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DESCRIÇÃO A relação entre os métodos de análise de qualidade e conservação dos alimentos com a segurança alimentar. PROPÓSITO Conhecer as técnicas de análise da qualidade dos alimentos, alinhadas com a legislação vigente e a aplicação de métodos de conservação para impedir a contaminação microbiana, para realizar adequadamente a manutenção da segurança alimentar, uma das atribuições do nutricionista, principalmente, os atuantes em unidade de alimentação e nutrição ou na indústria de alimentos. OBJETIVOS MÓDULO 1 Descrever conceitos de avaliação da qualidade em alimentos MÓDULO 2 Identificar os métodos de conservação em alimentos INTRODUÇÃO O profissional nutricionista tem como uma de suas atribuições a manutenção da segurança alimentar, que está relacionada à promoção de uma alimentação saudável e equilibrada e à preservação da qualidade do alimento, evitando enfermidades após o seu consumo. Para atender a tais objetivos, o nutricionista deve conhecer tanto as diretrizes estipuladas pela legislação vigente no país em que está atuando como as técnicas de análise necessárias para determinar a qualidade do alimento. Ao longo de todo o processo produtivo, transporte e manipulação, o alimento é exposto a perigos químicos, físicos e microbiológicos. O que será discutido neste conteúdo são as análises necessárias para avaliar a qualidade do alimento, identificando se ele poderá então ser consumido pela população e fazendo uma adequada interpretação desses resultados. Também serão abordados métodos de conservação que irão proteger o alimento da contaminação microbiana, promovendo, então, uma alimentação segura. MÓDULO 1 Descrever conceitos de avaliação da qualidade em alimentos CONCEITOS Com o aumento dos indivíduos no mercado de trabalho, há maior procura por alimentação em unidades de alimentação e nutrição comerciais, como restaurantes e lanchonetes. O menor tempo em casa faz necessária a maior comercialização de alimentos que facilitem o processo de cocção, como os alimentos minimamente processados, pré-assados, ou já temperados. Consequentemente, há maior consumo de alimentos manipulados, o que traz um risco para o consumidor, já que as mãos dos manipuladores são o maior veículo de contaminação microbiana. Desse modo, é cada vez maior a incidência de surtos alimentares decorrentes da ingestão de alimentos e bebidas contaminados com microrganismos patogênicos. AVALIAÇÃO DO RISCO Os avanços tecnológicos e as mudanças nos comportamentos da população influenciam o consumo de alimentos. Os tipos de alimentos e o modo como são consumidos, por exemplo, sofrem a influência da modernização e do aumento de pessoas trabalhando fora de casa, pois há uma procura maior por produtos com preparação mais rápida e por se alimentar na rua ou no trabalho. Com essas mudanças, ocorre alteração também no perfil de microrganismos contaminantes de alimentos. Foto: Shutterstock.com A segurança alimentar deve ser mantida em todas as etapas do processamento até o consumidor. A manutenção está relacionada com o controle dos fatores intrínsecos e extrínsecos de crescimento do microrganismo. Esse controle irá ajudar na determinação da vida de prateleira do produto. A primeira etapa da manutenção da segurança alimentar é a identificação de quais agentes podem ser encontrados no alimento e potencialmente podem causar danos ao consumidor, lembrando que esses agentes podem ser: Biológicos Microrganismos Físicos Pregos, fio de cabelo, pelos Químicos Pesticidas e toxinas A determinação dos agentes pode ser proveniente de estudos preliminares, a partir de órgãos de vigilância e relatos de casos e prevalência da saúde pública, agregados a informações como origem da contaminação e quantidade do agente. Imagem: Shutterstock.com Movimento angular ou rotação. Em relação ao alimento, é necessário avaliar a própria microbiota do alimento, a qualidade da matéria- prima, a influência das etapas de produção (processamento, manuseio, transporte, distribuição, envase etc.) e o preparo e consumo pelo consumidor, como o potencial de recontaminação. Imagem: Shutterstock.com Movimento angular ou rotação. Em relação ao microrganismo em si, devem ser avaliadas a dose infecciosa, ou seja, quantos microrganismos são necessários no alimento para causar um dano à saúde do indivíduo, a patogenicidade ou virulência do microrganismo, e a suscetibilidade do hospedeiro. Sabe-se que indivíduos com comorbidades, como diabetes e hipertensão, além de obesos, gestantes, crianças e idosos, possuem o sistema imunológico mais fragilizado e, portanto, maior risco de ter alguma enfermidade. Levando em conta todos esses fatores-limites de contagem microbiana, foram determinados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa), na Instrução Normativa (IN) no 60 e na Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) no 331, ambas de 2019, os padrões microbiológicos exigidos para alimentos comercializados no Brasil. Essas normas devem ser respeitadas ao longo de toda a cadeia produtiva e em todo alimento ofertado ao consumidor. MÉTODOS DE DETECÇÃO Os métodos de detecção são um conjunto de ações cujo objetivo é analisar amostras de alimentos e determinar a presença e a quantidade de bactérias patogênicas ou deteriorantes, além de suas toxinas. Essa determinação está relacionada com o atendimento à legislação vigente. Foto: Shutterstock.com A detecção de microrganismos em uma amostra de alimento não é uma tarefa fácil, já que a matriz alimentar é um ambiente dinâmico e as taxas de multiplicação da população microbiana e de morte celular podem variar por influência de diferentes condições de processo e armazenamento. Desse modo, é importante que a amostragem seja adequada, e deve ser entendido que o resultado obtido é um retrato daquele momento de amostragem. Outros fatores devem ser considerados no momento