Construção de Primers

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ROTEIRO PARA ATIVIDADES PRÁTICAS
AULA PRÁTICA: 1 
TÍTULO PRÁTICA: Construção de primers e alinhamento de sequências
DISCIPLINA: Bioinformática				
CURSO: Biomedicina
	OBJETIVO(S) DA ATIVIDADE
	Após essa atividade você deverá:
- Compreender como é realizado o desenho de primers para amplificação de um gene alvo;
- Aplicar softwares de alinhamento para comparar sequências biológicas;
- Apontar como abordagens de bioinformática podem ser aplicadas em situações reais.
	REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
	Recomenda-se para esta aula a leitura especificada abaixo:
- Chen et al. 2020. Clinical characteristics and intrauterine vertical transmission potential of COVID-19 infection in nine pregnant women: a retrospective review of medical records. The Lancet.
- Prosdocimi F. Introdução à Bioinformática. 2007. Disponível online em http://www.iq.usp.br/setubal/bmc/2015/FProsdocimi07_CursoBioinfo.pdf 
	SOFTWARE(S) NECESSÁRIO(S) PARA A ATIVIDADE
	- Primer Blast, disponível online (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/);
- Needle, disponível online (https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/).
	ATIVIDADE PRÁTICA
	1. Cenário
 No ano de 2020 a Organização Mundial da Saúde decretou o surto do coronavírus, isolado pela primeira vez em Wuhan - China (COVID-19), uma emergência global de saúde pública. Para controlar a expansão de um surto de doença infecciosa como esse, é essencial o rápido diagnóstico de novos pacientes infectados. O diagnóstico utilizado no caso do COVID-19 é a realização da técnica de RT-PCR em tempo real seguida pelo sequenciamento. A RT-PCR em tempo real é uma variação da PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) convencional, utilizada para vírus de RNA e que fornece o resultado durante a execução da reação.
 Lembre-se que a PCR faz várias cópias de uma determinada região do DNA. Os primers são sequências sintéticas curtas de nucleotídeos necessárias como reagente na PCR (Figura 1). Esse par de sequências vão se ligar nas extremidades de uma região específica na fita de DNA para oferecer uma extremidade 5’ OH livre para adição do primeiro nucleotídeo da cópia que será sintetizada. O produto da PCR são vários pequenos fragmentos de DNA em um tubo. Se desejamos identificar a sequência de nucleotídeos desses fragmentos é necessário utilizar técnicas de sequenciamento.
 Na prática de hoje você utilizará um programa de computador para determinar a sequência de nucleotídeos de primers que poderão ser utilizados em uma reação de PCR para diagnóstico do COVID-19. Depois você irá comparar as sequências de nucleotídeos dos fragmentos amplificados pela PCR através de um programa para alinhamento de sequências. 
Figura 1: Resumo da reação de PCR. PCR Components: reagentes da PCR; DNA Sample: amostra de DNA; Nucleotides: nucleotídeos; Mix Buffer: tampão; PCR Tube: tudo de PCR; PCR Process: processos da PCR; Desnaturing: desnaturação (separação) da dupla fita de DNA; Anneling: anelamento (ligação) dos primers no DNA; Extension: extenção da cópia de DNA; Strands: fitas de DNA. Fonte: https://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-3-genetics/35-genetic-modification-and/pcr.html
2. Desenvolvimento da atividade prática
 Abaixo está uma sequência de nucleotídeos que pertence ao gene “S”. Esse gene codifica uma proteína do envelope viral que permite que o COVID-19 se ligue à célula do hospedeiro e a invada. Nessa primeira etapa vamos desenhar os primers que amplificarão uma região do gene “S” do COVID-19. Vamos utilizar a ferramenta online do “Primer Blast” que pertence ao NCBI. 
2.1. Acesse o site https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
2.2. Copie a sequência abaixo, juntamente com o cabeçário (linha que começa com “>”), e cole na caixa abaixo da frase “Enter accession, gi, or FASTA sequence”:
>Sequencial parcial do gene S do COVID-19
ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAAT TCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCC
AATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTT TATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTT
AATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAA AGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAA
GGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATT AATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACT
TTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTT CAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAG
TGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTC
2.3 A região dessa sequência que desejamos amplificar através da PCR está marcada em negrito. Ela vai do nucleotídeo 167 ao 895. Nós podemos passar essa informação para a ferramenta de confecção de primers. Basta você preencher a posição que você deseja que os primers se liguem no molde de DNA. Por exemplo, o primeiro primer deve se ligar no início da sequência, entre a posição 1 e a posição 166, enquanto o segundo primer deve se ligar no final da sequência molde, entre a posição 896 e 960 (Figura 2).
