduzidas em proteínas. Para diferenciar as duas metodologias, também é importante lembrar que o produto da transcrição de uma molécula de DNA são moléculas de RNA mensageiro (RNAm), que apresentam as informações genéticas contidas no DNA e são responsáveis por conduzir as etapas da síntese de proteínas específicas. As principais diferenças entre a clonagem de DNA e a clonagem de DNA complementar é que na primeira toda a molécula de DNA é clonada, não existindo distinção entre as regiões que compõe a molécula, ou seja, tanto os éxons quanto os íntrons são clonados nesse método, de forma que as proteínas que serão produzidas a partir da tradução desse gene podem apresentar proporções diferentes. Em contrapartida, a clonagem de DNA complementar utiliza uma molécula de RNAm para realizar a clonagem. Assim, o RNAm sofre a ação da transcriptase reversa e da DNA polimerase, permitindo a produção de cópias de DNA que se restringem as regiões codificantes, ou seja, apenas os éxons são clonados nesse método. Além disso, a concentração de proteínas traduzidas é diretamente proporcional a quantidade de RNAm que foi utilizada no procedimento.  Dessa forma, existem basicamente duas metodologias utilizadas no processo de clonagem do DNA e a escolha de qual delas utilizar depende do objetivo a ser alcançado com a clonagem. Quando a finalidade da clonagem se resume em observar a presença ou a ausência de um gene específico de interesse, a metodologia de escolha é a combinação de duas técnicas já estudadas, que seria primeiramente, a produção de cópias de DNA através da técnica de PCR (reação em cadeia da polimerase), para posterior revelação através da eletroforese em gel de agarose, interpretada a partir do padrão de bandas de migração formadas no gel. Vamos recapitular alguns conceitos já estudados sobre PCR e eletroforese, para entender a sua aplicabilidade nos processos de clonagem. Os reagentes e o equipamento utilizados na PCR buscam mimetizar a síntese de DNA que ocorre naturalmente no interior das células. O termociclador é o equipamento utilizado nas reações de PCR, por proporcionar um ciclo de variação de temperaturas, que controlam as etapas do procedimento, dividindo-as em três fases principais, a desnaturação (96°C), que permite a separação da dupla fita de DNA em duas fitas moldes simples, o anelamento (55 – 65°C), que permite a ligação dos primers a fita molde, e, por fim, a etapa de extensão (72°C), que é caracterizada por um leve aumento de temperatura em relação a etapa anterior, permitindo o início da ação da Taq polimerase, que estende os primers, produzindo as novas fitas de DNA. 
Os reagentes utilizados no processo da PCR atuam a partir da continuidade da variação de temperatura de cada ciclo, dentre eles podemos citar resumidamente os primers, representados como uma pequena sequência de nucleotídeos complementares as sequências presentes nas extremidades de cada fita molde simples, atuando como um iniciador da reação. 
Também são adicionados a reação os nucleotídeos (A, T, C e G), que serão inseridos na fita molde pela Taq polimerase, caracterizando a fase de extensão. Após o término da PCR, o produto obtido é normalmente avaliado através da eletroforese em gel de agarose, que utiliza uma corrente elétrica e uma matriz em gel para separar os fragmentos de DNA a partir do seu tamanho.
 Os fragmentos que possuem o mesmo tamanho são agrupados no gel, formando uma banda de migração, que pode ser visualizada a olho nu, mas esse processo é facilitado pela adição de pigmentos com afinidade ao DNA. A formação das bandas de migração no gel é o padrão que deve ser observado para validar os resultados da PCR.  A outra metodologia de clonagem envolve a utilização de moléculas de DNA extra cromossomal, normalmente encontradas em bactérias, que são chamados de plasmídeos. 
Os plasmídeos se caracterizam como moléculas de DNA de dupla fita, mas que apresentam uma conformação circular e que podem ser transferidos entre bactérias. Por também apresentar a capacidade de autorreplicação, é a principal metodologia utilizada para fins de estudo biotecnológicos de produção e função das proteínas de interesse. A primeira etapa da clonagem de DNA por vetores plasmidiais é a inserção do gene de interesse na molécula do plasmídeo, que deve ser feito mediante a atividade de enzimas de restrição.