da análise, como a performance no momento da técnica de plaqueamento. Essa técnica é a mais usada na determinação de microrganismos em alimentos e consiste em plaquear alíquotas de diluições da amostra de alimento, com contagem de colônias após incubação. Mesmo sendo considerada uma técnica simples, os métodos de plaqueamento apresentam muitas variáveis que podem levar a erros na análise. A detecção de toxinas e vírus também pode ser um obstáculo nos métodos de análise mais utilizados, já que são agentes difíceis de serem detectados. EXEMPLO A enterotoxina da bactéria Staphylococcus, que é termoestável, é resistente à elaboração de leite em pó ou à pasteurização do leite, porém, por ser encontrada em baixas quantidades, é difícil de ser detectada. Outro fator que pode atrapalhar a detecção de microrganismos nos alimentos é a própria matriz alimentar, já que esta é heterogênea, principalmente, em alimentos sólidos, o que dificulta na amostragem a obtenção de uma amostra representativa de todo o lote em questão. O processo de amostragem tem como principal função evitar perdas econômicas, já que seria inviável economicamente analisar um lote inteiro. Por isso, a necessidade de uma amostra que seja representativa de um todo. A alternativa nos métodos de análise é fazer uso de amostragem randômica, ou seja, coletar amostras de forma aleatória dentro dos lotes produzidos e promover a análise microbiológica da maneira mais acertada possível, permitindo o isolamento de qualquer célula microbiana que possa estar na amostra. ATENÇÃO Baseado nesse aspecto, a etapa de homogeneização é de elevada importância na análise de alimentos, já que, normalmente, o microrganismo-alvo está em menor concentração no alimento, além de poder estar metabolicamente estressado. Portanto, com dificuldade de crescer em condições controladas. No alimento, o microrganismo não está distribuído de forma homogênea. Pode estar em apenas uma localização, sendo esta suficiente para desencadear uma enfermidade. O objetivo da etapa de homogeneização, seguida de diluição, é solucionaresses obstáculos na análise dos microrganismos em alimentos. Os métodos de análise microbiológica, conhecidos como tradicionais ou convencionais são baseados em contagem de placas, ou plaqueamentos. Apesar de ser considerado de simples execução, é um método trabalhoso, por necessitar de muito preparo e consistir em diversas etapas. Brevemente, o método de contagem em placas tem 2 aplicações principais: 1. Contagem de microrganismos aeróbios, que indica a carga microbiana total do alimento, acompanha a vida de prateleira do produto, serve de acompanhamento da segurança dos processos nas indústrias e gera informação para aceitação ou rejeição de lotes. 2. Determinação da presença de microrganismos de origem fecal, indicando a qualidade sanitária do processamento e manipulação do produto. A segurança do alimento só é confirmada quando há resultados negativos nas análises realizadas nos alimentos processados e nas matérias-primas utilizadas nas etapas. Desse modo, é necessário que os métodos de detecção sejam certificados pelas agências de segurança, além de serem robustos e confiáveis. Convencionais ou rápidos, os métodos levam pelo menos 24h para obtenção de resultado. Isso porque, necessitam da etapa de homogeneização da amostra e da diluição seriada, já que a concentração de microrganismos é desconhecida, seguida do plaqueamento em meios específicos, para que haja a contagem de colônias após a incubação. A contagem de colônias se dá por meio de contagem manual ou com contador automático das unidades formadoras de colônias que são visuais no ágar contido na Placa de Petri. A contagem de colônias segue um limite de confiança de 95% e deve seguir uma faixa de aproximação, como exposto no quadro abaixo. Contagem de colônias Intervalo com 95% de confiança para contagem Inferior Superior 3 < 1 9 5 2 12 10 5 18 12 6 21 15 8 25 30 19 41 50 36 64 100 80 120 200 172 228 320 285 355 Quadro: Distribuição da faixa de intervalo de confiança utilizado na contagem de colônias. Adaptado de Forsythe, 2002, p.206. EXEMPLO De acordo com a interpretação do quadro acima, por exemplo, uma contagem de colônias de resultado 12 unidades formadoras indica que o resultado real é na faixa de 6 a 25 colônias na placa em questão. Após a contagem e a obtenção de colônias isoladas, o processo de identificação microbiana segue com as análises físico-químicas. Dentre elas, a mais simples e amplamente utilizada é a coloração de Gram, que utiliza os reagentes: cristal violeta, lugol e fucsina; e é baseada na composição da parede celular das colônias obtidas. Desse modo, ocorre a diferenciação em microrganismos classificados como gram- positivo (roxo) ou gram-negativo (vermelho) quando estes apresentam uma maior ou menor camada de peptidioglicano, respectivamente. A observação da coloração e da conformação da colônia em bastonetes ou cocos é realizada em microscópio ótico, de preferência com lente de imersão com aumento de 1000 vezes, para melhor identificação. Outro teste bioquímico comumente utilizado é a detecção da enzima catalase, que é responsável por degradar o composto H2O2 (peróxido de hidrogênio). Os testes consistem em colocar sobre uma lâmina de microscopia uma gota de peróxido de hidrogênio e, sobre a gota, um esfregaço do crescimento da colônia que está sendo investigada. Se houver a formação de bolhas, pode-se compreender que ocorreu degradação do peróxido de hidrogênio com liberação do oxigênio. MÉTODOS CONVENCIONAIS DE ANÁLISE MICROBIOLÓGICA O processo de amostragem é determinante no sucesso da análise microbiológica. Dois tipos de amostragens mais utilizados para análises de superfícies são: Usar lâminas contendo meio de cultura seletivo ou não que pode ser pressionado sobre uma superfície. Promover o esfregaço com hastes flexíveis ou swabs. Em seguida, essas amostras