Figura 2: Como determinar a posição de ligação dos primers no molde de DNA
2.4 Em “Primers Parameters” (parâmetro dos primers) ajuste o tamanho do fragmento de DNA que nós desejamos que esses primers sintetizem. No nosso caso é entre 600 e 800 nucleotídeos. Então, preencha a lacuna em frente a “PCR product size” (tamanho do produto da PCR) com “Min” de 600 e “Max” de 800. Os demais parâmetros não precisam ser alterados e podemos usar os valores padrões que a ferramenta sugere. “# of primers to return” se refere ao número de pares de primers que a ferramenta irá construir. E “Primer melting temperatures (Tm)” é a temperatura na qual os primers irão se ligar na fita molde de DNA.
2.5 Em “Primer Pair Specificity Checking Parameters” (parâmetros de verificação da especificidade do par de primers) a ferramenta testa se o par de primers está se ligando exatamente na parte do DNA que queremos, e não em qualquer outra região. Nesse caso vamos alterar dois parâmetros. O primeiro será “Database” onde você irá selecionar “nr”, que indica para ferramenta usar como bando de dados todas as sequências que o NCBI possui armazenadas. Em “Organism” (organismo) preencha a lacuna com a palavra Betacoronavirus, nome do gênero ao qual o COVID-19 pertence.
2.6 No final da página clique no botão “Get primers” (obter primers).
2.7 Agora a ferramenta te dirá que existe no banco de dados alguns COVID-19 com aquela sua sequência alvo. Escolha qualquer uma das opções de genomas de COVID-19, clique em “Submit” e aguarde a página com os resultados ser carregada.
2.8 Como resultado, a ferramenta mostra um desenho que representa as posições dos pares de primers em relação a sequência que você forneceu. Abaixo, é possível ver as sequências de nucleotídeos dos 10 pares de primers que a ferramenta sugeriu. Fica a critério do usuário (você) escolher o melhor par baseado nas informações dadas.
 Imagine agora que o par de primers que você escolheu foi usado na reação de PCR para testar a presença do COVID-19 em amostras respiratórias de pacientes suspeitos em diferentes países. Quando a reação foi positiva, o fragmento amplificado foi enviado para o setor do laboratório que realiza o sequenciamento de DNA. Agora você irá comparar o resultado de sequenciamento da região do DNA do COVID-19 encontrado em dois pacientes diferentes, um de Wuhan, China, onde os primeiros casos apareceram, e outro na Austrália. 
2.9 Abra a página online https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/ 
2.10 A ferramenta de alinhamento global Needle é utilizada para o alinhamento de duas sequências. No nosso caso vamos alinhar duas sequências de DNA, por isso na opção “Enter a pair of” selecione DNA.
2.11 Na primeira caixa copie e colea sequência abaixo, que foi obtida de um paciente contaminado em Wuhan:
>MN908947, parte do gene S do paciente de Wuhan 
ACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATT
TAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTC
CCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCA
CAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCT
TATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAA
GCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCAC
TAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTA
TGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCT
2.12 Na segunda caixa copie e cole a sequência abaixo, que foi obtida de um paciente contaminado na Austrália:
>MT007544, parte do gene S do paciente da Austrália 
ACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATT
TAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTC
CCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCA
CAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCT
TATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAA
GCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCAC
TAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGGTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTA
TGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCT
2.13 Clique em “Submit” e aguarde o resultado.
2.14 Observe que na página de resultados existem as seguintes informações: identidade entre as duas sequências (“identity”), similaridade entre elas (“similarity”) e deleções/inserções entre as duas sequências (“gaps”). Verifique a porcentagem de identidade entre elas.
2.15 Visto que a identidade é 99%, existe uma diferença entre as sequências obtidas dos dois pacientes, tente encontrá-la observando o alinhamento mostrado.
2.16 Entre as posições 551 e 600, exatamente na posição 574, o nucleotídeo T (timina) presente na sequência do paciente de Wuhan foi substituído pelo nucleotídeo G (guanina) na sequência do paciente da Austrália.
3. Reflexão
 Durante essa prática você aplicou o conhecimento sobre como são desenhados primers para amplificação de uma região alvo no DNA de um organismo. A amplificação dessa região específica do vírus COVIS-19 teve como objetivo detectar sua presença na amostra de pacientes suspeitos de estarem infectados. Após a identificação dos resultados de paciente positivos (infectados), você teve acesso ao sequenciamento do DNA dos fragmentos amplificados pela PCR. Com essas sequências em mãos você realizou um alinhamento global das sequências de dois pacientes de países distintos. A diferença encontrada entre as duas sequências é chamada de mutação, nesse caso, a troca de uma timina por uma guanina. As sequências que você analisou são reais, e isso mostra que à medida que o vírus vai se espalhando entre pacientes pelo mundo, ele pode sofrer mudanças, que refletem a sua evolução ao longo do tempo.
 Na próxima aula daremos continuidade a análise do genoma do COVID-19 mutado, isolado do paciente australiano
	
OBSERVAÇÕES
	Pergunta ao aluno
1. Você poderia usar esse par de primers para detectar a presença do vírus do sarampo nos pacientes?
EXCLUSIVO PARA TUTORES
 Não. O primer deve alinhar em uma região específica do DNA alvo. Como o material genético do COVID-19 e do vírus do sarampo é diferente, o primer não reconheceria seu alvo.
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