 Como já vimos anteriormente, enzimas de restrição são naturalmente produzidas por bactérias, com o intuito de protegê-las contra a infecção de vírus bacteriófagos, mas que possuem aplicabilidade biotecnológica, devido a sua capacidade de reconhecer e clivar uma determinada sequência de DNA.  
Após a clivagem, o fragmento de DNA cortado pode apresentar dois tipos de conformação diferenciados a partir das características de suas extremidades. Os fragmentos de extremidades cegas, apesar de apresentarem a capacidade de se ligar a outras extremidades cegas, não são capazes de gerar pontes de hidrogênio entre si, já que não existe complementariedade de bases. 
Em contrapartida, as extremidades coesivas são capazes de gerar pontes de hidrogênio, já que a sua ligação é estabelecida por complementariedade de bases, por isso, são mais específicas e utilizadas do que as extremidades cegas, pois permitem um maior controle de ligação do gene ao plasmídeo.  
A DNA ligase é a enzima que conduz a próxima etapa da clonagem, ao desempenhar a mesma função que naturalmente exerce no interior das células, promover a ligação entre fragmentos de DNA, através da formação de ligações fosfodiéster, que promovem a união dos nucleotídeos.
 Quando aplicadas nos ensaios de clonagem, a DNA ligase é responsável por unir as extremidades do gene, que foi clivado pelas enzimas de restrição,a estrutura molecular dos plasmídeos, gerando uma molécula de DNA recombinante (plasmídeo + gene de interesse). Observe o esquema abaixo que relata esse processo (Figura 4)
A próxima etapa, após a formação da molécula de DNA recombinante, é a sua inserção em células bacterianas, num processo chamado de transformação. Existem basicamente duas formas para alcançar a transformação, mas ambas promovem a desestabilização da membrana das bactérias, tornando-as mais susceptíveis a entrada do DNA recombinante. A primeira forma é o uso de eletroporação, que consiste na indução de pulsos de carga elétrica, criando poros na membrana das células. E a segunda forma utiliza o choque térmico, ao submeter as bactérias a altas temperaturas, seguido de um processo de resfriamento.  Apesar do uso das técnicas de transformação, nem todas as bactérias passam a ser portadoras dos novos plasmídeos, seja por falha na ligação ou falha no próprio processo de transformação, assim, para garantir que apenas as bactérias portadoras passem para a próxima etapa, é necessário iniciar a fase de seleção bacteriana. Normalmente, os plasmídeos que são inseridos, além de conter o gene de interesse, também possuem um gene de resistência a um antibiótico específico, de forma que a cultura dessas cepas bacterianas deva ser feita em um meio de cultura que possua esse antibiótico em sua composição. Caso a bactéria não seja portadora do plasmídeo, ela não irá conseguir se desenvolver no meio de cultura, diferente das bactérias portadoras, que crescem e formam colônias. Algumas colônias bacterianas podem sobreviver ao crescimento por apresentarem o plasmídeo de resistência, mas não necessariamente possuir o gene de interesse, já que existe a possibilidade de falha na inserção plasmidial. Para confirmar se as bactérias sobreviventes possuem o gene de interesse, além do gene de resistência, deve-se coletar o DNA das bactérias das colônias que foram geradas, submetê-los a um processo de PCR, seguido pela revelação em eletroforese em gel de agarose.  As bactérias selecionadas são nutridas em grandes meios de cultura, induzidas a proliferação, seguida de uma indução, através de sinais químicos, a codificação e produção da proteína de interesse, que é posteriormente purificada (figura 5). Essa técnica é amplamente utilizada atualmente para a produção de biofármacos, como a insulina utilizada no tratamento de diabéticos insulinodependentes. 