podem ser incubadas de acordo com as características dos microrganismos-alvo. Porém, para amostras de alimentos, os procedimentos são diferentes. Os métodos convencionais ou tradicionais de análise microbiana envolvem etapas que são comuns aos métodos. Homogeneização A primeira etapa comum da análise que é a homogeneização, que é primordial, principalmente, para alimentos sólidos, de modo a tentar liberar a população microbiana da matriz alimentar. Para tal etapa, pode ser utilizado um equipamento chamado Stomacher ou homogeneizador. É importante lembrar que, a cada etapa da análise, recomenda-se a homogeneização das amostras ou das diluições. Pré-enriquecimento Em seguida, deve-se estimular o crescimento do microrganismo-alvo, utilizando meios de cultura que irão favorecer o crescimento de microrganismos que são alvo das análises e inibir o crescimento daqueles indesejáveis - a essa etapa é dado o nome de pré-enriquecimento. Geralmente, essa etapa é realizada utilizando em torno de 1 a 25g da amostra de alimento ou ingrediente, em 249 ou 225mL de meio rico, respectivamente. Quando o alimento for bifásico, ou seja, parte líquido e parte sólido, a amostra analisada deve ser representativa de ambas as fases. Após a homogeneização e o pré-enriquecimento, o alimento deverá ser diluído de forma seriada, já que não se sabe a quantidade de células viáveis disponíveis. Em seguida, cada diluição deverá ser plaqueada em meio sólido específico. Os métodos mais utilizados de plaqueamento são em superfície (spread plate) ou em profundidade (pour plate), como demonstrado na figura abaixo. Imagem: Macedo / Wikimedia Commons / licença (CC BY 4.0 International) Métodos de plaqueamento mais utilizados nas análises microbianas. Método em superfície Facilita a contagem de colônias, já que todas se encontram na área de cima da placa. Método em profundidade Pode aumentar a contagem de colônias, já que o inóculo está envolvido mais uniformemente pelo meio. Adiciona-se o fato de que, no fundo da placa, pode ser encontrado um meio com menor teor de oxigênio, favorecendo o crescimento de mais células microbianas. Após o espalhamento com alça de drigalski na superfície da placa ou da solidificação do meio plaqueado em profundidade, as placas de Petri devem ser incubadas por períodos que variam de 18 a 24h. Portanto, apesar de os métodos tradicionais serem sensíveis e econômicos, acabam se prolongando por um longo período. Os meios utilizados no plaqueamento são considerados seletivos e têm por objetivo distinguir os microrganismos-alvos dos indesejáveis, podendo ser também meios de diferenciação (quadro a seguir). Após a incubação e a contagem, recomenda-se o uso de meios de cultura não seletivos para observar a pureza das colônias isoladas. A partir das colônias isoladas, a identificação final dos microrganismos obtidos na amostra é realizada por meio de testes bioquímicos ou sorológicos. Microrganismos-alvo Meio de cultura Campylobacter jejuni Agar Campylobacter Salmonella spp. Água peptonada tamponada Caldo selenito-cisteína Caldo Rappaport-Vassiliadis RV semissólido modificado Salmonella e Shigella Agar verde brilhante Agar XLD Agar SS Coliformes Agar MacConkey Caldo lactosado E. coli Reagente MUG Listeria monocytogenes Caldo Fraser Agar Oxford Palcam Staphylococcus aureus Caldo Baird Parker Clostridium perfringes Agar perfringens Bacillus cereus PEMBA Quadro: Meios de cultura seletivos específicos para cada microrganismo considerado parte do protocolo-padrão estabelecidos por órgãos reguladores para isolamento de microrganismos patogênicos nos alimentos. Extraído de Forsythe, 2002, p. 231-232. As análises microbiológicas apresentam etapas específicas para cada microrganismo-alvo. Desse modo, além dos meios de cultura seletivos serem diferentes, algumas etapas também apresentam características individuais para alguns gêneros. Observe quatro exemplos de etapas das análises microbiológicas para diferentes microrganismos. CONTAGEM DE MICRORGANISMOS AERÓBIOS É utilizado um meio de cultivo de crescimento complexo contendovitaminas e proteínas hidrolisadas, permitindo a determinação da carga microbiana geral do alimento e o crescimento de microrganismos não fastidiosos, chamado APC (agar padrão de contagem, também conhecido como aerobic plate count). O método de plaqueamento mais utilizado é pour plate, com incubação a 30oC por 48 horas. SALMONELLA SPP. A Salmonella spp. é uma bactéria que pode ter muita gravidade nos sintomas e alto grau de letalidade quando se relaciona a surtos alimentares. O critério de garantia da segurança alimentar, para que um alimento seja apto para consumo, é não encontrar nenhuma célula de Salmonella em 25g de amostra (SHINOHARA et al., 2008). Baseado nesse aspecto, o protocolo de detecção possui diversos passos para tentar recuperar qualquer célula de Salmonella presente, mesmo partindo de baixas concentrações. O pré-enriquecimento permite a recuperação também de células que possam ter sido danificadas durante o processamento. Nessa etapa, é utilizada a água peptonada suplementada ou caldo lactosado, ambos considerados meios nutritivos e não seletivos. Se for uma amostra com alta concentração de bactérias gram-positivas, pode ser adicionado um inibidor de crescimento para essas células, conhecido como verde brilhante ou verde malaquita. Se a amostra for de um alimento que tenha ação bacteriostática, uma alternativa é adicionar ao meio de cultura tiossulfato de sódio. Após o pré-enriquecimento, segue a fase de enriquecimento seletivo com o meio de cultura indicado pelas agências de regulamentação, para reprimir o crescimento de outras células. Os meios seletivos para Salmonella são acrescidos de inibidores como bile, tetrationato ou bisselenito de sódio e corantes como verde brilhante ou verde malaquita. Outra ferramenta que seleciona o crescimento de Salmonella é a incubação à temperatura