TES_PPGCTA_2017_ETCHEPARE_MARIANA

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<p>UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA</p><p>CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS</p><p>PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DOS</p><p>ALIMENTOS</p><p>Mariana de Araújo Etchepare</p><p>DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO E ESTUDO DA</p><p>VIABILIDADE DE MICROPARTÍCULAS CONTENDO Lactobacillus</p><p>acidophilus La-14 OBTIDAS POR GELIFICAÇÃO IÔNICA EXTERNA</p><p>ASSOCIADAS À INTERAÇÃO ELETROSTÁTICA</p><p>Santa Maria, RS</p><p>2017</p><p>Mariana de Araújo Etchepare</p><p>DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO E ESTUDO DA VIABILIDADE DE</p><p>MICROPARTÍCULAS CONTENDO Lactobacillus acidophilus La-14 OBTIDAS POR</p><p>GELIFICAÇÃO IÔNICA EXTERNA ASSOCIADAS ÀS INTERAÇÕES</p><p>ELETROSTÁTICAS</p><p>Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação</p><p>em Ciência e Tecnologia dos Alimentos, da</p><p>Universidade Federal de Santa Maria (UFSM,</p><p>RS), como requisito parcial para obtenção do</p><p>título de Doutora em Ciência e Tecnologia</p><p>dos Alimentos.</p><p>Orientador: Prof. Dr. Cristiano Ragagnin de Menezes</p><p>Santa Maria, RS</p><p>2017</p><p>© 2017</p><p>Todos os direitos autorais reservados a Mariana de Araújo Etchepare. A reprodução de partes</p><p>ou do todo deste trabalho só poderá ser feita mediante a citação da fonte.</p><p>E-mail: marianaaetchepare@hotmail.com</p><p>Mariana de Araújo Etchepare</p><p>DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO E ESTUDO DA VIABILIDADE DE</p><p>MICROPARTÍCULAS CONTENDO Lactobacillus acidophilus La-14 OBTIDAS POR</p><p>GELIFICAÇÃO IÔNICA EXTERNA ASSOCIADAS ÀS INTERAÇÕES</p><p>ELETROSTÁTICAS</p><p>Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação</p><p>em Ciência e Tecnologia dos Alimentos, da</p><p>Universidade Federal de Santa Maria (UFSM,</p><p>RS), como requisito parcial para obtenção do</p><p>título de Doutora em Ciência e Tecnologia</p><p>dos Alimentos.</p><p>Aprovada em 20 de dezembro de 2017:</p><p>Cristiano Ragagnin de Menezes, Dr. (UFSM)</p><p>(Presidente/Orientador)</p><p>Elisângela Colpo, Drª. (UNIFRA)</p><p>Cátia Regina Storck, Drª. (UNIFRA)</p><p>Cristiane Franco Codevilla, Drª. (UFSM)</p><p>Juliano S. Barin, Dr. (UFSM)</p><p>Santa Maria, RS</p><p>2017</p><p>RESUMO</p><p>DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO E ESTUDO DA VIABILIDADE DE</p><p>MICROPARTÍCULAS CONTENDO Lactobacillus acidophilus La-14 OBTIDAS POR</p><p>GELIFICAÇÃO IÔNICA EXTERNA ASSOCIADAS À INTERAÇÃO</p><p>ELETROSTÁTICA</p><p>AUTORA: Mariana de Araújo Etchepare</p><p>ORIENTADOR: Cristiano Ragagnin de Menezes</p><p>Probióticos são definidos pela Organização Mundial da Saúde, como microrganismos vivos</p><p>que quando consumidos em quantidades adequadas conferem benefícios a saúde do</p><p>hospedeiro. Porém, para que esses benefícios ocorram, essas bactérias precisam chegar</p><p>íntegras ao intestino. Dessa forma, a microencapsulação de probióticos vem sendo estudada a</p><p>fim de proteger esses microrganismos frente a condições adversas ao meio onde são</p><p>submetidos. O objetivo deste estudo foi produzir e avaliar partículas de alginato de cálcio, na</p><p>forma úmida e liofilizada, obtidas por gelificação iônica externa e revesti-las sequencialmente</p><p>com multicamadas de proteínas de soro de leite e alginato de sódio, em até três camadas. O</p><p>efeito de diferentes números de camadas em relação à viabilidade da cultura livre e</p><p>microencapsulada foram analisados. A morfologia e o tamanho médio das partículas foram</p><p>determinados. A resistência probiótica frente a testes gastrointestinais simulados, tratamentos</p><p>térmicos e a viabilidade em armazenamento por até 120 dias foram analisados. Obteve-se uma</p><p>eficiência maior que 80% de encapsulação. O tamanho médio das micropartículas ficou entre</p><p>107 µm e 374 µm. O Lactobacillus acidophilus La-14 microencapsulado nos diferentes</p><p>tratamentos na forma úmida mostrou-se resistente durante condições gastrointestinais</p><p>simuladas com valores acima de 7 log UFC g</p><p>-1</p><p>, já as liofilizadas apresentaram uma baixa</p><p>liberação, obtendo-se valores um pouco acima de 5 log UFC g</p><p>-1</p><p>. Nos testes de resistência</p><p>térmica as partículas com multicamadas apresentaram melhores resultados frente às células</p><p>livres que não resistiram. O armazenamento por até 120 dias em temperaturas de refrigeração</p><p>e congelamento foi mais eficiente para todos os tipos de micropartículas, principalmente as</p><p>que continham as multicamadas, com contagens acima de 7 log UFC g</p><p>-1</p><p>para partículas</p><p>úmidas e 6 log UFC g</p><p>-1</p><p>para as liofilizadas, quando comparados às células livres. Conclui-se</p><p>que a formação das multicamadas de alginato e WPC produziram partículas resistentes a</p><p>influência dos fatores testados, aumentando a proteção para os probióticos em comparação a</p><p>partícula sem recobrimentos e, além disso, estas partículas podem ser consideradas como</p><p>potenciais transportadores de compostos sensíveis, cuja finalidade seja liberação em ambiente</p><p>intestinal.</p><p>Palavras-chave: Microencapsulação. Probióticos. Alginato. Proteínas. Multicamadas.</p><p>ABSTRACT</p><p>DEVELOPMENT, CHARACTERIZATION AND STUDY OF VIABILITY OF</p><p>MICROPARTICLES CONTAINING Lactobacillus acidophilus La-14 OBTAINED BY</p><p>EXTERNAL IONIC GELIFICATION ASSOCIATED WITH ELECTROSTATIC</p><p>INTERACTION</p><p>AUTHOR: MARIANA DE ARAÚJO ETCHEPARE</p><p>ORIENTER: CRISTIANO RAGAGNIN DE MENEZES</p><p>Probiotics are defined by the World Health Organization as living microorganisms that when</p><p>consumed in adequate amounts confer benefits to the health of the host. But for these benefits</p><p>to occur, these bacteria need to get to the gut intact. Thus, the microencapsulation of</p><p>probiotics has been studied in order to protect these microorganisms against adverse</p><p>conditions to the medium where they are submitted. The objective of this study was to</p><p>produce and evaluate calcium alginate particles in the wet and lyophilized form obtained by</p><p>external ionic gelation and to coat them sequentially with multilayers of whey protein and</p><p>sodium alginate in up to three layers. The effect of different numbers of layers on the viability</p><p>of the free and microencapsulated culture were analyzed. The morphology and mean particle</p><p>size were determined. Probiotic resistance to simulated gastrointestinal tests, heat treatments</p><p>and storage viability for up to 120 days were analyzed. An efficiency greater than 80%</p><p>encapsulation was obtained. The average size of the microparticles was between 107 μm and</p><p>374 μm. Lactobacillus acidophilus La-14 microencapsulated in the different treatments in the</p><p>humid form was resistant during simulated gastrointestinal conditions with values above 7 log</p><p>CFU g</p><p>-1</p><p>, whereas the lyophilized ones showed a low release, obtaining values slightly above</p><p>5 log UFC g</p><p>-1</p><p>. In the tests of thermal resistance the particles with multilayer presented better</p><p>results in front of the free cells that did not resist. Storage for up to 120 days at refrigeration</p><p>and freezing temperatures was more efficient for all types of microparticles, especially those</p><p>containing multilayers, with counts above 7 log CFU g</p><p>-1</p><p>for wet particles and 6 log CFU g</p><p>-1</p><p>for the lyophilized, when compared to the free cells. It is concluded that the formation of the</p><p>alginate and WPC multilayers produced particles resistant to the influence of the tested</p><p>factors, increasing the protection for probiotics compared to the uncoated particle and, in</p><p>addition, these particles can be considered as potential carriers of sensitive compounds, whose</p><p>purpose is release into the intestinal environment.</p><p>Key words: Microencapsulation. Probiotics. Alginate. Proteins. Multilayers.</p><p>LISTA DE ILUSTRAÇÕES</p><p>Figura 1 – Morfologia de diferentes partículas obtidas pelo processo de</p><p>microencapsulação .............................................................................................. 25</p><p>Figura 2 – Esquema do método de gelificação</p><p>que não recebem nenhum outro tipo de</p><p>tratamento (DOHERTY, 2012). Observa-se também que, conforme aumentou-se o número de</p><p>camadas, diminuiu-se a liberação.</p><p>No pH 7,5, após 200 minutos de análise, as micropartículas A0 apresentaram uma</p><p>redução na sua contagem, de 10,77 UFC g</p><p>-1</p><p>(pH 5,0) para 8,91 UFC g</p><p>-1</p><p>. Já o tratamento A1,</p><p>apresentou maior liberação quando comparada ao pH 5,0 com log de 9,19 UFC g</p><p>-1</p><p>. Conforme</p><p>o aumento no número de camadas na partícula observou-se uma menor contagem nos</p><p>tratamentos A3 (7,44 UFC g</p><p>-1</p><p>) e A2 (8,13UFC g</p><p>-1</p><p>), sugerindo assim, uma diminuição do</p><p>tamanho dos poros da partícula, que impedem a liberação e interação dos microrganismos</p><p>com o suco gastrointestinal. Resultados semelhantes foram encontrados por Mokarram et al.</p><p>(2009), que relataram uma maior sobrevivência de probióticos encapsulados em alginato de</p><p>cálcio com duplo revestimento de alginato de sódio durante a exposição ao trato</p><p>gastrointestinal. Eles sugerem que, um tamanho de poro reduzido foi formado com a dupla</p><p>camada de membrana, que conduziu uma limitação na liberação da partícula, aumentando a</p><p>sobrevivência probiótica.</p><p>Em todos os tempos e pHs, nota-se que a micropartícula A3 obteve os menores índices</p><p>de liberação, com contagens de 6,18, 7,1, e 7,44 UFC g</p><p>-1</p><p>para os pHs 2,0, 5,00 e 7,5,</p><p>respectivamente. Essa menor redução de contagem de células viáveis, pode ser explicada pelo</p><p>fortalecimento adicional da camada proteica após a reticulação por íons de cálcio existente</p><p>nesse tratamento (SANDBERG et al., 1983).</p><p>Acredita-se que a baixa solubilidade das camadas proteicas dos diferentes tipos de</p><p>partículas deste estudo em simulação gástrica, seja devido principalmente a resistência à</p><p>hidrólise proteolítica da β-lactoglobulina, a qual representa a maior fração proteica do</p><p>concentrado proteico do soro do leite, reduzindo assim a liberação probiótica (SARKAR</p><p>et al., 2009).