4-PCR

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<p>Reação em Cadeia da</p><p>Polimerase (PCR)</p><p>Profa. Dra. Mariana Feijó</p><p>❀Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)</p><p>Polymerase Chain Reaction (PCR)</p><p>Método para a amplificação seletiva de sequências de DNA a partir de amostras</p><p>puras ou complexas contendo ácidos nucleicos (DNA ou RNA)</p><p>h"ps://facellitate.com/a-brief-introduc7on-to-polymerase-chain-reac7on-pcr/</p><p>❀Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)</p><p>h"ps://eaulas.usp.br/portal/video.ac7on?idItem=26400</p><p>❀Desnaturação do DNA</p><p>✴DNA pode ser desnaturado por variação de pH e</p><p>aquecimento;</p><p>✴Tm (melting): ponto de fusão (temperatura na qual</p><p>metade do DNA está desnaturado)</p><p>✴Quanto maior conteúdo G-C, maior a temperatura</p><p>de desnaturação. Nelson,	D.	L.;	Cox,	M.	M.	Princípios	de	Bioquímica	de	Lehninger.	6	ed.	Porto	Alegre	:	Artmed.	2014.</p><p>❀Desnaturação do DNA</p><p>✴DNA desnaturado pelo aquecimento pode renaturar.</p><p>✴Com a diminuição da temperatura, as fitas podem re-hibridizar.</p><p>❀DNA polimerase</p><p>✴DNA polimerase sintetiza novas cópias</p><p>complementares ao DNA molde na região alvo.</p><p>✴Necessita de condições ideais (temperatura, pH,</p><p>Mg2+).</p><p>✴Substrato: dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).</p><p>✴Síntese no sentido 5’-3’.</p><p>✴Necessita de primer (iniciador)</p><p>https://nebula.org/blog/pt-br/dna-polimerase/</p><p>❀DNA polimerase - Taq polimerase</p><p>✴DNA polimerase da bactéria Thermus aquaticus.</p><p>✴Bactéria que vive em fontes termais.</p><p>✴Taq DNA polimerase é resistente a altas temperaturas.</p><p>❀Primer (iniciador)</p><p>✴Sequência de oligonucleotídeos específicas para a região alvo e conhecidas (18 - 24 bases)</p><p>✴Delimitam o início e o final da sequência a ser amplificada</p><p>✴Um primer para cada fita do DNA</p><p>✴Os primers não devem ser complementares</p><p>✴Tm semelhante entre o primer 1 e 2 (55 a 65ºC)</p><p>✴Conteúdo GC 40 a 60%</p><p>✴Atuam como iniciadores para a DNA polimerase realizar a replicação</p><p>❀Primer (iniciador)</p><p>✴Primer 1: complementar à extremidade 3’ de uma fita (extremidade 3’-OH livre)</p><p>✴Primer 2: complementar à extremidade 3’ da outra fita (extremidade 3’-OH livre)</p><p>✴DNA polimerase: extensão do primer sentido 5’ - 3’</p><p>Anelamento</p><p>dos primers</p><p>❀ Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)</p><p>✦Para realizar PCR é necessário:</p><p>✴DNA extraído de células, tecidos, microrganismos, sangue…</p><p>✴Par de primers que delimitam a sequência alvo</p><p>✴Desoxirribonucleotídeos (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)</p><p>✴DNA polimerase (Taq polimerase)</p><p>✴Íons e tampão</p><p>h"ps://www.bosterbio.com/protocol-and-troubleshoo7ng/pcr-principle</p><p>❀ Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) - ocorre em ciclos sucessivos</p><p>1ª etapa: Desnaturação</p><p>aquecimento a 94 - 96ºC para</p><p>separar a dupla fita do DNA</p><p>molde</p><p>2ª etapa: Anelamento</p><p>pareamento dos primers</p><p>no DNA molde</p><p>3ª etapa: Alongamento</p><p>DNA polimerase alonga</p><p>as fitas complementares</p><p>a partir dos primers</p><p>❀ Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) - ocorre em ciclos sucessivos</p><p>Alberts,	B.	et	al.	Biologia	Molecular	da	Célula.	6	ed.	Porto	Alegre:	Artmed,	2017.</p><p>❀ Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) - ocorre em ciclos sucessivos</p><p>Alberts,	B.	et	al.	Biologia	Molecular	da	Célula.	6	ed.	Porto	Alegre:	Artmed,	2017.