na faixa de 41-43°C. Os caldos seletivos mais utilizados são selenito cisteína, tetrationato e Rappaport, que também podem ser utilizados combinados. Ao fim do crescimento seletivo em caldo, esse crescimento segue em meio seletivo sólido para obtenção das colônias isoladas. A recomendação é de utilização dos mesmos meios a fim de evitar uma nova adaptação das células. Por fim, são realizados testes de confirmação bioquímica e sorológica para identificação das colônias de Salmonella, dentre os 2 mil sorotipos existentes. ENTEROBACTÉRIAS, COLIFORMES E E.COLI A E.coli e os microrganismos que fazem parte do grupo dos coliformes são detectados utilizando meio líquido, podendo ser o caldo verde brilhante ou caldo lauril sulfato, com posterior diferenciação por testes de produção de indol e produção de gás como resultado do metabolismo da lactose com produção de gás a 44°C. Os coliformes conhecidos como totais fermentam a lactose com produção de gás na temperatura de 37°C, já a E.coli e o grupo de coliformes termotolerantes, a 44°C. A produção de gás é observada com o aparecimento de bolhas de ar no tubo de Durhan emborcado no caldo de crescimento (figura). Essa técnica, denominada de Determinação do Número Mais Provável, ou Técnica dos Tubos Múltiplos, é uma maneira de determinar a quantidade aproximada de microrganismos utilizando 3 a 5 tubos. De acordo com a positividade encontrada nos tubos, seja pela produção de gás seja pela turvação do meio, o resultado é comparado em uma tabela e se estima a quantidade de coliformes na amostra. Após o crescimento seletivo, a identificação é feita em agar MacConkey, onde as colônias de E.coli apresentam coloração amarela devido ao indicador de pH vermelho neutro. Imagem: BP67Risa / Wikimedia Commons / licença (CC BY 3.0 Unported) Exemplo de tubo de Durham emborcado com e sem produção de gás devido ao metabolismo de fermentação da lactose no meio de cultura líquido de crescimento. STAPHYLOCOCCUS AUREUS O meio seletivo mais utilizado para o crescimento de S. aureus é denominado agar Baird Parker, que apresenta na sua composição o piruvato de sódio, que ajuda a recuperar células fragilizadas devido à exposição a processamento, e componentes que selecionam apenas o S.aureus, como o telurito, cloreto de lítio e glicina. O microrganismo-alvo reduz o telurito, que promove a formação de colônias pretas e hidrolisa a gema do ovo devido à presença de lipase, e a glicina atua como crescimento celular, além de fazer parte da estrutura da parede celular. Outro meio de cultivo muito utilizado para o crescimento de S. aureus é o agar Manitol Salgado, indicado principalmente para amostras de queijo. O componente que traz seletividade a esse meio é o teor de cloreto de sódio de aproximadamente 7,5%, que seleciona o S. aureus e ainda apresenta na sua composição o manitol, que, ao ser fermentado, leva à produção de ácidos e reduz o pH do meio, alterando a coloração do meio. O meio pode ainda ser adicionado de plasma sanguíneo de mamífero, para observar a ação da enzima coagulase que é encontrada em cepas patogênicas de S. aureus. MÉTODOS MODERNOS OU RÁPIDOS O objetivo do desenvolvimento de métodos diferentes dos convencionais consiste em tentar diminuir o tempo entre a coleta da amostra de alimento e a liberação do resultado. A maior alteração ocorre, principalmente, no encurtamento da etapa de enriquecimento convencional, utilizando processos de concentração, além de promover métodos de detecção mais rápidos. SEPARAÇÃO IMUNOMAGNÉTICA Tejada, Conceição e Timm (2019) utilizaram essa técnica para identificação de Campylobacter jejuni em amostras de frango. Utiliza partículas magnéticas revestidas de anticorpos específicas para o microrganismo-alvo. O microrganismo é capturado pelo anticorpo, mesmo estando em uma população microbiana mista por causa da especificidade entre o antígeno e o anticorpo. ATENÇÃO Esse processo promove a separação da molécula-alvo, podendo ser aplicado em toxinas e vírus também. A maior vantagem é que não há necessidade da etapa de enriquecimento. Existem kits no mercado já comercializados para detecção de Salmonella spp. e E.coli O157:H7 em água e alimentos. MEIOS DE CULTURA COM FLUOROGÊNICOS OU CROMOGÊNICOS Ao meio de cultivo tradicional, são adicionadas substâncias fluorogênicas e cromogênicas, que geram compostos brilhantes, coloridos ou fluorescentes, devido ao metabolismo bacteriano. O substrato mais utilizado é o 4-metilumbeliferona e o 4-metilumbeliferil-β-D-glicuronídeo (MUG). Outra forma é a utilização de meios semissólidos como o Rappaport-Vassiliadis e o agar DIASALM, que é específico para Salmonela. Ambos observam a motilidade bacteriana por observar a migração do microrganismo no meio. Outro sistema comercializado amplamente é o Petrifilm, fabricado pela empresa 3M. O sistema consiste em uma alternativa ao plaqueamento convencional. Ele consiste em um cartão com uma mistura de nutrientes e agentes geleificantes desidratados. Ao adicionar 1mL da suspensão com a amostra diluída, o meio é reidratado e permite o crescimento das colônias após incubação em temperatura e tempo característico. Utilizado para coliformes e E. coli. ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA) Análise baseada no uso de anticorpos monoclonais em placas (figura abaixo) que capturam o antígeno- alvo, utilizando a especificidade da ligação entre anticorpo e antígeno. A detecção ocorre utilizando um anticorpo-alvo que pode estar marcado com um componente que emite fluorescência ou com uma enzima que, ao reagir com um substrato, emite um sinal. Considerado um método rápido, já existe comercialmente testes de ELISA para Salmonella ssp. e Listeria monocytogenes. O limite de detecção do teste varia de 104 a 106UFC/mL, ou seja, em concentrações menores, não há detecção do patógeno. Desse modo, faz-se necessária uma fase de pré-enriquecimento, ou enriquecimento seletivo. Foto: Shutterstock.com Placa com 96 poços utilizada nos ensaios imunoenzimáticos. MEMBRANA FILTRANTE A amostra de alimento é homogeneizada e, em seguida, filtrada, utilizando uma membrana filtrante de acetato de celulose ounitrocelulose com porosidade de aproximadamente 0,22µm (micrômetros), que irá permitir a passagem de líquidos e reter os microrganismos. Ao fim da filtração, a membrana deve ser colocada na superfície de uma placa de Petri com meio de cultura, de acordo com a necessidade metabólica do microrganismo-alvo. Após incubação, a contagem é realizada visualmente ou por contadores automatizados. TESTES MINIATURIZADOS São testes bioquímicos comerciais realizados em recipientes pequenos, contendo meio de cultura desidratado ou liofilizado, ao adicionar o inóculo da amostra que está sendo analisada. O meio é hidratado e a reação do microrganismo promove uma alteração na cor do meio. Os kits podem apresentar muitos testes diferentes, permitindo uma análise precisa da amostra em questão. O descarte é considerado fácil, e a interpretação dos resultados é baseada em uma combinação de números, podendo ser feita manualmente ou utilizando programas de computador. Foto: Shutterstock.com Exemplo de teste miniaturizado disponível no mercado. Nas análises microbiológicas, alguns microrganismos podem sofrer danos estruturais devido à exposição ao calor, frio, processos de secagem, congelamento ou à ação de agentes químicos, resultando em alteração na contagem final das colônias. As células fragilizadas são ainda viáveis, mas não metabolicamente ativas o suficiente para ainda se multiplicarem. Desse modo, a contagem microbiana pode ser menor do que a quantidade real encontrada na amostra. Os fatores utilizados no meio para promover a seletividade, como sal, laurel sulfato, sais biliares, detergentes e antibióticos, ao serem removidos, podem permitir a recuperação da célula, que retoma sua capacidade patogênica e ainda pode causar danos ao indivíduo. O mesmo processo ocorre no alimento. Ao utilizar métodos de conservação que impeçam o crescimento de microrganismos, danos são promovidos, porém, quando esse agente conservante é removido, pode ocorrer uma retomada do crescimento microbiano. No alimento, os microrganismos podem entrar no que é conhecido como estágio de latência ou dormência. Nessa situação, as células não são cultiváveis, mas permanecem viáveis e virulentas. Os maiores danos celulares que ocorrem devido à ação de métodos de conservação ou durante a análise microbiológica estão relacionados a danos estruturais, levando à perda ou alteração de funções celulares, extravasamento do líquido intracelular, alteração na permeabilidade da célula e entrada de compostos que danificam a célula. CRITÉRIOS MICROBIOLÓGICOS Os critérios microbiológicos são determinados de acordo com a natureza alimentícia e o modo de utilização, se são matéria-prima ou ingredientes. São necessários estudos científicos e levantamento de dados epidemiológicos para determinação do risco de contaminação de acordo com o alimento. O principal objetivo dos critérios microbiológicos é proteger a saúde pública, fornecendo alimentos seguros e saudáveis. Os critérios podem ser aplicados por toda a cadeia produtiva, variando ao longo dela, e até na etapa de distribuição. Os critérios microbiológicos são relevantes também para produtos de importação e exportação e em definições de acordo entre fornecedores. Porém, temos que levar em consideração que, ao mesmo tempo que não é possível testar todo o lote do alimento, também não é viável testar uma amostra em relação a todos os possíveis contaminantes, por isso, o uso de critérios microbiológicos e do plano de amostragem são essenciais. Os planos de amostragem devem ser suficientes para testar o lote e fornecer resultados que sejam estatisticamente significativos, de modo a fornecer uma reposta adequada sobre se o lote pode ser aceito ou deve ser rejeitado. Existem dois tipos de planos de amostragem: Plano variável Quando a amostra microbiana apresentar distribuição normal no alimento. Plano de atributo Quando não há conhecimento sobre os potenciais contaminantes do alimento, por exemplo, em alimentos importados. A definição de lote é a quantidade de alimento ou unidade de alimento produzida, manipulada sob condições uniformes, permitindo que haja homogeneidade dentro do lote. Porém, a possível distribuição do microrganismo no lote não é homogênea. Desse modo, utilizamos uma amostra dentro do lote. ATENÇÃO A amostra ou unidade amostral refere-se à quantidade de unidades que são colhidas aleatória ou randomicamente, que representam o todo do lote. Essa amostra pode ser uma embalagem individual ou uma porção de embalagens individuais. Além da representatividade da amostra, os testes microbiológicos apresentam outras limitações, como custo da análise, necessidade de pessoal treinado, equipamentos, material de laboratório e testes destrutivos onde a amostra fica totalmente inutilizada após a análise representando uma perda econômica. Porém, os testes são essenciais para determinação da qualidade do produto e da eficiência da aplicação de métodos de controle na inibição do crescimento de microrganismos no alimento. OS MÉTODOS DE DETECÇÃO DOS RISCOS DE CONTAMINAÇÃO DE ALIMENTOS A especialista Carolina Beres fala sobre diferentes métodos de detecção dos riscos de contaminação de alimentos. VERIFICANDO O APRENDIZADO 1. A DETECÇÃO DE MICRORGANISMOS ENVOLVE ALGUMAS ETAPAS QUE SÃO IMPORTANTES PARA QUE HAJA CORRETA IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS EM UMA AMOSTRA DE ALIMENTO. UMA ETAPA IMPORTANTE DA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA CONSISTE EM UTILIZAR UMA QUANTIDADE DE ALIMENTO EM MEIO DE CULTURA RICO PARA EXTRAIR O MICRORGANISMO DA MATRIZ ALIMENTAR. ASSINALE A ALTERNATIVA QUE INDICA QUAL FASE FOI DESCRITA: A) Pré-enriquecimento