</p><p>Se tratando das partículas liofilizadas, todos os tratamentos variaram de 7-8 log UFC</p><p>g</p><p>-1</p><p>, apresentando liberação de cerca de 3 log UFC g</p><p>-1</p><p>, após a exposição a suco gástrico</p><p>simulado (pH 2,0/90min) demonstrando assim, a eficiência da encapsulação e das</p><p>multicamadas nas partículas. Em condições controladas com pH 5, conforme aumentou-se o</p><p>número de camadas, diminuiu-se as reduções logarítmicas comparadas ao tempo inicial da</p><p>análise. Neste período de análise, a camada adicional de alginato sobre a partícula A2, não</p><p>diferiu significativamente da partícula A1, obtendo-se contagens de 5,42 e 5,45 UFC g</p><p>-1</p><p>respectivamente. Ao aumentar o pH para 7,5, após 200 minutos de análise, os tratamentos</p><p>107</p><p>com multicamadas A1, A2 e A3 não apresentaram diferenças significativas entre si, liberando</p><p>mais de 5 log UFC g</p><p>-1</p><p>.</p><p>No decorrer da análise, observou-se que as micropartículas A1 mostraram melhores</p><p>resultados tanto para as partículas úmidas como para as liofilizadas, pois conforme o pH foi</p><p>aumentando, sua liberação aumentou também. Os resultados apresentados também</p><p>corroboram com Gbassi et al. (2009), que relataram que partículas de alginato com um</p><p>revestimento de proteína de soro do leite conferem uma boa liberação (7</p><p>UFC g</p><p>-1</p><p>) e maior</p><p>proteção ao microrganismo, quando exposto a testes gastrointestinais. As proteínas de soro de</p><p>leite são muito eficazes na sua função protetora, devido à sua riqueza em resíduos de</p><p>aminoácidos específicos que proporcionam um ambiente protetor para os probióticos</p><p>(SOUSA, 2013).</p><p>Assim, a microencapsulação nos diferentes tratamentos, conferiu maior proteção para</p><p>Lactobacillus acidophilus La-14 durante a exposição do microrganismo em todas as etapas</p><p>simuladas da digestão quando comparados às células livres.</p><p>6.6 VIABILIDADEDE Lactobacillus acidophilus MICROENCAPSULADOS EM</p><p>PARTÍCULAS ÚMIDAS E LIOFILIZADAS APÓS TRATAMENTO TÉRMICO</p><p>A fim de investigar a eficácia na proteção das micropartículas e das multicamadas</p><p>contra o calor, a sobrevivência das células livres e microencapsuladas na forma úmida e</p><p>liofilizada foram avaliadas após exposição a temperaturas de 72° C por 15s e 5 min e 63° C</p><p>por 30, 60 e 120 min.</p><p>Observou-se que a 72° C durante 15s, o tratamento A2 tanto das partículas úmidas</p><p>como das partículas liofilizadas apresentaram maior resistência em relação aos demais</p><p>tratamentos, mostrando que a adição posterior de alginato de sódio nas micropartículas</p><p>melhorou significativamente a viabilidade celular depois do aquecimento, corroborando com</p><p>estudos de Mokarram et al. (2009).</p><p>Os microrganismos livres foram mais sensíveis ao choque térmico do que os</p><p>microrganismos microencapsulados a 72° C durante 15s e 5 min, com suas contagens</p><p>decrescentes de 2,54 e 4,15 ciclos logarítmicos respectivamente.</p><p>Em 72° C durante 5 min, o tratamento A1 apresentou maior resistência térmica com</p><p>redução logarítmica de 2,19 UFC g</p><p>-1</p><p>para partículas úmidas, já na forma liofilizada, o</p><p>tratamento A2 apresentou melhor viabilidade. Na temperatura de 63° C durante 30 min, o</p><p>tratamento A3 mostrou maior resistência ao aquecimento tanto para micropartículas úmidas</p><p>108</p><p>como para as liofilizadas, demonstrando assim, a eficiência dos recobrimentos proteicos e</p><p>poliméricos sob a partícula de alginato.</p><p>Na temperatura de 63° C ⁄60min e 63° C ⁄120min, o tratamento A1 na forma úmida e</p><p>liofilizada apresentou condições significativamente melhores que os tratamentos A2 e A3, que</p><p>não diferiram entre si, na temperatura de 63° C ⁄60min. Comparando com a contagem de</p><p>células viáveis de Lactobacillus acidophilus La-14 livre, e com a micropartícula A0, a</p><p>capacidade de sobrevivência foi mais elevada (P<0,05) com a adição das multicamadas nas</p><p>partículas.</p><p>As cultura livre e o tratamento A0 (na forma úmida) foram reduzidos para um nível</p><p>indetectável, o que pode indicar uma baixa estabilidade do microrganismo ao calor, pelo</p><p>período de tempo analisado. Em relação ao tratamento A0, acredita-se que houve perda de</p><p>viabilidade da bactéria, em função da porosidade que o alginato apresenta quando utilizado</p><p>sozinho como material encapsulante (DOHERTY, 2012).</p><p>A viabilidade dos probióticos microencapsulados, após a exposição a um processo</p><p>térmico depende de muitos fatores cruciais, por exemplo, a utilização de uma técnica de</p><p>encapsulamento adequada, a arquitetura das microcápsulas produzidas e a seleção de</p><p>polímeros adequados (VEMMER; PATEL, 2013). Corona-Hernandez et al. (2013) explicam</p><p>que as propriedades viscoelásticas dos polissacarídeos e o sistema coloidal das proteínas,</p><p>juntos, melhoram as interações eletrostáticas e são um fator importante na determinação do</p><p>nível de termotolerância de microcápsulas compostas.</p><p>A partir dos dados apresentados acima, foi comprovado que a adição das</p><p>multicamadas e/ou materiais com uma natureza química diferente, pode fornecer melhor</p><p>termotolerância aos probióticos microencapsulados, visto que, todos os tratamentos com</p><p>multicamadas toleraram melhor os tratamentos térmicos, principalmente, nas temperaturas de</p><p>63° C por 30, 60 e 120 min. Portanto, as multicamadas proteicas e poliméricas inseridas sobre</p><p>as bactérias probióticas, podem manter a estrutura celular melhor do que as células livres ou</p><p>apenas com um recobrimento polimérico, melhorando assim a estabilidade térmica.</p><p>6.7 VIABILIDADE DAS MICROPARTÍCULAS ÚMIDAS E LIOFILIZADAS DURANTE</p><p>DIFERENTES CONDIÇÕES DE ESTOCAGEM</p><p>A viabilidade das células livres de Lactobacillus acidophilus La-14 e nos diferentes</p><p>tratamentos úmidos e liofilizados durante a estocagem por até 120 dias de armazenamento a</p><p>7° C, -18° C e 25° C foram analisadas.</p><p>109</p><p>Comparado com as bactérias livres, as taxas de sobrevivência de Lactobacillus</p><p>acidophilus La-14 nas micropartículas nos diferentes tratamentos na forma úmida e liofilizada</p><p>foram mais altas em todas as temperaturas, mostrando que, o efeito da microencapsulação em</p><p>multicamadas aumenta a vida útil do microrganismo. Resultados semelhantes</p><p>foram</p><p>encontrados por Chen et al. (2017) que compararam a sobrevivência de L. bulgaricus</p><p>encapsulado em WPI com revestimento de alginato com células livres, e concluiu que as taxas</p><p>de mortalidade das bactérias encapsuladas foram muito mais baixas em todas as temperaturas</p><p>mostrando o efeito da microencapsulação com revestimento no aumento da estabilidade de L.</p><p>bulgaricus. Coghetto et al. (2016), mostram que a microencapsulação aumenta a</p><p>sobrevivência de Lactobacillus plantarum sob armazenamento em diferentes temperaturas</p><p>mas salientam que para melhores resultados e antes de se obter uma produção industrial em</p><p>larga escala, mais testes de estabilidade de armazenamento são ainda e necessário como por</p><p>exemplo, estabilidade de armazenamento em níveis de umidades diferente e em diferentes</p><p>sistemas alimentares também devem ser testados (YING et al., 2013).</p><p>Do mesmo modo, outras medidas de proteção também devem ser adotadas para</p><p>melhorar a sobrevivência dos microrganismos encapsulados durante o armazenamento, tais</p><p>como suplementação de antioxidantes ou uso de materiais de embalagem de barreira de</p><p>oxigênio (IRAVANI et al., 2015), principalmente para os que serão submetidos ao processo</p><p>de liofilização.</p><p>No presente estudo, o fato de ter utilizado a concentração de alginato de sódio (2%) na</p><p>formulação da partícula A0, já melhorou a viabilidade celular, quando comparada com</p><p>resultados encontrados por Etchepare et al. (2016), que utilizou 1% de alginato de sódio em</p><p>suas partículas. Além do mais, as multicamadas obtidas por interações eletrostáticas também</p><p>mostraram-se viáveis na encapsulação de microrganismos probióticos melhorando mais as</p><p>condições analisadas.</p><p>111</p><p>7 CONCLUSÃO</p><p>A produção de micropartículas de alginato de cálcio veiculando L. acidophilus</p><p>La-14 através da técnica de gelificação iônica externa com multicamadas de proteína de soro</p><p>de leite e alginato de sódio na forma úmida e liofilizada mostrou alta eficiência de</p><p>encapsulamento, boa viabilidade pós-liofilização e afetou positivamente a viabilidade do</p><p>microrganismo quando expostos a condições que simulam o trato gastrointestinal e</p><p>tratamentos térmicos.</p><p>As Partículas úmidas suportaram melhor aos tratamentos térmicos, mantendo suas</p><p>contagens entre 7 e 8 log UFC g</p><p>-1</p><p>, enquanto que as partículas liofilizadas apresentaram</p><p>liberação de 6 log UFC g</p><p>-1</p><p>nos tratamentos com multicamadas.</p><p>As partículas com multicamadas se mostraram resistentes às condições</p><p>gástrointestinais, principalmente o tratamento A1 na forma úmida, com liberação entre 7 e</p><p>9 log UFC g</p><p>-1</p><p>promovendo a desintegração das multicamadas e a liberação dos</p><p>microrganismos da partícula.</p><p>Em relação ao período de armazenamento por até 120 dias, as temperaturas de</p><p>refrigeração e congelamento foram mais eficiente para todos os tipos de micropartículas,</p><p>principalmente as que continham as multicamadas, com contagens acima de 7 log UFC g</p><p>-1</p><p>para partículas úmidas e 6 log UFC g</p><p>-1</p><p>para as liofilizadas.</p><p>Com base nestes resultados, conclui-se que a formação das multicamadas de alginato e</p><p>WPC produziram partículas resistentes a influência dos fatores testados, aumentando a</p><p>proteção para os probióticos em comparação a partícula sem recobrimentos e, além disso,</p><p>estas partículas podem ser consideradas como potenciais transportadores de compostos</p><p>sensíveis, cuja finalidade seja liberação em ambiente intestinal.</p><p>113</p><p>REFERÊNCIAS</p><p>AGGARWAL, J.; SWAMI, G.; KUMAR, M. 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encapsulation of bacteria by means of</p><p>extrusion techniques and emulsion d) Structure of the Egg Box calcium</p><p>alginate ................................................................................................................ 46</p><p>MANUSCRITO 2</p><p>Figure 1 – Optical microscopy of alginate microparticles with multilayers ........................ 75</p><p>Figure 2 – Morphology and microstructure of the freeze-dried microparticles with</p><p>multilayers obtained by scanning electron microscopy. ..................................... 76</p><p>MANUSCRITO 3</p><p>Figure 1 – Morphology and microstructure of the freeze-dried microparticles with</p><p>multilayers obtained by scanning electron microscopy .................................... 102</p><p>LISTA DE TABELAS</p><p>Tabela 1 – Tratamentos desenvolvidos. ................................................................................ 36</p><p>MANUSCRITO 1</p><p>Table 1 – Microcapsules produced with sodium alginate combined with other polymers . 