Expressão Gênica
Sabe-se que o DNA é o código utilizado para codificar e produzir qualquer molécula, de RNA ou proteína, que a célula irá precisar para desempenhar funções básicas fundamentais. Por essa razão, entender de que maneira esse código é decifrado para construir essas proteínas complexas é fundamental para compreender o funcionamento da célula e, consequentemente, do organismo como um todo. O campo de estudos que busca entender e explicar de que forma isso acontece é o da expressão gênica, que analisa as formas como alguns genes podem ser ativados ou inativados, seletivamente, para produzir proteínas que serão destinadas à cumprir funções fisiológicas específicas. Um dos fatores utilizado para estudar esse mecanismo de expressão dos genes é a diferenciação das células (ALBERTS, 2011). Hoje se sabe que as células, independentemente do tipo, contêm os mesmos genes, demonstrando que o processo de diferenciação, que acontece no período embrionário, é resultado das mudanças na expressão gênica das células. Por isso, conhecer os mecanismos que controlam esse processo tornaria possível a reconstrução de um organismo, a diferenciação de células e outras inúmeras aplicações possíveis. Atualmente, existem mais de duzentos tipos celulares descritos, espalhados pelo organismo, cada um com a sua função especializada.
Como exemplos, possuímos células específicas para a produção de hormônios, como as células β do pâncreas que produzem insulina, os linfócitos B especializados na produção de anticorpos, as hemácias que compõe a maior parte da constituição celular do sangue, capazes de produzir proteínas que podem transportar o oxigênio, a hemoglobina, entre outras. A diferença fundamental entre elas é somente quais genes dessas células estão ativados e quais estão inativados, dentre o genoma total contido em todas elas (ALBERTS, 2011).
Especialmente para os organismos multicelulares, é muito importante saber quais genes estão expressos ou não, já que muitos tipos celulares serão formados, gerando, consequentemente, diferentes tipos de tecidos e órgãos. É fundamental que essa diferenciação ocorra de forma eficaz e, por isso, faz-se necessário que a célula produza diferentes sequências de RNA, que serão utilizadas no processo de tradução de proteínas, regulado por um conjunto de genes específicos, que encontram-se expressos naquele momento (ALBERTS, 2011). É importante ressaltar que as diferentes expressões dos genes não estão relacionadas a mudanças na sequência de nucleotídeos no DNA. De fato, todas as células, seja qual for a sua morfologia ou função, vão apresentar o mesmo genoma. Essa evidência já foi demonstrada através de experimentos em que retirou-se o núcleo de uma célula de pele de uma rã adulta e transplantaram para um ovo de rã sem o núcleo. Dessa forma, foi observado que o ovo se desenvolveu normalmente mostrando que nenhuma sequência fundamental do DNA havia sido perdida, caso contrário, o organismo não conseguiria se desenvolver completamente. Esses experimentos só demonstraram que a diferenciação celular não está ligada a diferença nos genes, ou seja, nas sequências do DNA, mas sim na expressão diferente desses genes em cada grupo de células (ALBERTS, 2011). Uma das práticas para se evidenciar como cada tipo celular produz conjuntos distintos de proteínas é a técnica de separação de moléculas denominada de eletroforese. Através dessa técnica, é possível comparar a composição proteica de diferentes células como neurônios, hepatócitos ou outras. O objetivo desse tipo de estudo está no rastreio de diferentes tipos de expressões gênicas, mostrando que existem muitas proteínas comuns a todas as células que são fundamentais para os processos básicos do metabolismo da célula. Proteínas como RNA-polimerase, enzimas relacionadas à glicólise, proteínas que formam o citoesqueleto, proteínas dos ribossomos ou de reparo celular estão presentes em todos os tipos celulares. Contudo, existem proteínas altamente especializadas que estão relacionadas as diferentes características de cada célula. Muitas são raras e só podem ser identificadas através de técnicas sensíveis e específicas, como a espectrometria de massas ou através do monitoramento das sequências de RNAm que codificam essas proteínas.  A avalição de diferentes sequências de RNAm mostrou que um célula diferenciada apresenta uma média de 5.000 a 15.000 genes expressos, apesar de apresentar um total de 25.000 genes. Esses dados comprovam que a expressão de um conjunto de genes diferentes em cada tipo de célula é o que causa as grandes variações observadas em cada uma delas, principalmente quanto a funcionalidade e morfologia. 
Em suma, a expressão gênica é um processo pelo qual a informação contida nos genes, ou seja, na sequência de nucleotídeos, é revertida ou traduzida em moléculas que determinam as propriedades distintas das células. A expressão de um gene envolve um conjunto de etapas que vão desde a transcrição, ou seja, síntese da molécula de RNA, até a tradução, que é a conversão desse RNA em uma proteína de fato, todo esse processo foi denominado de “dogma central” (BIOREDE, 2020).