B) Incubação C) Homogeneização D) Contagem E) Identificação química 2. OS MÉTODOS DE ANÁLISE TRADICIONAIS OU CONVENCIONAIS SÃO AMPLAMENTE UTILIZADOS E CONSIDERADOS OS MÉTODOS-PADRÃO PARA DETERMINAÇÃO DE CONTAMINAÇÃO MICROBIANA EM ALIMENTOS. PORÉM, DIVERSOS MÉTODOS MODERNOS FORAM DESENVOLVIDOS PARA SOLUCIONAR PROBLEMAS EXISTENTES NOS MÉTODOS TRADICIONAIS. ASSINALE A ALTERNATIVA QUE NÃO REPRESENTA UMA LIMITAÇÃO DOS MÉTODOS TRADICIONAIS. A) Preparo da amostra desnecessário B) Alto custo C) Necessidade de pessoal especializado D) Resposta em aproximadamente 24h E) Muitas etapas GABARITO 1. A detecção de microrganismos envolve algumas etapas que são importantes para que haja correta identificação e quantificação dos microrganismos em uma amostra de alimento. Uma etapa importante da análise microbiológica consiste em utilizar uma quantidade de alimento em meio de cultura rico para extrair o microrganismo da matriz alimentar. Assinale a alternativa que indica qual fase foi descrita: A alternativa "C " está correta. A homogeneização consiste na separação dos microrganismos da matriz alimentar, de modo que possam ser detectados nas análises. 2. Os métodos de análise tradicionais ou convencionais são amplamente utilizados e considerados os métodos-padrão para determinação de contaminação microbiana em alimentos. Porém, diversos métodos modernos foram desenvolvidos para solucionar problemas existentes nos métodos tradicionais. Assinale a alternativa que não representa uma limitação dos métodos tradicionais. A alternativa "A " está correta. Os métodos tradicionais precisam de muitas etapas de preparo do meio de cultura e inóculo para que haja o teste. MÓDULO 2 Identificar os métodos de conservação em alimentos CONCEITOS Métodos de conservação são ações utilizadas pela indústria de alimentos com objetivo de reduzir o desenvolvimento microbiano para diminuir ou eliminar a possibilidade de risco à saúde do consumidor, além de reduzir o surgimento de alterações indesejáveis nas características sensoriais do alimento. Os métodos de controle podem também impedir que o microrganismo tenha acesso ao alimento, exceto para microrganismos que sejam responsáveis por processos fermentativos. Existem diferentes métodos de controle como métodos mecânicos de remoção, alteração de condiçõesatmosféricas, de modo que fique desfavorável ao crescimento microbiano, alteração de temperatura, processos de desidratação, adição de conservadores químicos e irradiação de alimento. Todos os métodos podem ser utilizados de forma individual ou combinados. Observe a seguir as principais características dos métodos de controle mais utilizados nos alimentos. LAVAGEM Realizada utilizando água e sanitizante, principalmente, em carcaças de animais, frutas e vegetais. Tem por objetivo remover superficialmente microrganismos, poeira e outras sujidades, como etapa prévia ao congelamento ou envase. Foto: Shutterstock.com SEDIMENTAÇÃO OU CENTRIFUGAÇÃO Utilizado, principalmente, para líquidos, por exemplo, tornando a água potável e promovendo no leite a remoção de partículas em suspensão como esporos. Porém, não remove totalmente todos os microrganismos. No leite, o processo de centrifugação é muito utilizado para remoção de células somáticas. FILTRAÇÃO Aplicada exclusivamente em produtos líquidos, promove a remoção total de microrganismos quando há aplicação de membranas filtrantes com poro de 0,22µm. ATENÇÃO Pode ser utilizada pressão negativa ou positiva na filtração na produção de sucos de frutas, água de coco (MAGALHÃES et al., 2005), refrigerante, água e bebidas alcoólicas (LEITE et al., 2015). ALTA TEMPERATURA A alta temperatura promove desnaturação de proteínas e consequente inativação de enzimas essenciais ao metabolismo dos microrganismos. A temperatura necessária para eliminar microrganismos ou esporos varia de acordo com o microrganismo e a forma como é encontrado no meio ambiente. Os principais e mais empregados métodos de alta temperatura são: Imagem: Silvio Rodrigues Marques Neto Pasteurização Imagem: Silvio Rodrigues Marques Neto Esterilização A pasteurização destrói os microrganismos patogênicos e reduz a concentração de microrganismos deteriorantes. Pode ser aplicada em alimentos ácidos, conservados sob refrigeração ou congelamento e alimentos que são concentrados ou desidratados. Nessas condições, não há risco para qualquer multiplicação microbiana que resista à pasteurização. Os métodos de conservação que envolvem alta temperatura são baseados no binômio tempo- temperatura, ou seja, altas temperaturas por um intervalo de tempo, quanto maior a temperatura menor o tempo que o alimento precisa ficar exposto. O método mais utilizado é o emprego da temperatura de 63°C por 30 minutos, suficiente para destruir os microrganismos patogênicos não formadores de esporos além de leveduras, bolores bactérias gram-negativas e algumas gram-positivas. SAIBA MAIS Os microrganismos que resistem a esse tratamento são considerados termorresistentes, como, por exemplo, Lactobacillus e Streptococcus. O processo de esterilização sugere que haja destruição total dos microrganismos no alimento. Amplamente aplicado no leite, esse método de conservação alcança temperaturas na ordem dos 140°C aos 150°C, por segundos, conhecido como Ultra High Temperature (UHT). Os microrganismos resistentes à alta temperatura apresentam características que podem auxiliar nessa proteção. Um fator que influencia a resistência térmica é a maior quantidade de água, pois isso aumenta a resistência à desnaturação proteica. Um dos efeitos da alta temperatura é a desnaturação proteica, que ocorre mais facilmente em um ambiente com alta concentração de umidade. Desse modo, em alimentos com menor teor de água, a quebra das ligações peptídicas ocorre com maior dificuldade, necessitando de mais energia. Com base nisso, a composição do alimento pode influenciar esse método de