48</p><p>MANUSCRITO 2</p><p>Table 1 – Treatments developed in the probiotic microparticles produced by external</p><p>ionic gelation ....................................................................................................... 70</p><p>Table 2 – Encapsulation efficiency and mean diameter of the alginate microparticles</p><p>with different polymer multilayers produced by external ionic gelation ............ 71</p><p>Table 3 – Viability of free and microencapsulated Lactobacillus acidophilus La-14 in</p><p>different treatments exposed to simulated gastrointestinal conditions, in 0,</p><p>90, 110 and 200 minutes ..................................................................................... 72</p><p>Table 4 – Viability of free and microencapsulated Lactobacillus acidophilus in</p><p>different treatments in relation to the thermal resistance .................................... 73</p><p>Table 5 – Effect of refrigeration temperature (7 °C), freezing (-18 °C) and ambient (25</p><p>°C) on the viability of free and microencapsulated Lactobacillus acidophilus</p><p>La-14, stored for up to 120 days ......................................................................... 74</p><p>MANUSCRITO 3</p><p>Tabela 1 – Tratamentos desenvolvidos nas micropartículas probióticas .............................. 97</p><p>Tabela 2 – Viabilidade após liofilização e diâmetro médio das micropartículas de</p><p>alginato com diferentes multicamadas poliméricas liofilizadas .......................... 98</p><p>Tabela 3 – Viabilidade de Lactobacillus acidophilus La-14 livre e microencapsulados</p><p>nos diferentes tratamentos frente às condições gastrointestinais simuladas,</p><p>nos tempos de 0, 90, 110 e 200 minutos ............................................................. 99</p><p>Tabela 4 – Viabilidade de Lactobacillus acidophilus livre e microencapsulados nos</p><p>diferentes tratamentos em relação à resistência térmica ................................... 100</p><p>Tabela 5 – Efeito da temperatura de refrigeração (7° C), congelamento (-18° C) e</p><p>ambiente (25° C) sobre a viabilidade de Lactobacillus acidophilus La-14</p><p>livre e microencapsulado armazenados por 120 dias ........................................ 101</p><p>SUMÁRIO</p><p>APRESENTAÇÃO ..................................................................................................... 15</p><p>1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 17</p><p>2 OBJETIVOS ............................................................................................................... 19</p><p>2.1 OBJETIVO GERAL ..................................................................................................... 19</p><p>2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................... 19</p><p>3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 21</p><p>3.1 PROBIÓTICOS ............................................................................................................ 21</p><p>3.1.1 Gênero Lactobacillus .................................................................................................. 22</p><p>3.2 MICROENCAPSULAÇÃO ......................................................................................... 24</p><p>3.3 EXTRUSÃO ⁄ GELIFICAÇÃO IÔNICA EXTERNA ................................................. 26</p><p>3.4 ALGINATO .................................................................................................................. 29</p><p>3.5 INTERAÇÕES ELETROSTÁTICAS .......................................................................... 30</p><p>3.6 PROTEÍNAS DO SORO DO LEITE ........................................................................... 32</p><p>3.7 LIOFILIZAÇÃO ........................................................................................................... 33</p><p>4 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 35</p><p>4.1 MATERIAIS ................................................................................................................. 35</p><p>4.2 MÉTODOS ................................................................................................................... 35</p><p>4.2.1 Preparo do inóculo ...................................................................................................... 35</p><p>4.2.2 Produção das microcápsulas ...................................................................................... 35</p><p>4.2.3 Partículas com multicamadas .................................................................................... 35</p><p>4.2.4 Eficiências da encapsulação ....................................................................................... 36</p><p>4.2.5 Liofilização .................................................................................................................. 36</p><p>4.2.6 Viabilidade de Lactobacillus acidophilus La-14 microencapsulados após o</p><p>processo de liofilização ............................................................................................... 36</p><p>4.2.7 Caracterização morfológica das microcápsulas: Microscopia ótica e eletrônica</p><p>de varredura ................................................................................................................ 37</p><p>4.2.8 Avaliação do diâmetro médio e distribuição de tamanho das microcápsulas ....... 37</p><p>4.2.9 Contagem das células viáveis ..................................................................................... 37</p><p>4.2.10 Estabilidade das micropartículas frente às condições gastrointestinais</p><p>simuladas ..................................................................................................................... 37</p><p>4.2.11 Estabilidade das micropartículas em relação à resistência térmica....................... 38</p><p>4.2.12 Estabilidade das micropartículas durante a estocagem em diferentes</p><p>temperaturas ............................................................................................................... 38</p><p>4.2.13 Análises Estatísticas ....................................................................................................</p><p>39</p><p>5 ARTIGOS CIENTÍFICOS INTEGRADOS ............................................................. 41</p><p>5.1 ARTIGO 1 – MICROENCAPSULATION OF PROBIOTICS USING SODIUM</p><p>ALGINATE .................................................................................................................. 43</p><p>5.2 ARTIGO 2 – PRODUCTION, CHARACTERIZATION AND VIABILITY OF</p><p>PROBIOTIC MICROPARTICLES CONTAINING ALGINATE AND WHEY</p><p>PROTEINS IN MULTILAYER ................................................................................... 51</p><p>5.3 ARTIGO 3 – PRODUCTION, CHARACTERIZATION AND VIABILITY OF</p><p>LYOPHILIZED PROBIOTIC MICROPARTICLES CONTAINING ALGINATE</p><p>AND WHEY PROTEINS IN MULTILAYER ............................................................ 77</p><p>6 DISCUSSÃO GERAL .............................................................................................. 103</p><p>6.1 EFICIÊNCIAS DE ENCAPSULAÇÃO DAS PARTÍCULAS ÚMIDAS (EE) ......... 103</p><p>6.2 VIABILIDADE DE LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS LA-14</p><p>MICROENCAPSULADOS APÓS O PROCESSO DE LIOFILIZAÇÃO ................ 103</p><p>6.3 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DAS MICROPARTÍCULAS ÚMIDAS</p><p>E LIOFILIZADAS ..................................................................................................... 104</p><p>6.4 AVALIAÇÃO DO DIÂMETRO MÉDIO E DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO</p><p>DAS MICROPARTÍCULAS ÚMIDAS E LIOFILIZADAS .................................... 104</p><p>6.5 VIABILIDADE DE LACTOBACILLUS ACIDOPHILLUS LA-14 LIVRE E</p><p>MICROENCAPSULADOS NAS PARTÍCULAS ÚMIDAS E LIOFILIZADAS</p><p>FRENTE ÀS CONDIÇÕES GASTROINTESTINAIS SIMULADAS ..................... 105</p><p>6.6 VIABILIDADEDE LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS</p><p>MICROENCAPSULADOS EM PARTÍCULAS ÚMIDAS E LIOFILIZADAS</p><p>APÓS TRATAMENTO TÉRMICO .......................................................................... 107</p><p>6.7 VIABILIDADE DAS MICROPARTÍCULAS ÚMIDAS E LIOFILIZADAS</p><p>DURANTE DIFERENTES CONDIÇÕES DE ESTOCAGEM ................................ 108</p><p>7 CONCLUSÃO .......................................................................................................... 111</p><p>REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 113</p><p>APRESENTAÇÃO</p><p>Essa tese segue as normas estabelecidas na Estrutura e Apresentação de Monografias,</p><p>Dissertações e Teses – MDT da UFSM (UFSM, 2015). Os resultados estão apresentados na</p><p>forma de três artigos científicos, sendo um de revisão bibliográfica, e dois com resultados da</p><p>pesquisa. Ao final dessa tese, encontram-se os itens DISCUSSÃO GERAL e</p><p>CONCLUSÕES, apresentando uma compilação de interpretações e comentários a respeito</p><p>dos resultados demonstrados nos artigos científicos.</p><p>17</p><p>1 INTRODUÇÃO</p><p>As bactérias probióticas são definidas como "microrganismos vivos que, quando</p><p>administrados em quantidades adequadas conferem uma série de benefícios à saúde do</p><p>hospedeiro" (FAO/OMS, 2002). Nos últimos anos, houve um aumento nas demandas do</p><p>mercado probiótico devido à crescente conscientização sobre a importância crucial de se</p><p>manter uma microbiota intestinal saudável, e o reflexo dela perante a saúde do ser humano.</p><p>Em 2011, as vendas globais de produtos probióticos atingiram US $ 24,23 bilhões, e deverão</p><p>chegar a US $ 44,9 bilhões até 2018 (PEDRETTI, 2013; CHEN et al., 2017).</p><p>Porem, vários fatores como, por exemplo, processos de secagem, estresse oxidativo e</p><p>temperatura de armazenamento afetam a sobrevivência desses microrganismos durante o</p><p>processamento e estocagem dos alimentos (TRIPATHI; GIRI, 2014). Além do mais, a</p><p>maioria dos probióticos consumidos deve permanecer vivos durante a passagem pelo trato</p><p>gastrointestinal, até atingir os locais desejados onde exercem seus efeitos benéficos (COOK</p><p>et al., 2012; DOHERTY et al., 2012). Diversas alternativas estão sendo propostas para</p><p>aumentar a resistência dessas bactérias contra essas condições adversas, como a seleção de</p><p>estirpes resistentes, adaptação ao estresse, e a microencapsulação (IRAVANI;</p><p>KORBEKANDI; MIRMOHAMMADI, 2015).</p><p>A microencapsulação é baseada no revestimento ou encapsulamento de um núcleo</p><p>com um material polimérico para originar microesferas que compreendam um tamanho na</p><p>faixa de 10 e 1000 μm em média. Esta tecnologia versátil vem sendo utilizada para encapsular</p><p>diversos tipos de produtos, tais como produtos farmacêuticos, aromatizantes, óleos voláteis,</p><p>extratos de plantas, enzimas e bactérias (RATHORE et al., 2013). A microencapsulação de</p><p>probióticos, não só protege os microrganismos de um ambiente desfavorável, mas também</p><p>permite a liberação controlada na forma viável e metabolicamente ativa no intestino (COOK</p><p>et al., 2012; DOHERTY et al., 2012; IRAVANI et al., 2015).