Regulação Gênica
A regulação gênica pode ser definida como um conjunto de mecanismos utilizados pelas células, para controlar quais serão os genes, dentre os diversos presentes no seu material genético, que serão expressos conforme as suas necessidades. Um grupo de células podem se diferenciar após receber o mesmo tipo de estímulo, mas após a fase de diferenciação, dependendo de condições internas ou externas, essas células podem apresentar variações nasua expressão gênica, ou seja, podem produzir proteínas de proporções e funcionalidades diferentes, conforme a sua necessidade. As diferenças entre os padrões de expressão gênica são o que cria diferentes grupos celulares, que são especializadas em desempenhar um papel diferente no organismo (figura 6).
Pensando assim, todas as células possuem o mesmo material genético, sua diferença funcional depende de quais genes estão ativos ou inativos. 
Por exemplo, as células beta pancreáticas possuem como função principal a produção do hormônio insulina, envolvido no controle glicêmico, enquanto as células hepáticas removem as possíveis toxinas presentes na corrente sanguínea. Apesar de apresentar funções diferentes, ambas as células comportam o mesmo material genético em seus núcleos, entretanto, os genes que favorecem a tradução de insulina estão ativos nas células pancreáticas e inativos nas células hepáticas, caracterizando a expressão gênica como um modulador de diferenciação e função celular.
As células comportam mecanismos de controle e autorregulação, que atuam em diferentes pontos do processo de transcrição e tradução, alterando quantitativamente e qualitativamente as proteínas produzidas, conforme as necessidades do organismo.
Fatores de Transcrição
A transcrição dos genes é o processo em que uma determinada sequência de DNA é convertida em uma molécula de RNA, que futuramente será traduzida em uma proteína específica. Por isso, a etapa de transcrição é um dos principais pontos de controle da expressão gênica, já que caso um gene não seja transcrito, ele também não poderá ser traduzido e as proteínas não serão produzidas. Existem diversos mecanismos de controle nessa etapa do dogma central, mas, no geral, um gene possui duas regiões de controle de transcrição, a região promotora e o sítio de iniciação, que são respectivamente o local onde a RNA polimerase e a síntese do RNA propriamente dita se iniciam.  Além dessas regiões, as células possuem um conjunto de proteínas, chamadas de fatores de transcrição, que atuam regulando a expressão gênica. Um fator de transcrição pode se unir a sequência alvo do DNA e atuar como ativador ou repressor da transcrição, ao facilitar ou dificultar a ligação da RNA polimerase ao gene. Um dos principais facilitadores da transcrição é chamado de enhancer, que é caracterizado como uma sequência de DNA que atua aumentando a afinidade das proteínas, que participam da transcrição, por uma sequência promotora. O mecanismo de ação de um enhancer é promover uma curvatura na estrutura molecular do DNA, facilitando o acesso das proteínas de transcrição a uma região promotora específica (figura 7).
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja:
- Enhancers = acentuadores.
- Activator proteins = proteínas ativadoras.
- Other transcriptions factors proteins = outros      fatores transcricionais proteicos.
- Promoter = promotora.
- RNA polymerase = RNA polimerase.
- Methyl groups = grupo metil.
- CTCF (CCCTC - fatores de ligação).
- Insulator = mantém em inglês.
O TATA box é uma das principais sequências promotoras do DNA e é utilizada como a sequência de reconhecimento de um fator de transcrição chamado TFIID (Transcription Factor IID). Um dos principais componentes desse fator de transcrição é a sua subunidade TBP (TATA Binding Protein), que, como o próprio nome sugere, é responsável por promover a ligação do TFIID ao TATA box. Completada a fase de ligação, o TFIID passa a recrutar outros fatores de transcrição, que juntos formam um complexo de transcrição, responsável por facilitar e garantir a ligação da RNA polimerase a sequência de DNA.
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja:
- Start transcription = início da sinalização para       a  transcrição.
- RNA polymerase II = RNA polimerase II.
- Protein kinase (TFIIH) activity = atividade da          proteína quinase (TFIIH).
