PCR: Reação em Cadeia da Polimerase

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07/07/2010
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�PCR (Reação 
em Cadeia da 
Polimerase)
COMPLEXO ENZIMÁTICO DA REPLICAÇÃO DO 
DNA
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Replicação “in 
vitro”
Ciclos da PCR
� desnaturação
� anelamento dos “primers”
� extensão
Resulta na amplificação 
seletiva de uma região 
escolhida na molécula de 
DNA, desde que as 
seqüências das bordas desta 
região sejam conhecidas.
TERMOCICLADORES
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Reação de PCR
Amplificação : fragmentos de 1 a 3 kb
• enzima Taq DNA polimerase (não é 
inativada pelo calor)
• MgCl2
• Tampão para PCR
• dNTPS (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)
• DNA molde
• “Primers” ou Iniciadores
Elaborando os “primers” (iniciadores)
• cada “primer” deve ser complementar à fita molde de DNA e 
não idêntico!
• Deve ocorrer a hibridização
Por exemplo -DNA Molde: 
5’...CACAGACTCAGAGAGAACCCACC...TACCCCCGTGGTCTTTGAAT AAA...3’
3’...GTGTCTGAGTCTCTCTTGGGTGG...ATGGGGGCACCAGAAACTTA TTT...5’
5’AGACTCAGAGAGAACCC 3’
3’ GGGGCACCAGAAACTTA 5’
“FORWARD”
“REVERSE”
Genoma Humano: 3.000.000 kb – “primers” curtos (8-mer) = 
hibridizações inespecíficas. “primers”: 17 a 22 –mer ( raramente 
de 30-mer=hibridização pode não ocorrer)
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Etapas da PCR
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
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Calculando a Temperatura de “melting” de um “primer”
Tm = (4x[G+C]) + (2X[A+T]) °°°°C
5’ AGACTCAGAGAGAACCC 3’
4Gs 5Cs 7As 1T
Tm = (4x9) + (2x8) = 36 + 16 = 52 °°°°C (*)
*1 a 2 °°°°C abaixo
As Tm devem ser compatíveis para os dois 
“primers”
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Eletroforese
� montagem do 
gel
� colocação das 
amostras
� corrida 
eletroforética
� Coloração
� observação dos 
resultados
Brometo de etídio
corante 
intercalante
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DNA de fago λλλλ cortado com Hind III
� padrão de 
bandas bem 
separadas
� é muito usado 
como marcador 
de tamanho 
molecular. 
� 1kb DNA 
ladder (Gibco-
BRL)
Análise em Gel de Agarose
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Eletroforograma dos produtos amplificados
Aplicações da PCR
Exemplo 1
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Exemplo 2
Análise em gel de agarose
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Exemplo 3
RFLP
Análise do RFLP
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Ciclos RAPD-PCR
35-45 ciclos
RAPD: DNA polimórfico Amplificado ao Acaso
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Eletroforograma dos produtos amplificados 
pela técnica de RAPD
�Replicação “in vitro”
Seqüenciamento de DNA
� Métodos desenvolvidos por:
�Maxam & Gilbert (1970)
�degradação de cadeias
�Sanger et al. (1970)
�síntese de cadeias
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CLONAGEM EM BACTÉRIAS – Montagem das bibliotecas
Etapas de um projeto de seqüenciamento
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análogos dos 
desoxirribonucleotídeos
didesoxirribonucleotídeo
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Seqüenciador automático
Seqüenciamento 
automático
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Seqüência FASTA de nucleotídeos
5’GACTCTAGAG GATCCCCGTC TATGATAAAA GTATTTGAAA 
TGATTCTGAT AAAAATTTAA TGGCGAAAAA TTTTGACTTC 
CACCCTTCAA TTCAAGGTTA TAAAAAAATG CTCACCAACT 
TTGTTAAAAT TAACTCTTGA CCAAGAAGAA AAAGATGATT 
CTAATGCTGA AGAGCTAAAA AATACTACAA ATTTCGATGA 
TTTTGATGAG AATAAACCGA CCTATTCCAA AGTTATTGAC 
CTAAGTGTTT TTGCAAAATC AAATAAAGAA TTTCTTGAAA 
AATTAAACGA AAATAAGCAA ACTAGTGAAT TTATTGCTCA 
AAAATCCACT TTTGACACCG ATCAAGAAGC TGCAATCAAA 
GACGACAAAC GCACTTTTGG AAATATAGTT CGAGAAATGT 
ATCTTTACCA ATCTTCGATA ATTTTGATTT TAGAGAGTTA 
ATACCTGTTA AAAATCCATT TGTAAAAGCA ATTATTAACA 
GCTATTTAGG GAAACCAGCT GGTTCTCTTA TAAAAGATAT 
CGAACAACTC GAAAATAAAG TGAAAGATTA CGCAAGAACT 
AATATCAGAT TTTCGATACA TTATTGACTC ATTCATAAGA 
AAAATGGTAG CATTTTTGGT GAATTTAAAC ACTGGTTAGA 3’
www.ncbi.nlm.nih.gov\
Análise pelo BLAST
Score E
Sequences producing significant alignments: (bits) Value
pir:T03821 [T03821] prolipoprotein p65 - Mycoplasma hyopneumonia... 198 5e-63
pir:T03837 [T03837] surface lipoprotein - Mycoplasma hyopneumoni... 192 4e-61
pir:T43086 [T43086] hypothetical protein - Lactococc us lactis pl... 33 2.2
gp:SPAC631_2 protein with 2 bromodomains, putative involvement w... 33 2.2
sp:Y011_BORBU Hypothetical protein BB0011.>pir:C701 01 [C70101] h... 32 3.8
gp:AK001701_1 Homo sapiens cDNA FLJ10839 fis, clone NT2RP4001276... 32 3.8
pir:D82023 [D82023] probable lipoprotein NMA0281 [i mported] - Ne... 32 3.8
pir:E81244 [E81244] conserved hypothetical protein NMB0035 [impo... 32 3.8
sp:Y439_METJA Hypothetical ATP-binding protein MJ04 39.>pir:G6435... 32 3.8
pir:G96777 [G96777] hypothetical protein F9E10.32 [ imported] - A... 32 3.8
prf:2611299A LipA protein - Mycoplasma pulmo nis>gp:U2394... 32 3.8
prf:2204375A lipoprotein - Mycoplasma pulmon is 32 3.8
pir:T47835 [T47835] hypothetical protein T2O9.90 - A rabidopsis t... 32 3.8
pir:S70790 [S70790] lipA protein - Mycoplasma pulmon is (fragment) 32 3.8
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Representação 
circular do 
genoma de 
Pseudomonas 
aeruginosa