</p><p>Diversas técnicas são utilizadas para a obtenção das microcápsulas e o emprego de</p><p>biopolímeros naturais como materiais encapsulantes é de grande importância, uma vez que,</p><p>esses materiais são classificados como seguros, e podem ser destinados ao consumo humano</p><p>(DOHERTY et al., 2011).</p><p>A microencapsulação pela técnica de gelificação iônica externa é bastante explorada</p><p>pela utilização de polissacarídeos naturais, não utiliza solventes orgânicos e é realizada em</p><p>temperatura ambiente, sendo uma das mais amenas para a encapsulação de probióticos</p><p>(ETCHEPARE et al., 2016). Porém, as partículas obtidas pela técnica de gelificação iônica</p><p>18</p><p>externa utilizando alginato de sódio apresentam uma elevada porosidade, o que permite a</p><p>difusão de compostos de baixo peso molecular, além de uma baixa resistência mecânica</p><p>(DOHERTY et al., 2011).</p><p>Visando a diminuição dessa porosidade e a melhora das características de proteção da</p><p>partícula, existe ainda uma necessidade e carência de estudos na literatura propondo a</p><p>aplicação de multicamadas através de interações eletrostáticas pela adição de um polieletrólito</p><p>de carga oposta à apresentada pelo gel, formando os chamados complexos polieletrólitos</p><p>(PATIL et al., 2010), propondo assim, aumentar a proteção de bactérias probióticas.</p><p>No presente trabalho uma nova metodologia será estudada com o intuito de melhorar a</p><p>viabilidade de microrganismos probióticos, envolvendo a combinação de várias camadas</p><p>sobre uma partícula matriz. Para tanto, materiais simples e de baixo custo serão utilizados</p><p>para fazer os revestimentos, tais como proteínas do soro do leite e alginato de sódio. Dessa</p><p>forma, as multicamadas serão utilizadas para avaliar a resistência das partículas quando</p><p>inseridas em diversos meios.</p><p>19</p><p>2 OBJETIVOS</p><p>2.1 OBJETIVO GERAL</p><p>Desenvolver micropartículas probióticas por gelificação iônica externa utilizando</p><p>alginato de sódio como material encapsulante e recobri-las com multicamadas de concentrado</p><p>proteico de soro de leite e alginato de sódio, por interação eletrostática e avaliar sua</p><p>estabilidade quando inseridas em diferentes meios, na forma úmida e liofilizada.</p><p>2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS</p><p> Utilizar como material de recheio culturas probióticas do gênero Lactobacillus;</p><p> Utilizar concentrado proteico do soro de leite e alginato como recobrimento para</p><p>formação das multicamadas;</p><p> Avaliar as partículas após serem submetidas ao método de secagem por liofilização</p><p>para obtenção de partículas secas;</p><p> Avaliar o tamanho médio das micropartículas com o número de camadas</p><p>adicionadas na forma úmida e liofilizada;</p><p> Avaliar a morfologia interna e externa das micropartículas com multicamadas</p><p>antes e após liofilização;</p><p> Avaliar a estabilidade das micropartículas com multicamadas úmidas e liofilizadas,</p><p>frente à diferentes tratamentos térmicos;</p><p> Avaliar a resistência das micropartículas com multicamadas úmidas e liofilizadas</p><p>em condições que simulam o ambiente gástrico e intestinal;</p><p> Avaliar a vida de prateleira das micropartículas com multicamadas úmidas e</p><p>liofilizadas em diferentes temperaturas.</p><p>21</p><p>3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA</p><p>3.1 PROBIÓTICOS</p><p>No início do século 20, o cientista russo Élie Metchnikoff</p><p>propôs que a saúde, o</p><p>bem-estar e a longevidade das populações balcânicas eram atribuíveis ao consumo de grandes</p><p>quantidades de leite fermentado, contendo microrganismos benéficos denominados de</p><p>probióticos. Após diversas definições propostas, a definição mais atual refere-se ao conceito</p><p>de que probióticos são organismos vivos que, quando administrados em quantidades</p><p>adequadas conferem uma série de benefícios à saúde do hospedeiro, cuja ingestão leva a</p><p>importantes mudanças fisiológicas ao organismo, através do equilíbrio da microbiota</p><p>intestinal (CORONA-HERNANDEZ et al., 2013; FAO, 2001). Inúmeros benefícios à saúde</p><p>têm sido atribuídos à ingestão de probióticos, porém, é importante ressaltar que tais benefícios</p><p>somente ocorrem se os mesmos estiverem totalmente viáveis nos produtos onde serão</p><p>incluídos, ou seja, que sobrevivam durante seu processamento e condições de</p><p>armazenamento, sendo assim ingeridos em quantidades adequadas, alcançando um número</p><p>viável de microrganismos (10</p><p>7</p><p>UFC g</p><p>-1</p><p>) (SOHAIL et al., 2013; TRIPATHI; GIRI, 2014). No</p><p>Brasil, a legislação recomenda 10</p><p>8</p><p>– 10</p><p>9</p><p>UFC/100g na recomendação diária do produto</p><p>pronto para consumo (BRASIL, 2012).</p><p>Para ser considerado probiótico, o microrganismo precisa atender os seguintes</p><p>critérios: não apresentar patogenicidade; exercer um efeito benéfico à saúde do hospedeiro;</p><p>ser Gram positivo; ser produtor de ácido e ser ácido resistente; apresentar especificidade ao</p><p>hospedeiro; apresentar atividade inibitória contra E. coli; conter um grande número de células</p><p>viáveis; ser isolado da mesma espécie animal a que se destina; resistir à ação da bile e</p><p>lisozima e colonizar o trato intestinal humano, ao menos temporariamente, mediante</p><p>mecanismos de adesão às células intestinais (MACEDO, 2005). Os testes “in vitro” mais</p><p>utilizados para a avaliação de probióticos em alimentos são as análises de resistência à acidez</p><p>gástrica e aos sais biliares, baseados em estudos de sobrevivência e desenvolvimento, pois a</p><p>tolerância à bile é considerada como uma característica importante de cepas de Lactobacillus</p><p>ssp., por exemplo, o que lhes permite sobreviver, multiplicar-se e exercer a sua ação no</p><p>trânsito gastrointestinal (FAO/WHO, 2006; ARGYRI et al., 2013).</p><p>Quando consumidos em quantidades adequadas, os probióticos apresentam diversos</p><p>efeitos benéficos sobre corpo humano através, principalmente, da manutenção da microflora</p><p>intestinal normal, inibindo assim a adesão de bactérias patogênicas na mucosa intestinal,</p><p>aumentando a imunidade, reduzindo os níveis de colesterol no sangue, protegendo contra</p><p>22</p><p>doenças cardíacas, reduzindo a incidência de doenças urogenitais e respiratórias, prevenindo</p><p>alguns tipos de câncer e agindo também no controle da obesidade (ROUXINOL-DIAS et al.,</p><p>2016).</p><p>O modo de ação dos probióticos não foi ainda completamente esclarecido, embora</p><p>tenham sido sugeridos vários processos que podem atuar independentemente ou associados.</p><p>Um deles é a exclusão competitiva, em que o probiótico competiria com os patógenos por</p><p>sítios de adesão e nutrientes, e isso, explicaria a necessidade da administração continuada e</p><p>em elevadas doses dos probióticos, para manter seus efeitos (DE VRESE; SCHREZENMEIR,</p><p>2008). Os efeitos benéficos são mediados por alguns mecanismos principais de ações</p><p>probióticas, que incluem a inibição do patógeno, restauração do equilíbrio microbiano,</p><p>melhoria da função de barreira epitelial, e efeitos imunomoduladores através de interações</p><p>com células do sistema imune (LEBEER et al., 2008).</p><p>Os dois gêneros mais empregados como microrganismos probióticos e mais</p><p>popularmente adicionado em alimentos são Bifidobacterium sp. e Lactobacillus sp</p><p>(CORONA-HERNANDEZ et al., 2013), porém, atualmente diversos outros gêneros como</p><p>Pediococcus, Enterococcus, Bacillus, Escherichia e Saccharomyces estão sendo utilizados</p><p>por apresentar benefícios comprovados a saúde do consumidor (WEINBRECK et al., 2010).</p><p>3.1.1 Gênero Lactobacillus</p><p>Com mais de 100 espécies e subespécies, o gênero Lactobacillus representa o maior</p><p>grupo dentro da família Lactobacillaceae. Os membros do gênero são encontrados na forma</p><p>de bastonetes, muitas vezes organizados em cadeias. São caracterizados como aerotolerantes,</p><p>mas crescem bem em condições de anaerobiose. Existem dois grupos da espécie, dependendo</p><p>da capacidade de fermentar açúcares: espécies homofermentativas, convertendo açúcares</p><p>principalmente em ácido lático, e espécies heterofermentativas, que convertem açúcares em</p><p>ácido lático, ácido acético, etanol e CO2. Estes microrganismos, preferem condições</p><p>relativamente ácidas com pH entre 5,5 - 6,5 (GIRAFFA et al., 2010).</p><p>O gênero Lactobacillus é muito utilizado na fermentação de alimentos, principalmente</p><p>na indústria láctea. Esses microrganismos possuem necessidades nutricionais complexas e são</p><p>encontradas em vários habitats, intestino delgado e mucosas de seres humanos e animais,</p><p>material de origem vegetal e silagem, bem como em leites fermentados e alimentos em</p><p>deterioração (DE VRESE; SCHREZENMEIR, 2008; BENDALI et al., 2011).</p><p>O Lactobacillus acidophilus é um bacilo Gram-positivo com pontas arredondadas,</p><p>incapaz de formar esporo, desprovido de flagelos, se encontra na forma de células livres, aos</p><p>23</p><p>pares ou em cadeias curtas, com tamanho típico de 0,6-0,9 µm de largura e 1,5-6,0 µm de</p><p>comprimento. Este microrganismo apresenta pouca tolerância ao sal, microaerofílico e com</p><p>melhor desenvolvimento em meios sólidos pela anaerobiose ou pressão reduzida de oxigênio.</p><p>As condições ótimas para a sua multiplicação são temperaturas de 35 a 40º C e valores de pH</p><p>na faixa de 5,5 a 6,0. Como microrganismo homofermentativo, produz quase exclusivamente</p><p>ácido lático a partir da degradação da glicose pela via de Embden-Meyerhof-Parnas, embora</p><p>também possa produzir acetaldeído (GOMES; MALCATA, 1999). Encontram-se</p><p>naturalmente na microbiota intestinal e no trato urogenital humano, apresentando como</p><p>principais funções: proteção contra patógenos, auxílio na hidrólise da lactose, aumento do</p><p>valor nutricional dos alimentos devido à síntese de nutrientes (vitaminas B6 e B12, niacina,</p><p>riboflavina e ácido fólico), estimulação da resposta imune intestinal e regulação dos níveis de</p><p>colesterol no organismo (AGGARWAL; SWAMI; KUMAR, 2013).</p><p>Dentre as cepas probióticas de Lactobacillus acidophilus, a La-14 é uma das mais</p><p>amplamente utilizadas atualmente.