</p><p>❀ Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) - ocorre em ciclos sucessivos</p><p>h"ps://www.priyamstudycentre.com/2024/01/polymerase-chain-reac7on-pcr.html</p><p>❀ Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) - ocorre em ciclos sucessivos</p><p>55 - 65ºC</p><p>~5ºC < Tm dos</p><p>primers</p><p>❀ Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) - ocorre em ciclos sucessivos</p><p>❀ Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) - ocorre em ciclos sucessivos</p><p>❀ Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) - ocorre em ciclos sucessivos</p><p>Amplicon: fragmentos de</p><p>DNA dupla fita</p><p>amplificados na PCR</p><p>Amplificação na PCR é</p><p>exponencial</p><p>A quantidade de</p><p>produto depende do</p><p>número de cópias de</p><p>DNA molde inicial</p><p>h"ps://dnalc.cshl.edu/resources/anima7ons/pcr.html</p><p>❀ Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) - ocorre em ciclos sucessivos</p><p>✴Ciclos da PCR são realizados no termociclador</p><p>✴Placas ou microtubos</p><p>❀ Análise do produto amplificado</p><p>✴Eletroforese em gel de agarose</p><p>Visualização do DNA</p><p>corado com brometo de</p><p>etídio em luz UV</p><p>Imagem do gel</p><p>mostrando os produtos</p><p>da PCR</p><p>h"ps://www.researchgate.net/figure/Figura-3Eletroforese-em-gel-de-</p><p>agarose-a-2-do-amplicon-da-PCR-especie-especifica-para_fig2_268688267</p><p>h"ps://blog.forlabexpress.com.br/corante-nao-mutagenico/</p><p>❀ PCR em tempo real (Real-Time PCR) ou PCR quantitativa (qPCR)</p><p>✴Detecção de amplicons em tempo real, utilizando corante fluorescente</p><p>(ex.: Sybr Green)</p><p>✴Sybr Green liga na dupla fita. A</p><p>medida que o DNA é</p><p>amplificado, acumulam-se</p><p>fragmentos de dupla fita e a</p><p>fluorescência aumenta.</p><p>✴A fluorescência é proporcional à</p><p>quantidade de amplicons.</p><p>h"ps://www.researchgate.net/publica7on/339117210_Digital_PCR_as_an_Emerging_Tool_for_Monitoring_of_Microbial_Biodegrada7on</p><p>❀ PCR em tempo real (Real-Time PCR) ou PCR quantitativa (qPCR)</p><p>✴A fluorescência é proporcional à quantidade</p><p>de amplicons.</p><p>Cycle threshold (CT): nº de</p><p>ciclos em que a fluorescência</p><p>ultrapassa o limite de</p><p>fluorescência basal</p><p>(threshold)</p><p>h"ps://eaulas.usp.br/portal/video.ac7on?idItem=26400</p><p>Nelson,	D.	L.;	Cox,	M.	M.	Princípios	de	Bioquímica	de	Lehninger.	6	ed.	Porto	Alegre	:	Artmed.	2014.</p><p>❀ PCR em tempo real (Real-Time PCR) ou PCR quantitativa (qPCR)</p><p>✴A fluorescência é proporcional à quantidade de amplicons.</p><p>h"ps://www.igenomix.com.br/blog/o-que-e-a-tecnica-de-rt-qpcr-para-deteccao-dos-casos-de-covid-19/</p><p>❀ PCR em tempo real (Real-Time PCR) ou PCR quantitativa (qPCR)</p><p>✴A fluorescência é proporcional à quantidade de amplicons.</p><p>❀ RT-PCR: PCR precedido por transcrição reversa</p><p>✴Transcriptase reversa</p><p>Alberts,	B.	et	al.	Biologia	Molecular	da	Célula.	6	ed.	Porto	Alegre:	Artmed,	2017.</p><p>❀ RT-PCR: PCR precedido por transcrição reversa</p><p>✴Quando o RNA for amplificado</p><p>✴Transcriptase reversa sintetiza DNA complementar (cDNA) utilizando</p><p>RNA como molde</p><p>✴Utilizado para avaliação da expressão gênica, variantes de transcritos,</p><p>geração de cDNA para clonagem e sequenciamento.</p><p>❀ RT-PCR: PCR precedido por transcrição reversa</p><p>h"ps://eaulas.usp.br/portal/video.ac7on?idItem=26400</p><p>❀ RT-PCR: PCR precedido por transcrição reversa</p><p>h"ps://microbenotes.com/rt-pcr-defini7on-principle-enzymes-types-steps-uses/</p><p>❀ Aplicações para a reação em cadeia da polimerase</p><p>✴Diagnóstico de infeções</p><p>✴Diagnóstico de doenças genéticas</p><p>✴Diagnóstico e prognóstico de câncer</p><p>✴Teste de paternidade</p><p>✴Análise filogenética</p><p>✴Arqueologia</p><p>✴Tecnologia de DNA recombinante</p><p>✴Análise forense</p><p>✴Expressão gênica</p><p>✴Adulteração em alimentos</p><p>✴Identificação de espécies</p><p>❀ Referências bibliográficas</p><p>Alberts, B. et al. Biologia Molecular da Célula. 6 ed. Porto Alegre: Artmed, 2017.</p><p>Nelson, D. L.; Cox, M. M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 6 ed. Porto Alegre:</p><p>Artmed, 2014.</p><p>Giovani Bravin Peres, G. B.; Lichtenecker, D. C. K.; Yamaguchi., R. S. S. Biologia Molecular</p><p>Aplicada à Biomedicina. São Paulo: Editora Sol, 2020.</p>