conservação já que, em alimentos adicionados de sais ou açúcares, há uma redução da atividade de água e, portanto, maior dificuldade da ação de conservação da alta temperatura. Outro componente que pode atuar aumentando a termorresistência dos microrganismos é o teor de proteínas e lipídios, já que esses componentes também afetam o teor de atividade de água, principalmente os ácidos graxos de cadeia longa. O pH do alimento também influencia na ação da alta temperatura como método de conservação. Alimentos mais ácidos tornam o meio mais suscetível à ação do calor do que alimentos mais neutros e alcalinos. As características próprias de crescimento de cada microrganismo também devem ser avaliadas quando há implementação de calor no alimento, ou seja, se a temperatura ótima de crescimento dos microrganismos for alta, um tratamento térmico mais elevado deverá ser utilizado. As estruturas microbianas de maior resistência são os esporos, devido à desidratação do seu conteúdo interno e à mineralização da camada externa. Desse modo, ele é altamente adaptável a altas temperaturas. DESIDRATAÇÃO Com base na ideia de que todo microrganismo vivo precisa de água para manutenção da sua atividade metabólica, a redução dessa quantidade de água inibirá o crescimento da população microbiana. Considerado um dos métodos de conservação mais antigos, os alimentos desidratados podem chegar a apresentar até 25% de umidade e atividade de água inferior a 0,6. Ao sofrer desidratação, o alimento também previne a ação de alterações químicas e, por perder peso, acaba trazendo outros benefícios, como redução de custo nas embalagens, armazenamento e transporte. A utilização de produtos desidratados facilitou a alimentação em locais de difícil ou precário acesso em outros métodos de armazenamento, como o espaço, guerras e missões em locais remotos. Foto: Shutterstock.com A secagem que promove a desidratação do alimento pode ser feita de forma natural, com exposição ao sol e ao vento, ou em equipamentos de temperaturas controladas, como câmara a vácuo, onde a água é evaporada em menores temperaturas, diminuindo as alterações no produto. Outro equipamento de secagem é o túnel de ventilação, onde a secagem é realizada em bandejas que armazenam os produtos enquanto há circulação de ar quente. Existem técnicas mais modernas de secagem denominadas spray drying que podem ser utilizadas na elaboração de produtos em pó como um suco detox em pó (IBIAPINA et al., 2018) e a liofilização que promove a secagem de, por exemplo, polpa de açaí, oferecendo um produto inovador (MENEZES; TORRES; SRUR, 2008). REFRIGERAÇÃO A refrigeração ocorre no armazenamento, na manipulação e no transporte de alimentos em temperaturas entre 7°C e 10°C. Nessa temperatura, os microrganismos entram em um modo de latência e não ocorre a multiplicação microbiana, retardando o processo de deterioração. VOCÊ SABIA Existem como exceções os microrganismos psicrotróficos, que apresentam temperatura ótima de crescimento em torno dos 10°C. Nos microrganismos, o dano ocorre devido ao choque frio resultante da perda de barreiras, interferindo na permeabilidade da membrana, causando extravasamento do líquido interno do citoplasma carreando aminoácidos, nucleotídeos, o que promove danos à célula. Esse método de conservação é muito utilizado em frutas, vegetais, leite e ovos. CONGELAMENTO No congelamento, as temperaturas são mais baixas que na refrigeração, com o objetivo de aumentar a vida de prateleira dos alimentos. A temperatura de congelamento é abaixo dos 0°C. Desse modo, não há deterioração pelos agentes químicos, como oxigênio, pelas enzimas ou pelos microrganismos, nem crescimento populacional. Esse método de conservação é o mais indicado para manutenção das características sensoriais, como aroma, sabor e odor dos alimentos. O congelamento é baseado no princípio de congelar a água livre com a formação de cristais de gelo causados pela agregação de partículas. Os cristais formados aumentam a viscosidade no material intracelular, promovem a perda de gases citoplasmáticos como O2 e CO2, que, no caso de células aeróbias, levam ao impedimento dos processos de respiração. O congelamento interfere na concentração de eletrólitos, altera a consistência do citoplasma e ainda promove desnaturação proteica, levando à morte celular.Os processos mais utilizados de congelamento são por imersão direta em líquido congelante, pulverização de líquido congelante ou contato indireto por meio de placas com corrente de ar frio. O congelamento pode ser rápido ou lento. No rápido, a temperatura é diminuída para -20°C em até 30 minutos, enquanto no congelamento lento essa diminuição ocorre entre 3 e 72 horas. Foto: Shutterstock.com A maior vantagem do congelamento rápido é a formação de cristais de gelo menores, ocorrendo perda ou inibição metabólica, sem que haja adaptação do microrganismo já que é observado um choque térmico. Como todo método de conservação, o congelamento apresenta vantagens e desvantagens: Vantagem A maior é que não há interferência na composição do alimento e, portanto, não há alteração das características sensoriais do alimento, nem alteração na sua digestibilidade ou perda do valor nutritivo. Desvantagem Resistência de alguns microrganismos e esporos, além de enzimas que também não desidratam, permanecendo apenas inativas. Deve-se atentar às condições de embalagem de produtos congelados para que não haja desidratação e, consequentemente, deterioração do aroma e aparência do produto. RADIAÇÃO IONIZANTE É baseada na emissão e propagação da energia ou partículas, utilizando comprimentos de ondas mais curtos, em torno de 2.000A (Angtrons) que promovem danos aos microrganismos, como, por exemplo: Raio gama Raios UV partícula β, partícula α Raios X ATENÇÃO O método é considerado uma esterilização a frio, já que não há aumento da temperatura na aplicação das radiações