</p><p>Uma vasta gama de alimentos, incluindo fermentados e não fermentados, produtos</p><p>lácteos, sorvetes e sobremesas congeladas, sucos de frutas, manteiga, produtos à base de</p><p>cereais, reduzido teor de gordura, foram enriquecido em probióticos para serem avaliados</p><p>como possíveis transportadores destes microorganismos benéficos e serem colocados no</p><p>mercado. Até a presente data, entre os alimentos probióticos disponíveis no mercado, os</p><p>produtos lácteos fermentados e não fermentados ainda são os mais consumidos pela</p><p>população (DE PRISCO et al., 2016). Porém, evidências relatadas pelo consumo de</p><p>probióticos e os benefícios à saúde atribuídos a eles estão impulsionando o desenvolvimento</p><p>comercial de novos produtos, categorizados como alimentos funcionais, e compreendem cerca</p><p>de 60 a 70% de todo o mercado de alimentos funcionais disponíveis (TRIPATHY; GIRI,</p><p>2014).</p><p>Entretanto, o maior problema encontrado pelas indústrias na aplicação de bactérias</p><p>probióticas em alimentos funcionais está relacionado à manutenção e viabilidade destas</p><p>culturas que podem não sobreviver em número suficientemente alto quando submetidas a</p><p>determinadas condições, como por exemplo, o armazenamento em baixas temperaturas e a</p><p>passagem pelo trato gastrointestinal humano (KAILASAPATHY; RYBKA, 1997), por esses</p><p>fatos, pesquisas têm mostrado que as culturas podem ser significativamente protegidas através</p><p>da técnica de microencapsulação em uma série de substratos, que incluem proteínas do leite e</p><p>polissacarídeos</p><p>(GBASSI et al., 2009; GBASSI et al., 2011; ZHANG et al., 2015).</p><p>24</p><p>3.2 MICROENCAPSULAÇÃO</p><p>A microencapsulação é um excelente exemplo de microtecnologia aplicada à ciência</p><p>dos alimentos e biotecnologia, podendo ser aplicada com sucesso para encapsular compostos</p><p>bioativos, como bactérias, óleos essenciais e extratos vegetais contendo polifenóis com</p><p>propriedades antimicrobianas conhecidas a serem utilizados em embalagens para alimentos</p><p>(NAZZARO et al., 2012). É definida como uma tecnologia de ingredientes sensíveis,</p><p>incluindo (sólido, líquido ou gasoso) dentro de diversas matrizes desde que os ingredientes</p><p>sejam aprisionados ou cercados pelas matrizes protetoras (ANAL; SINGH, 2007).</p><p>Na década de 30, as primeiras pesquisas no campo da microencapsulação foram</p><p>realizadas pela empresa norte-americana National Cash Register Co., pelo pesquisador Barret</p><p>K. Green, que utilizou o método de coacervação complexa para a encapsulação de um</p><p>material sensível a mudanças de pH, produzindo mudança de cor, a empresa desenvolveu o</p><p>produto conhecido como papel carbono sem cor (FOOD INGREDIENTS BRASIL, 2013).</p><p>O material utilizado para recobrir a cápsula é denominado de membrana, material de</p><p>parede, fase externa ou matriz. Já o material que é encapsulado, é chamado de núcleo, agente</p><p>ativo, material de preenchimento, fase interna, ou carga útil. A microencapsulação forma</p><p>partículas geralmente muito pequenas tendo diâmetros de micrômetros (μm) ou nanômetros</p><p>(nm) (ZUIDAM; SHIMONI, 2009).</p><p>Em relação a morfologia das microcápsulas, a diferença vai depender do material de</p><p>núcleo e de parede e também da técnica utilizada. Em geral, as microcápsulas podem ser do</p><p>tipo mononucleares (microcápsulas), onde o material de parede reveste um único núcleo,</p><p>podendo também ser chamada de reservatório, ou polinucleares, definidas como partículas</p><p>que tem muitos núcleos revestidos com o material de parede, (micropartículas); ou também do</p><p>tipo matriz, que é polinucleada e tem o agente ativo disperso no material de parede</p><p>(ZUIDAM; SHIMONI, 2009), como mostra a Figura 1.</p><p>25</p><p>Figura 1 – Morfologia de diferentes partículas obtidas pelo processo de microencapsulação</p><p>Fonte: Adaptada de Thies (1995).</p><p>Na indústria de alimentos, a microencapsulação é empregada para revestir ingredientes</p><p>como: acidulantes, vitaminas, corantes, gorduras, sabores e aromas, como também é utilizada</p><p>para encapsular compostos bioativos, enzimas e bactérias probióticas. Na utilização em</p><p>alimentos, a função da microcápsula é conservar uma substância protegendo-a das condições</p><p>adversas do meio e adaptar sua liberação no momento desejado, sendo essas condições: luz,</p><p>umidade, oxigênio, interações com outros compostos e evaporação do material ativo</p><p>encapsulado (DESAI; PARK, 2005).</p><p>A microencapsulação de células bacterianas tem sido descrita por alguns autores</p><p>(SOHAIL et al., 2011; HOLKEM et al., 2016; ETCHEPARE et al., 2016) e o objetivo</p><p>principal, é a proteção dos microrganismos sob condições gastrointestinais e a vida útil das</p><p>mesmas. Outro desafio da microencapsulação é proteger estas células probióticas em</p><p>alimentos que não são normalmente considerados próprios para veicular esse tipo de</p><p>microrganismo, como por exemplo, produtos cárneos e de panificação (CAVALHEIRO et al.,</p><p>2016; ALTAMIRANO-FORTOUL et al., 2012).</p><p>Outro fator importante quando se trata de microencapsulação, é a seleção de materiais</p><p>de revestimento utilizados, bem como as tecnologias adotadas para a produção de cápsulas</p><p>probióticas, pois, essas escolhas refletem estritamente as propriedades morfológicas e</p><p>funcionais das cápsulas. Os materiais de revestimento desempenham um papel importante na</p><p>determinação do tamanho, morfologia, textura, porosidade e outras propriedades relevantes</p><p>das cápsulas que influenciam na proteção ou na segmentação da entrega de probióticos (DE</p><p>PRISCO et al., 2016).</p><p>O probiótico microencapsulado ideal seria aquele que se apresenta em forma de pó,</p><p>com facilidade de armazenamento e uma vida de prateleira longa, ou um gel úmido com</p><p>estabilidade em longo prazo, e, para a obtenção dessas partículas, a produção de probióticos</p><p>26</p><p>encapsulados se dá através de diversos tipos de técnicas, sendo as três maneiras principais:</p><p>extrusão, emulsão e secagem por atomização (ECHEPARE et al., 2016; HOLKEM et al.,</p><p>2016; NUNES et al., 2017).</p><p>Biopolímeros de grau alimentício (alginato, quitosana, pectina, amido, e as proteínas</p><p>do leite) são as matrizes mais investigados (ETCHEPARE et al., 2016; ZHANG et al., 2015;</p><p>GEBARA et al., 2013) e utilizadas para a encapsulação de células devido à sua eficácia na</p><p>proteção de probióticos ao abrigo de várias condições de estresse como por exemplo, o pH</p><p>gástrico, sais biliares, enzimas. A sua disponibilidade, baixo custo e biocompatibilidade são</p><p>requisitos relevantes também.</p><p>3.3 EXTRUSÃO ⁄ GELIFICAÇÃO IÔNICA EXTERNA</p><p>Dentre as técnicas de microencapsulação de probióticos, a extrusão ou gelificação</p><p>iônica externa é a mais popularmente empregada para a obtenção de micropartículas</p><p>(RIBEIRO et al., 2014). O método físico baseia-se na gelificação externa do biopolímero</p><p>utilizado, geralmente polissacarídeos como pectina e o alginato de sódio, e consiste na</p><p>extrusão gota a gota, através de uma pipeta de calibre reduzido ou de uma seringa, em uma</p><p>solução de cloreto de cálcio (CaCl2). A gelificação ocorre quando os polímeros entram em</p><p>contato com os íons, que através da interação das diferentes cargas formam as microcápsulas</p><p>(SMRDEL et al., 2008).</p><p>As partículas devem permanecer em torno de 30 minutos em contato com a solução</p><p>iônica para atingir estabilidade e resistência mecânica, além do mais, o tempo que estas</p><p>partículas permanecem nesta solução está diretamente relacionado com a espessura da parede</p><p>da cápsula e conseqüentemente com a sua resistência à ruptura mecânica (PASQUALIM</p><p>et al., 2010).</p><p>A produção de micropartículas sem a utilização de solventes orgânicos torna a técnica</p><p>crescente e promissora, especialmente para a encapsulação de fármacos, células vivas</p><p>imobilizadas e para inclusão de compostos de interesse em alimentos (PATIL et al., 2010;</p><p>ETCHEPARE et al., 2016). O esquema do método de microencapsulação de probióticos por</p><p>gelificação iônica externa encontra-se na Figura 2:</p><p>27</p><p>Figura 2 – Esquema do método de gelificação iônica externa</p><p>Fonte: Adaptado de Krasaekoopt, Bhandari e Deeth (2000).</p><p>Em presença de cálcio e outros íons divalentes, o polissacarídeo pode, através de um</p><p>processo de ligação cruzada, trocar o íon de sua estrutura por um íon divalente, geleificando o</p><p>meio em que se encontra. O alginato de sódio, por exemplo, gelifica após ligação dos íons</p><p>bivalentes de cálcio aos blocos de ácido gulurônico das cadeias de alginato formando uma</p><p>rede tridimensional, constituindo o modelo da “caixa de ovos”, conforme Figura 3</p><p>(GOMBOTZ; WEE, 1998).</p><p>Figura 3 – Modelo caixa de ovos</p><p>Fonte: Corona-Hernandez et al. (2013).</p><p>Partículas produzidas por extrusão normalmente apresentam diâmetros que podem</p><p>variar de 500 μm a 3 mm (BUREY et al., 2008; KRASAEKOOPT et al., 2003) sendo que o</p><p>tamanho das partículas formadas é dependente do tamanho do diâmetro da agulha usada para</p><p>gotejar a solução, da viscosidade e concentração da solução, e da distância entre a seringa e a</p><p>solução de cloreto de cálcio (KRASAEKOOPT et al., 2003).</p><p>28</p><p>Maiores diâmetros, viscosidades e concentrações mais altas produzem partículas</p><p>maiores (GACESA, 1988). Por estes fatos, foram desenvolvidas variantes do método.</p><p>Algumas destas consistem na utilização de um sistema de pressão para forçar a saída do</p><p>alginato através de um aerógrafo para dispersar as gotas da extremidade com o qual se</p><p>obtiveram partículas com menos de 70 μm, conforme figura 4 (ETCHEPARE et al., 2016):</p><p>Figura 4 – Esquema do processo de microencapsulação utilizando</p><p>um aerógrafo acoplado a</p><p>um compressor de ar</p><p>Fonte: Etchepare et al. (2016).</p><p>Para aplicações em alimentos, o diâmetro médio das micropartículas, é uma das</p><p>características mais importantes, sendo que estas devem ser suficientemente pequenas, para</p><p>evitar um impacto sensorial negativo, sendo o tamanho desejável de aproximadamente</p><p>100 μm (HEIDEBACH et al., 2009).</p><p>Outra característica das microcápsulas formadas através do método de gelificação</p><p>iônica externa é que as mesmas apresentam-se porosas e o material encapsulado pode ser</p><p>eliminado, através da lixiviação ou da difusão do mesmo. Para evitar este problema, um</p><p>posterior revestimento das microcápsulas pode reduzir na cápsula, apresentando assim, uma</p><p>maior estabilidade e proteção. Por isso, pode-se utilizar métodos combinados para melhorar a</p><p>estabilidade da microcápsula, sendo a interação eletrostática muito utilizada para recobrir a</p><p>cápsula com um outro polieletrólito de carga oposta. Em geral, uma proteína, ou de forma</p><p>inversa, produzindo uma partícula com a proteína e posterior recobrimento com um</p><p>polissacarídeo de carga oposta (CHÁVARRI et al., 2010; LI; McCLEMENTS, 2011).