- Transcription begins = início da transcrição.
Controle da expressão pós-transcricional 
Após a conclusão do processo de transcrição da molécula de DNA, o transcrito primário ainda não pode ser considerado uma molécula de RNA mensageiro completa, por isso, é chamada inicialmente de pré-RNA. Para concluir o processo de maturação em RNAm, a molécula passa por algumas etapas, como a adição da cap 5’ e cauda poli-A, e o processo de splicing. Como já foi visto, esses processos tornam a molécula de RNAm apta para sair do núcleo e ser traduzida em uma proteína específica. Para relembrarmos, o cap 5’ é uma guanina modificada, que é adicionada ao nucleotídeo inicial da estrutura do RNA, enquanto a cauda poli-A é caracterizada como uma sequência de adeninas, que são adicionadas ao último nucleotídeo do RNA, ambas as estruturas apresentam funções auxiliares ao transporte citoplasmático e proteção da molécula de RNA. Um terceiro processo é necessário para a conclusão do processo maturativo, o splicing de RNA. Essa etapa é mediada pela ação de proteínas chamadas spliceossomos, que possuem a função de retirar os íntrons da sequência de RNA, ou seja, apenas as sequências codificantes (éxons) permanecem na estrutura da molécula. Todas as etapas citadas são procedimentos que ocorrem após a transcrição do DNA e são susceptíveis a mecanismos de regulação, com o intuito de controlar a expressão gênica. Outra forma de regulação da expressão pós-transcricional é o uso de microRNAs (miRNAs), que são sequências de RNA reguladoras que também são transcritas no núcleo, através da atividade da RNA polimerase II, e sofrem um processo de maturação no citoplasma. Os transcritos primários dos miRNAs, chamados de pri-miRNAs, são formados basicamente por duas regiões, a “stem”, em que os dois segmentos de RNA possuem pareamento de bases e por isso formam uma estrutura linear, e a região “loop”, que por não apresentar pareamento forma alças circulares em sua estrutura. Durante o processo de maturação, a região circular é removida e a estrutura restante do RNA é incorporada a um complexo proteico, chamado de complexo silenciador induzido por RNA (RISC). Esse complexo atua na regulação da expressão gênica, o seu mecanismo de ação depende diretamente da compatibilidade entre as bases desse complexo com a molécula alvo (RNAm), podendo exercer dois tipos de atividades diferentes. Caso a complementariedade entre as moléculas seja perfeita, o complexo irá promover a degradação da molécula de RNAm, já nos casos em que a complementariedade é parcial, o complexo se liga a molécula de RNAm, mesmo que de forma incompleta, e impede que ela seja traduzida. Observe a figura 9, a qual esquematiza o processo de controle transcricional.
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja:
- Transcription = transcrição.
- RNA polymerase II = RNA polimerase II.
- Cleavage = clivagem.
- Export & cleavage = Exportação e clivagem.
- mRNA degradation = degradação do mRNA.
- Near-perfect complementation = não tem            tradução, pode deixar em inglês e em itálico.
- RISC complex = Complexo RISC.
Após a leitura do nosso material, você pôde perceber que a genética forense utiliza diversas técnicas para a elucidação dos crimes, podendo utilizar metodologias de identificação de cromossomos Y. Entretanto, a mais utilizada é a análise do STR, que se refere a regiões de repetição do DNA que podem ser transmitidas através da herança genética, ou seja, herdamos dos nossos pais de acordo com o alelo do gene transmitido. 
É importante lembrar que um alelo terá herança materna e o outro uma herança paterna e, por esse motivo, a análise genética tem um nível de confiança muito alto ao afirmar a paternidade ou maternidade de um indivíduo.
Outro ponto que abordamos e discutimos foi sobre os aspectos transcricionais e regulatórios de um gene, sendo esse um processo importante e que qualquer alteração pode gerar proteínas anômalas que poderão desencadear um desequilíbrio na célula ou até mesmo uma patologia. 
Você pôde entender que, atravésdo estudo desses aspectos genéticos, é possível verificar o nível de expressão de um gene e associar a gravidade de uma doença, seja ela adquirida ou uma doença genética sem cura.