</p><p>29</p><p>3.4 ALGINATO</p><p>O alginato de sódio é o polissacarídeo mais utilizado como material encapsulante de</p><p>bactérias ácido lácticas, devido a facilidade de manejo, natureza não tóxica e baixo custo</p><p>(SULTANA et al., 2001; MOKARRAM et al., 2009; ETCHEPARE et al., 2016) além de</p><p>aumentar a viabilidade dessas bactérias quando submetidas a diferentes condições ao serem</p><p>comparadas com bactérias não encapsuladas (ANAL; SINGH, 2007).</p><p>É um aditivo alimentar comercialmente aceitável, apresentando-se como um pó branco</p><p>pálido ou marrom amarelado, inodoro e insípido. Consiste principalmente do sal sódico do</p><p>ácido algínico, ou seja, uma mistura de ácidos poliurônicos composto de resíduos de ácido</p><p>D-manurônico e ácido L-gulurônico (ROWE et al., 2009), conforme pode-se observar na</p><p>Figura 5.</p><p>Figura 5 – Estrutura química do alginato de sódio</p><p>a) ácido manurônico, b) ácido gulurônico</p><p>Fonte: Franchetti e Marconato (2006).</p><p>Suas propriedades funcionais são definidas pela sua composição, estrutura, e massa</p><p>molar, sendo que sua solubilidade em água está relacionada com a taxa de dissociação. O pKa</p><p>do alginato é de aproximadamente 3,5, sendo que em pH muito baixo, ambos os componentes</p><p>estruturais, ácido manurônico e gulurônico precipitam na forma de ácido algínico. A</p><p>composição e sequência das cadeias são importantes devido à seletividade da ligação</p><p>catiônica sobre o gel formado, pois os cátions bivalentes preferencialmente se ligam ao bloco</p><p>do ácido gulurônico. A força da ligação depende tanto da natureza dos cátions, como das</p><p>propriedades do polímero, sendo que a gelificação do alginato pode acontecer rapidamente em</p><p>contato com uma solução de cálcio (LI; McCLEMENTS, 2011).</p><p>Porém, uma desvantagem desse polissacarídeo é a formação de poros na superfície das</p><p>cápsulas, tornando-as sensíveis as condições ácidas do meio (MORTAZAVIAN et al., 2007).</p><p>Para suprir esse problema, alguns pesquisadores têm recoberto as cápsulas usando uma</p><p>combinação desse polissacarídeo com outros compostos poliméricos, a fim de garantir um</p><p>30</p><p>maior efeito protetor aos microrganismos (KRASAEKOOPT; BHANDARI; DEETH, 2004;</p><p>GBASSI et al., 2009; CHÁVARRI et al., 2010).</p><p>3.5 INTERAÇÕES ELETROSTÁTICAS</p><p>A interação eletrostática ocorre quando biopolímeros que possuem cargas opostas</p><p>interagem entre si. Normalmente, os sistemas de biopolímeros utilizados contêm uma</p><p>molécula protéica como polieletrólito positivo e uma molécula de polissacarídeo como</p><p>polieletrólito negativo. Neste contexto, surgiu o método chamado de layer-by-layer que foi</p><p>aplicado à área de microencapsulação, para a produção de multicamadas de polieletrólitos. A</p><p>técnica fundamenta-se quando ocorre a adsorção consecutiva de camadas alternadas de</p><p>polieletrólito carregado positivamente e negativamente sobre uma partícula modelo e tem</p><p>como força matriz a interação eletrostática (KREFT et al., 2007; JUN-XIA et al., 2011).</p><p>A interação eletrostática entre os biopolímeros apresenta situação otimizada quando</p><p>existe equilíbrio entre cargas positivas e negativas, de modo que a maior parte dos sítios</p><p>ativos esteja ligada, ou seja, na faixa de pH acima do pKa da polissacarídeo e abaixo do ponto</p><p>isoelétrico da proteína, onde o sistema possa apresentar uma quantidade de cargas similares,</p><p>porém de sinais opostos (SCHMITT et al., 2000; LIU et al., 2007).</p><p>Policátions, como por exemplo, a quitosana, poli lisina, e proteínas do soro de leite,</p><p>além de diminuírem a porosidade do gel, formam um complexo forte com alginatos que são</p><p>estáveis na presença de agentes quelantes de Ca</p><p>2+</p><p>. A agregação destes compostos com</p><p>alginato de cálcio leva ao desenvolvimento de cápsulas mais estáveis permitindo a formação</p><p>de uma dupla parede na microcápsula (GOMBOTZ et al., 1998).</p><p>A técnica de multicamada como um método para a estabilidade das microcápsulas</p><p>vem sendo estudada. Esta técnica envolve a formação de camadas múltiplas de biopolímeros</p><p>na interface usando uma técnica de deposição eletrostática camada-por-camada (LBL)</p><p>(GRIGORIEV et al., 2009). Estudos tem mostrado que esta abordagem de construção de</p><p>multicamadas pode ser utilizada para melhorar a estabilidade das partículas e controlar a</p><p>liberação do material encapsulado (ANNAN; BORZA; TRUELSTRUP HANSEN, 2008),</p><p>como pode-se observar na Figura 6.</p><p>31</p><p>Figura 6 – Esquema para a montagem de micropartículas com recobrimentos layer by layer</p><p>(A) Um modelo de carga positiva é preparado por extrusão, depois a lavagem de qualquer excesso não</p><p>adsorvido. (B) o alginato carregado negativamente e a proteína carregada positivamente pode ser adsorvido</p><p>sequencialmente. (C) a proteína carregada positivamente e o alginato carregado negativamente podem ser</p><p>adsorvido sequencialmente. (D-E) Este passo pode ser repetido à vontade.</p><p>Fonte: Rossier Miranda (2012).</p><p>O efeito de micropartículas de alginato revestidas com três tipos de quitosanas de</p><p>diferentes pesos moleculares na sobrevivência de Lactobacillus bulgaricus KFRI 673 em suco</p><p>gástrico simulado, sucos intestinais e estabilidade durante o armazenamento a 4 e 22°C foi</p><p>investigado por Lee et al. (2004). Os autores concluíram que a microencapsulação com</p><p>alginato e quitosana oferece um melhor revestimento e um meio mais eficaz de entrega</p><p>bacteriana viável para o cólon, além de manter a sobrevivência durante o armazenamento</p><p>refrigerado, principalmente com quitosana de alto peso molecular.</p><p>Gbassi et al. (2009) utilizaram proteína de soro de leite para recobrir micropartículas</p><p>de alginato contendo culturas probióticas de Lactobacillus plantarum. Em testes de sistema</p><p>gástrico simulado. As cápsulas com revestimento apresentaram uma proteção muito mais</p><p>efetiva na viabilidade probiótica, do que as cápsulas sem o revestimento de proteína de soro</p><p>de leite, demonstrando que este material é eficiente para o recobrimento de microcápsulas</p><p>com intuito de maior viabilidade celular.</p><p>De Prisco et al. (2015), encapsularam Lactobacillus reuteri em alginato e em um</p><p>complexo de quitosana-alginato pela técnica de extrusão com o objetivo de melhorar a sua</p><p>tolerância a ambientes adversos. Os autores obtiveram um rendimento de 97% de</p><p>encapsulação e o estudo comprovou que as microcápsulas a base de alginato melhoraram a</p><p>sobrevivência de L. reuteri durante o armazenamento e a exposição a trato gastrointestinal e</p><p>condições de estresse osmótico, concluíram ainda que, o co-encapsulamento do probiótico em</p><p>quitosana-alginato, aumentou a sobrevivência dos probióticos.</p><p>32</p><p>3.6 PROTEÍNAS DO SORO DO LEITE</p><p>Considerando o grande volume de soro do leite produzido diariamente, o seu alto valor</p><p>nutricional e a poluição ambiental associada ao destino inadequado deste subproduto, as</p><p>indústrias têm buscado alternativas</p><p>viáveis para a sua utilização. Pesquisas que comprovam</p><p>que as propriedades das proteínas do soro de leite são altamente benéficas por ser uma fonte</p><p>rica de peptídeos bioativos que podem desempenhar um papel no manejo dietético de doenças</p><p>crônicas (OLIVEIRA et al., 2012).</p><p>A eficácia biológica da proteína do soro do leite é uma função da sua técnica de</p><p>processamento. As proteínas do soro são geralmente comercializadas em três formas:</p><p>concentrado proteico de soro de leite (WPC) que são obtidos a partir do soro de leite por</p><p>ultrafiltração; isolado proteico de soro do leite (WPI) obtidos por filtração subsequente ou</p><p>troca iónica, seguida de secagem e hidrolisado proteico de soro de leite (FOX;</p><p>MCSWEENEY, 2003; SINGH; YE, 2009; SOUSA et al., 2012).</p><p>O concentrado proteico do soro do leite tem gordura e lactose juntamente com a</p><p>essência da proteína (29-89%) (BOUNOUS, 2000); o isolado é feito de 90% de proteína</p><p>(HAYES; CRIBB, 2008) e o hidrolisado é a forma semi-digerida da proteína (KANDA et al.,</p><p>2013).</p><p>Estas proteínas têm inúmeros benefícios para a saúde por conter uma infinidade de</p><p>componentes saudáveis, como aminoácidos essenciais, péptidos bioativos, antioxidantes e</p><p>imunopotenciadores que reforçam a imunidade durante o início da vida e, assim, impedem</p><p>muitas complicações imunológicas (BADR; MOHANY; METWALLI, 2011). A adição</p><p>destas proteínas na dieta e suplementos têm o potencial de prevenir muitas doenças causadas</p><p>pelo desequilíbrio metabólico. Diversos estudos relatam o poder antioxidante,</p><p>anti-hipertensivo (KORHONEN, 2009), anticancerígeno, antidiabético, anti-obesidade e</p><p>cardioprotetor que as mesmas possuem (BALLARD et al., 2013; PATEL, 2015).</p><p>Além das propriedades funcionais das proteínas do soro do leite, este subproduto</p><p>apresenta excelentes propriedades tecnológicas. Na forma em pó, o uso do soro de leite</p><p>permite intensificar o desenvolvimento de cor durante o cozimento de produtos cárneos</p><p>embutidos (DAGUER et al., 2010), aumentar o volume dos pães e bolos e atuar como veículo</p><p>anti-aglutinante em misturas secas (ZAVAREZE et al., 2010). Já nos sorvetes e sobremesas</p><p>lácteas, o uso do soro doce é associado à formação de espumas estáveis e aumento da aeração</p><p>do produto (CALDEIRA et al., 2010) além de melhoria da textura de doces de leite</p><p>(VIOTTO; MACHADO, 2007).</p><p>33</p><p>Além de estas proteínas apresentarem grandes aplicações na indústria de alimentos,</p><p>também são utilizadas na indústria farmacêutica e cosmética, como biopolímeros</p><p>biodegradáveis apresentando ampla utilidade, tanto na produção de partículas nanômetrica</p><p>como micrométrica, que são utilizadas para proteger drogas, lipídios, vitaminas, minerais, e</p><p>compostos bioativos em sistemas de entrega controlada (JONES; DECKER; McCLEMENTS,</p><p>2010; GIRARD; TURGEON; GAUTHIER, 2003).</p><p>Se tratando de microencapsulação, as proteínas do soro de leite estão sendo bastante</p><p>empregadas como material de revestimento. O microrganismo Lactobacillus rhamnosus CRL</p><p>1505 foi revestido com sucesso em proteína do soro do leite e pectina segundo Gerez et al.</p><p>(2012). Além disso, Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium estabilizaram-se com</p><p>proteínas do soro de leite e pectina quando adicionados em iogurte (WALSH; CHENG; GUO,</p><p>2014). A combinação de proteína do soro do leite e alginato efetivamente melhorou a</p><p>viabilidade de Saccharomyces boulardii demonstrando um aumento significativo de 40% na</p><p>sobrevivência quando comparado à levedura na forma livre (DUONGTHINGOC et al., 2013).</p><p>Gerez et al. (2012) descobriram que Lactobacillus rhamnosus CRL 1505 em partículas</p><p>de pectina revestidas com proteína de soro de leite melhorou a sobrevivência do</p><p>microorganismo depois da exposição a condições gastrointestinais simuladas quando em</p><p>comparação com células bacterianas livres. Em outro estudo, as partículas de alginato de</p><p>sódio revestidas com proteína de soro de leite aumentou a sobrevivência de Lactobacillus</p><p>plantarum durante a exposição ao trato gastrointestinal quando comparado com as</p><p>micropartículas sem revestimento (GBASSI et al., 2009).</p><p>3.7 LIOFILIZAÇÃO</p><p>A Liofilização é um método frequentemente aplicado na indústria farmacêutica e de</p><p>alimentos visando proteger vários compostos bioativos contra diversos fatores físico-químicos</p><p>(SOLANKI et al., 2013). É um processo no qual uma substância é previamente congelada e</p><p>então a quantidade de água é reduzida, primeiro por sublimação e posteriormente por</p><p>dessorção, para valores que impeçam atividade biológica e reações químicas.</p><p>Durante o processo, o material a ser liofilizado passa pelos processos de congelamento</p><p>inicial, secagem primária e secagem secundária (MARQUES, 2008). Também denominada</p><p>por outras nomenclaturas como criodesidratação ou criosecagem, é um processo diferenciado</p><p>de desidratação de produtos, pois ocorre em condições especiais de pressão e temperatura,</p><p>possibilitando que a água previamente congelada (estado sólido) passe diretamente ao estado</p><p>34</p><p>gasoso (sem passar pelo estado líquido), ou seja, a mudança de estado físico ocorre por</p><p>sublimação (GARCIA, 2009).</p><p>O processo de liofilização se mostra eficiente comparado com outros meios de</p><p>desidratação, frente características como concentração do produto, perda de voláteis,</p><p>decomposição térmica, ações enzimáticas e desnaturação de proteínas, por isso merece</p><p>destaque (GARCIA, 2009). Na indústria de alimentos, os produtos naturais desidratados por</p><p>liofilização estão atualmente ocupando o mais alto patamar de qualidade e praticidade nos</p><p>meios industriais, substituindo com vantagens na praticidade os produtos “in natura” e em</p><p>qualidade, os produtos sintéticos (EBLSA, 2011).</p><p>Para secar bactérias ou probióticos encapsulados, a liofilização é uma das técnicas</p><p>amplamente utilizadas e é considerada como um processo de desidratação mais leve devido à</p><p>capacidade de manter um alto nível de viabilidade celular (CHEN et al., 2017). Alguns</p><p>probióticos, como Bifidobacterium Longum (AMINE et al., 2014), Bifidobacterium animalis</p><p>(DIANAWATI; SHAH, 2011) e Pediococcus acidilactici ATCC 8042 (HALIM et al., 2017)</p><p>foram encapsulados antes do processo de liofilização, para produzir uma forma probiótica</p><p>seca que seja mais fácil para o armazenamento a longo prazo.</p><p>As preparações liofilizadas apresentam mais vantagens do que as preparações feitas</p><p>com outras técnicas, em termos de preservação em longo prazo, juntamente com a</p><p>conveniência no manuseio, armazenamento, comercialização e aplicação. É o método mais</p><p>adequado e bem sucedido de preservação de bactérias probióticas, leveduras e fungos</p><p>esporulantes, reduzindo a atividade da água pela remoção de água (CHEN et al., 2017).</p><p>35</p><p>4 MATERIAIS E MÉTODOS</p><p>4.1 MATERIAIS</p><p>Os materiais utilizados foram: Alginato de Sódio (Vetec), concentrado proteico de</p><p>soro de leite (WPC – Alibra ingredientes LDTA), cloreto de cálcio (Vetec), culturas</p><p>probióticas Lactobacillus acidophilus (Danisco), ágar MRS (Himedia) e caldo MRS</p><p>(Himedia).</p><p>4.2 MÉTODOS</p><p>4.2.1 Preparo do inóculo</p><p>A cultura probiótica Lactobacillus acidophilus La-14 (Danisco) foi ativada em caldo</p><p>MRS (Himedia) e incubada durante 15 horas a 37°C. Após, foi centrifugada a 4670 x g por</p><p>15 minutos e lavada em solução de NaCl (0,85%). As células foram então suspensas na</p><p>solução salina para obtenção de uma solução com aproximadamente 12 log UFC g</p><p>-1</p><p>.</p><p>4.2.2 Produção das microcápsulas</p><p>As micropartículas foram produzidas pela técnica de extrusão ⁄ gelificação iônica</p><p>externa, de acordo com Liserre, Ré e Franco (2007) e Etchepare et al. (2016) com adaptações.</p><p>Foram preparadas soluções de alginato de sódio 2,0%. Após a dispersão completa do</p><p>polímero, as culturas probióticas de L. acidophilus foram adicionados às soluções e foram</p><p>pulverizadas em 0,1 M CaCl2 (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil). Foi utilizado um bico</p><p>atomizador duplo fluido (0,1 mm) distante verticalmente em 12 cm da solução iônica, e</p><p>mantido sob pressão de ar de 0,125 kgf/cm. As partículas foram mantidas na solução de</p><p>cloreto de cálcio, por 30 minutos adicionais em agitação constante, após completa</p><p>atomização. Em seguida foram separadas em peneira de malha de aço, diâmetro de 53 μm, e</p><p>lavadas com água destilada estéril.</p><p>4.2.3 Partículas com multicamadas</p><p>Para a produção das partículas com multicamadas, as mesmas foram transferidas</p><p>para as soluções de concentrado proteico de soro de leite (WPC), nas concentrações de 2,5 e</p><p>36</p><p>4% e alginato de sódio (0,125%), sequencialmente, onde foram mantidas imersas sob agitação</p><p>magnética constante (500 rpm) por 30 e 60 minutos, respectivamente, em temperatura</p><p>ambiente, seguindo metodologia proposta por Annan, Borba e Hansen (2008) com</p><p>adaptações. Os tratamentos desenvolvidos para análises estão descritos na tabela 1</p><p>Tabela 1 – Tratamentos desenvolvidos</p><p>Tratamentos Composição</p><p>AO Micropartículas de alginato</p><p>A1</p><p>Micropartículas de alginato com um</p><p>revestimento de WPC 4%</p><p>A2</p><p>Micropartículas de alginato com um</p><p>revestimento de WPC 4% e um</p><p>revestimento de alginato 0,125%</p><p>A3</p><p>Micropartículas de alginato com um</p><p>revestimento de WPC 4%, um revestimento</p><p>de alginato 0,125%, e um revestimento de</p><p>WPC 2,5%</p><p>4.2.4 Eficiências da encapsulação</p><p>A eficiência da encapsulação foi realizada conforme metodologia proposta por</p><p>Doherty et al. (2011), através da fórmula EE = N/N0 x 100, onde N = log UFC da cápsula e</p><p>N0 = log UFC da cultura adicionada ao material de cápsula.</p><p>4.2.5 Liofilização</p><p>As micropartículas produzidas foram congeladas (18° C por 24 h) no mesmo dia em</p><p>que foram produzidas. As micropartículas congeladas foram liofilizadas em um liofilizador</p><p>modelo Liotop L101 (Sao Carlos, São Paulo, Brazil) e foram retiradas do equipamento após</p><p>24 horas (vácuo: 0.200 -0.300 mHg e temperatura do condensador de 37° C).</p><p>4.2.6 Viabilidade de Lactobacillus acidophilus La-14 microencapsulados após o processo</p><p>de liofilização</p><p>Foram realizadas análises microbiológicas antes e após o processo de liofilização para</p><p>avaliar a sobrevivência do microrganismo. A contagem de células viáveis foi realizada</p><p>conforme descrito na seção 4.2.9.</p><p>37</p><p>4.2.7 Caracterização morfológica das microcápsulas: Microscopia ótica e eletrônica de</p><p>varredura</p><p>A microscopia ótica das micropartículas úmidas foi realizada utilizando um</p><p>microscópio modelo (Carl Zeiss Axio Scope. A1, Oberkochen, Germany) equipado com uma</p><p>camêra digital Axio Cam MRc (Carl Zeiss) A morfologia das micropartículas liofilizadas foi</p><p>avaliada em microscópio eletrônico de varredura da marca JEOL, modelo JM6360.</p><p>4.2.8 Avaliação do diâmetro médio e distribuição de tamanho das microcápsulas</p><p>O tamanho médio das micropartículas úmidas e liofilizadas foi medido no</p><p>equipamento Mastersizer 3000 (Malvern, Alemanha).</p><p>4.2.9 Contagem das células viáveis</p><p>Foram transferidas alíquotas de 1,0 ml de diluições adequadas, em triplicata, para</p><p>placas de petri esterilizadas. Após foi vertido meio de cultura MRS Ágar (Himedia). A</p><p>incubação foi realizada a 37º C por 72 horas em jarras de anaerobiose contendo gerador de</p><p>anaerobiose (Oxoid). O preparo de diluição das micropartículas consistiu em pesar 1 g de</p><p>micropartícula úmida e 0,1g de micropartícula liofilizada e adicionar 9 ml de solução tampão</p><p>fosfato estéril (pH 7,5), de acordo com metodologia descrita por Sheu, Marshall e Heymann</p><p>(1993).</p><p>4.2.10 Estabilidade das micropartículas frente às condições gastrointestinais simuladas</p><p>O método proposto por Madureira et al. (2011) com modificações, foi utilizado para</p><p>simular as condições gastrointestinais. A viabilidade das bactérias foi determinada em meios</p><p>que simulam diferentes seções do trato gastrointestinal, sendo eles, esôfago/estômago,</p><p>duodeno e íleo. Inicialmente, para a etapa de simulação que compreende o esôfago/estômago</p><p>uma solução contendo 25 mg mL</p><p>-1</p><p>de pepsina (Sigma) foi preparada em 0,1 M de HCl. Após,</p><p>alíquotas iguais foram adicionadas, a uma taxa de 0,05 mL mL</p><p>-1</p><p>durante 90 minutos, sendo o</p><p>pH ajustado para 2,0 com HCl 1M. Para a etapa de simulação de passagem através do</p><p>duodeno, uma solução contendo 2 g L</p><p>-1</p><p>de pancreatina (Sigma) e 12 g L</p><p>-1</p><p>de sais biliares</p><p>bovino (Sigma) foi preparada em NaHCO3 0,1 M e utilizada a uma taxa de 0,25 mL mL</p><p>-1</p><p>,</p><p>38</p><p>com pH ajustado para 5,0. Por fim, para simulação da passagem através do íleo o pH foi</p><p>ajustado para 6,5 utilizando uma solução 0,1 M de NaHCO3.</p><p>Todas as soluções foram preparadas no dia da análise e esterilizadas através de</p><p>membranas com tamanho de 0,20 µm (Millipore, Billerica, MA, EUA). A análise foi</p><p>conduzida em agitador Shaker modelo TE 421 (Tecnal, Piracicaba, SP, Brasil) com</p><p>temperatura mantida a 37 °C com o objetivo de simular a temperatura do corpo humano. A</p><p>agitação mecânica foi realizada em diferentes intensidades (130 rpm para o</p><p>esôfago/estômago, e 45 rpm para o duodeno e o íleo) a fim de simular os movimentos</p><p>peristálticos em cada seção do trato digestivo.</p><p>Por fim, alíquotas foram retiradas após 90 min (esôfago/estômago), 110 min</p><p>(duodeno) e de 200 min (íleo) para determinar a sobrevivência de Lactobacillus acidophillus</p><p>LA-14 livre e microencapsulados nos diferentes tratamentos. A enumeração das culturas</p><p>probióticas foi realizada em meio MRS, conforme descrito no item 4.2.9.</p><p>4.2.11 Estabilidade das micropartículas em relação à resistência térmica</p><p>A resistência ao estresse térmico foi avaliada como proposto por Zhang, Lin e Zhong</p><p>(2015) com adaptações. Assim, 1 g de micropartículas probióticas úmidas e 0,1g de</p><p>micropartículas probióticas liofilizadas nos diferentes tratamentos e 1 ml de cultura probiótica</p><p>livre, foram transferidas para 9 ml de água peptonada estéril em tubos de ensaio. O conteúdo</p><p>foi submetido a cinco diferentes condições térmicas (72°C por 15 segundos e 5 minutos, 63°C</p><p>por 30 minutos, 60 minutos e 120 minutos), e imediatamente arrefecido por imersão em gelo</p><p>durante 10 min. A partir das alíquotas coletadas foram feitas diluições seriadas conforme</p><p>descrito no item 4.2.9.</p><p>4.2.12 Estabilidade das micropartículas durante a estocagem em diferentes</p><p>temperaturas</p><p>Com o objetivo de determinar a vida de prateleira das microcápsulas com e sem</p><p>recobrimentos, úmidas e liofilizadas, contagens serão realizadas semanalmente, com as</p><p>amostras armazenadas em frascos coletores estéreis a -18° C, 4° C e 25° C.</p><p>39</p><p>4.2.13 Análises Estatísticas</p><p>Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) utilizando o software</p><p>Statistica versão 7.0 (2004, Statsoft Inc., Tulsa, OK, EUA). As médias foram comparadas</p><p>pelo teste de Tukey, considerando o nível de significância de 5% (p<0,05). Todos os dados</p><p>foram realizados em triplicata; Os resultados estão expressos em médias ± desvios-padrão.</p><p>41</p><p>5 ARTIGOS CIENTÍFICOS INTEGRADOS</p><p>5.1 ARTIGO 1 – MICROENCAPSULATION OF PROBIOTICS USING SODIUM</p><p>ALGINATE</p><p>Esse artigo foi publicado no periódico Ciência Rural, ISSN 0103-8478, Área de</p><p>avaliação em Ciência de Alimentos, Classificação B2.</p><p>5.2 ARTIGO 2 – PRODUCTION, CHARACTERIZATION AND VIABILITY OF</p><p>PROBIOTIC MICROPARTICLES CONTAINING ALGINATE AND WHEY PROTEINS</p><p>IN MULTILAYER</p><p>Esse artigo foi submetido no periódico LWT - Food Science and Technology (online),</p><p>Área de avaliação em Ciência de Alimentos, Classificação A1.</p><p>5.3 ARTIGO 3 – PRODUCTION, CHARACTERIZATION AND VIABILITY OF</p><p>LYOPHILIZED PROBIOTIC MICROPARTICLES CONTAINING ALGINATE AND</p><p>WHEY PROTEINS IN MULTILAYER</p><p>Esse artigo será submetido no periódico JFF – Journal Functional Foods (online),</p><p>Área de avaliação em Ciência de Alimentos, Classificação A1.</p><p>43</p><p>5.1 ARTIGO 1 – MICROENCAPSULATION OF PROBIOTICS USING SODIUM</p><p>ALGINATE</p><p>44</p><p>45</p><p>46</p><p>47</p><p>48</p><p>49</p><p>50</p><p>51</p><p>5.2 ARTIGO 2 – PRODUCTION, CHARACTERIZATION AND VIABILITY OF</p><p>PROBIOTIC MICROPARTICLES CONTAINING</p><p>ALGINATE AND WHEY PROTEINS</p><p>IN MULTILAYER</p><p>52</p><p>53</p><p>54</p><p>55</p><p>56</p><p>57</p><p>58</p><p>59</p><p>60</p><p>61</p><p>62</p><p>63</p><p>64</p><p>65</p><p>66</p><p>67</p><p>68</p><p>69</p><p>70</p><p>71</p><p>72</p><p>73</p><p>74</p><p>75</p><p>76</p><p>77</p><p>5.3 ARTIGO 3 – PRODUCTION, CHARACTERIZATION AND VIABILITY OF</p><p>LYOPHILIZED PROBIOTIC MICROPARTICLES CONTAINING ALGINATE AND</p><p>WHEY PROTEINS IN MULTILAYER</p><p>78</p><p>79</p><p>80</p><p>81</p><p>82</p><p>83</p><p>84</p><p>85</p><p>86</p><p>87</p><p>88</p><p>89</p><p>90</p><p>91</p><p>92</p><p>93</p><p>94</p><p>95</p><p>96</p><p>97</p><p>98</p><p>99</p><p>100</p><p>101</p><p>102</p><p>103</p><p>6 DISCUSSÃO GERAL</p><p>6.1 EFICIÊNCIAS DE ENCAPSULAÇÃO DAS PARTÍCULAS ÚMIDAS (EE)</p><p>A microencapsulação de L. acidophilus La-14 por gelificação iônica externa utilizando</p><p>alginato de cálcio como material de parede (2%) e multicamadas de WPC (2,5% e 4%) e</p><p>alginato de sódio (0,125%) resultou em um rendimento elevado de microencapsulação, acima</p><p>de 80% para todos os tratamentos. O alto rendimento de encapsulação observado neste estudo</p><p>deve-se as condições amenas de encapsulação utilizadas tais como, temperatura ambiente (25°</p><p>C) e sem a utilização de solventes orgânicos. Em relação às multicamadas, a EE do tratamento</p><p>A1 foi significativamente maior do que os outros tipos de tratamentos. Esses resultados</p><p>corroboram com Doherty et al. (2011) que explica que melhores resultados são obtidos</p><p>quando combinados com um revestimento de proteína de soro de leite devido a suas</p><p>propriedades funcionais, ou seja, à sua riqueza em resíduos de aminoácidos específicos que</p><p>proporcionam um ambiente protetor para os probióticos (SOUSA, 2013).</p><p>Estes resultados também se assemelham com Noshad et al. (2015) que encontraram</p><p>menor eficiência nas partículas com três camadas (isolado proteico de soja, amido e</p><p>quitosana). A menor eficiência deve-se provavelmente ao aumento da viscosidade da solução</p><p>que reduz a retenção do material encapsulado e da incorporação de quitosana. A alta</p><p>eficiência de encapsulação pode estar relacionada com o número de camadas, uma vez que a</p><p>maior liberação foi diretamente proporcional ao menor número de camadas proteicas, como</p><p>encontrado no presente estudo.</p><p>6.2 VIABILIDADE DE Lactobacillus acidophilus LA-14 MICROENCAPSULADOS APÓS</p><p>O PROCESSO DE LIOFILIZAÇÃO</p><p>Durante o processo de liofilização, a formação de cristais de gelo e a remoção de água</p><p>podem causar danos à membrana celular bacteriana e às proteínas da superfície, levando à</p><p>morte de probióticos (CHEN et al., 2014). Neste estudo, a menor redução logarítmica de</p><p>viabilidade dos probióticos microencapsulados após a liofilização foi de 0,63 log UFC g</p><p>-1</p><p>para o tratamento A3, o qual possuía o maior número de camadas na partícula. Portanto, a</p><p>proteção fornecida pelo maior número de multicamadas foi satisfatória neste estudo. Os</p><p>demais tratamentos obtiveram uma redução máxima de 1,4 log UFC g</p><p>-1</p><p>.</p><p>104</p><p>Estudos demonstram que as proteínas do soro do leite, em combinação com outros</p><p>materiais, como o alginato, por exemplo, podem melhorar a sobrevivência das células</p><p>bacterianas durante o processo de secagem (CHEN et al., 2017), formando uma camada</p><p>viscosa na superfície, podendo inibir o crescimento de cristais de gelo e estabilizar os</p><p>componentes da membrana celular, amenizando os danos do processo de liofilização (CHEN</p><p>et al., 2014; CHEN et al., 2017), como mostrado neste estudo.</p><p>6.3 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DAS MICROPARTÍCULAS ÚMIDAS E</p><p>LIOFILIZADAS</p><p>Independentemente do tipo de micropartícula analisada, a morfologia das partículas</p><p>úmidas foi semelhante para todos os tipos de tratamentos. Apresentaram forma esférica,</p><p>mostrando os microrganismos homogeneamente espalhados por toda a partícula. Foi possível</p><p>verificar a presença de alginato (encapsulante) e microrganismos (material ativo) em todo</p><p>interior da micropartícula caracterizando esta como do tipo matricial, ou seja, o material ativo</p><p>não está somente localizado no centro e sim em todo o seu interior (ETCHEPARE et al.,</p><p>2016), podendo estar inclusive na superfície. As multicamadas de WPC e alginato não</p><p>alteraram a aparência das micropartículas analisadas.</p><p>Em relação às partículas liofilizadas, a partir das imagens do microscópio eletrônico</p><p>de varredura, observou-se que o tratamento A0, apresentou os probióticos mais expostos,</p><p>quando comparado aos outros tratamentos, demonstrando assim que, quanto maior o número</p><p>de camadas nas partículas, menos expostos e visíveis se encontram os probióticos</p><p>encapsulados.</p><p>Neste trabalho, o processo de liofilização causou o encolhimento das cápsulas e</p><p>resultou em formas irregulares. A superfície irregular foi devido à perda de água durante o</p><p>processo de liofilização. Esses resultados corroboram com os encontrados por Chen et al.</p><p>(2017), ao encapsular Lactobacillus bulgaricus em matriz de isolado proteico de leite com</p><p>revestimento de alginato.</p><p>6.4 AVALIAÇÃO DO DIÂMETRO MÉDIO E DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DAS</p><p>MICROPARTÍCULAS ÚMIDAS E LIOFILIZADAS</p><p>O tamanho de partícula é um parâmetro importante que pode influenciar as</p><p>características sensoriais dos alimentos quando incorporados. Neste estudo, os diâmetros das</p><p>105</p><p>micropartículas úmidas com multicamadas situaram-se entre 107 µm e 222 µm. A</p><p>micropartícula A0 apresentou tamanho médio de 107 µm. Com a formação de uma camada</p><p>(A1) sobre a superfície da A0 (micropartícula de origem), os tamanhos médios ficaram em</p><p>133 µm para A1, 222 µm com a formação da segunda camada na micropartícula A2, e 185</p><p>µm com a formação da terceira camada na partícula A3. O aumento mais expressivo de</p><p>tamanho ocorreu com a formação da segunda camada de alginato (A2).</p><p>Quanto às partículas liofilizadas, o tratamento A0 apresentou tamanho médio de</p><p>264 µm. Com a formação de uma camada (A1) sobre a superfície da A0 (tratamento de</p><p>origem), os tamanhos médios ficaram em 124 µm para A1, 374 µm com a formação da</p><p>segunda camada no tratamento A2, e 325 µm com a formação da terceira camada no</p><p>tratamento A3.</p><p>Esta diferença de tamanho encontrada nos tratamentos A2 pode estar relacionada à</p><p>capacidade de hidratação dos polissacarídeos. Grupos laterais químicos como COO- e SO3-,</p><p>presentes em polissacarídeos podem interagir com as moléculas de água através de pontes de</p><p>hidrogênio (CROUZIER; BOUDOU; PICART, 2010), aumentando assim, o diâmetro da</p><p>cápsula.</p><p>Pode-se observar também, que quando as partículas com duas camadas de alginato</p><p>(A2) interagiram eletrostaticamente com o WPC da última camada (A3), ocorreu uma redução</p><p>no tamanho médio das partículas, em relação ao obtido anteriormente, porém, o tamanho</p><p>ainda permaneceu maior que o da partícula de origem (A0). Quando a proteína interage</p><p>eletrostaticamente com os grupos carboxílicos negativos do alginato, ocorrem ligações entre o</p><p>polímero (alginato) e as moléculas de água são reduzidas. Esse fato pode levar a desidratação</p><p>da película, possivelmente, expulsando parte da água presente na partícula (CROUZIER;</p><p>BOUDOU; PICART, 2010; SOUZA et al., 2014), reduzindo assim o seu tamanho.</p><p>6.5 VIABILIDADE DE Lactobacillus acidophillus LA-14 LIVRE E</p><p>MICROENCAPSULADOS NAS PARTÍCULAS ÚMIDAS E LIOFILIZADAS FRENTE ÀS</p><p>CONDIÇÕES GASTROINTESTINAIS SIMULADAS</p><p>No início da digestão, a cultura livre apresentava contagem acima de 10</p><p>12</p><p>UFC g</p><p>-1</p><p>, no</p><p>entanto, após a exposição a suco gástrico simulado (pH 2,0/90 min) mostrou uma redução de</p><p>7,00 unidades logarítmicas. As bactérias probióticas encapsuladas nas partículas úmidas nos</p><p>tratamentos A0, A1, A2 e A3 apresentaram contagens de 2,88, 3,35, 3,35 e 3,91 UFC g</p><p>-1</p><p>,</p><p>respectivamente. No pH 5, o tratamento convencional (A0) liberou maior parte do seu</p><p>106</p><p>conteúdo comparado as micropartículas com revestimentos. Isso pode ter ocorrido, pela</p><p>porosidade existente em partículas de alginato</p>