ionizantes. A radiação UV, por exemplo, tem comprimento de onda em torno de 2.600A, sendo considerada uma importante agente bactericida por destruir o material genético das células, formando dímeros de bases nitrogenadas e impedindo a síntese de DNA, RNA e de proteínas. Porém, a radiação UV tem baixo poder de penetração, sendo então empregada na esterilização de superfícies como de embalagem. Após a esterilização por radiação, o alimento deve ser acondicionado de forma adequada para impedir uma nova contaminação, já que esse método de conservação não previne novas contaminações. A maior desvantagem do emprego dessa técnica é que o alimento pode sofrer alterações em relação a algumas características sensoriais, como cor, sabor e odor. CONSERVANTES QUÍMICOS O benzoato de sódio foi o primeiro conservante químico que teve autorização para ser utilizado em alimentos pela FDA (Food and Drug Administration). A adição de conservantes químicos no alimento impede a deterioração por ação microbiana por diminuir a atividade de água, por exemplo, com a adição de sal, açúcar e vinagre. Pode, ainda, impedir a contaminação microbiana pela adição de conservantes químicos, porém esses devem atender à legislação em relação à quantidade permitida de uso para cada reagente, como exemplificado no quadro a seguir. Conservantes Concentração máxima permitida Organismos afetados Alimentos que utilizam Ácido propiônico 0,32% Mofo Pão, bolo, queijo Ácido sórbico 0,2% Mofo Queijo, figo, xarope, molho, geleia, bolo Ácido benzoico 0,1% Levedura e mofo Margarina, temperos, refrigerante extrato de tomate Parabenos 0,1% Levedura e mofo Panificação, refrigerante, conserva Sulfitos 200 a 300ppm Inseto e microrganismos Melado, fruta seca, vinho, suco de limão Etileno 700ppm Levedura, mofo, inseto Tempero, nozes Diacetato de sódio 0,32% Mofo Pão Nisina 1% Bactéria Clostridium Queijo Ácido deidroacético 65ppm Inseto Morango Nitrato de sódio 120ppm Clostrídio Carnes curadas Ácido caprílico - Mofo Queijo Formato etílico 15-220ppm Levedura Frutas secas e nozes Exemplos de conservantes químicos que podem ser utilizados nos alimentos de concentração máxima permitida, de acordo com a legislação vigente, para combater os microrganismos em alguns alimentos. Adaptado de JAY, 2005, p.277-301. ATMOSFERA MODIFICADA O método mais utilizado para esse fim é o processo de embalagem a vácuo, que consiste na remoção do ar da embalagem que, em seguida, é selada. Ao longo do armazenamento, ocorre um aumento do CO2 devido à continuação da respiração de microrganismos aeróbios e dos próprios tecidos do alimento. O CO2 concentrado afeta a permeabilidade da parede celular, que pode causar um acúmulo de compostos na membrana microbiana, aumentando a fluidez e levando ao extravasamento do conteúdo celular. Outra maneira de se trabalhar com atmosfera modificada é a injeção de uma mistura de gases na embalagem de modo que prejudique o metabolismo de respiração dos microrganismos. Os microrganismos mais afetados por esse método de controle são os microrganismos aeróbios. Os microrganismos anaeróbios podem ser favorecidos nesse aspecto, já que apresentam como exigência a ausência de oxigênio como condição ótima de crescimento. ALTA PRESSÃO A aplicação de alta pressão promove a desnaturação das proteínas e a destruição da própria célula microbiana, além de aumentar a fluidez da membrana causando extravasamento do líquido intracelular. O método não promove alteração de cor, sabor e odor no alimento, o que é uma vantagem para o consumidor. Usualmente, é utilizada para bomba que gera a pressão hidrostática em torno de 400 a 800MPa (Megapascal). OS MÉTODOS DE CONSERVAÇÃO EM ALIMENTOS A especialista Carolina Beres fala sobre os métodos de conservação em alimentos. VERIFICANDO O APRENDIZADO 1. O CONGELAMENTO É UMA FORMA DE CONSERVAÇÃO QUE ENVOLVE O EMPREGO DE BAIXAS TEMPERATURAS. EM RELAÇÃO À TÉCNICA, ASSINALE A ALTERNATIVA CORRETA. A) O congelamento lento forma pequenos cristais de gelo. B) A temperatura de congelamento deve ser em torno de 7°C. C) O congelamento altera as características sensoriais do alimento. D) O congelamento rápido forma pequenos cristais de gelo. E) O congelamento não promove desidratação. 2. TODOS OS MÉTODOS DE CONSERVAÇÃO APRESENTAM ALGUMA LIMITAÇÃO. POR ISSO, HÁ UMA RECOMENDAÇÃO DE UTILIZAR OS MÉTODOS DE FORMA COMBINADA. ASSINALE A ALTERNATIVA QUE CORRELACIONA DE MODO EQUIVOCADO O MÉTODO DE CONSERVAÇÃO COM UMA LIMITAÇÃO: A) Filtração – só pode ser utilizado com alimentos sólidos. B) Conservantes – as quantidades devem seguir a legislação. C) Lavagem – atua de forma superficial. D) Refrigeração – não elimina microrganismos psicrotróficos. E) Irradiação – pode alterar características sensoriais do alimento. GABARITO 1. O congelamento é uma forma de conservação que envolve o emprego de baixas temperaturas. Em relação à técnica, assinale a alternativa correta. A alternativa "D " está correta. O congelamento rápido forma pequenos cristais de gelo, o que consiste em uma vantagem do processo. A temperatura de congelamento é abaixo de 0oC. O congelamento não altera as características sensoriais do alimento e pode levar à desidratação se a embalagem não for adequada. 2. Todos os métodos de conservação apresentam alguma limitação. Por isso, há uma recomendação de utilizar os métodos de forma combinada. Assinale a alternativa que correlaciona de modo equivocado o método de conservação com uma limitação: A alternativa "A " está correta. A limitação da filtração só pode ser aplicada em alimentos líquidos. CONCLUSÃO CONSIDERAÇÕES FINAIS A manutenção da segurança alimentar é uma atribuição do nutricionista. Desse modo, o conhecimento dos conceitos básicos de análises microbiológicas é necessário para uma adequada intepretação dos resultados obtidos e das observações ao longo do processo produtivo. As técnicas de análise devem seguir as exigências da legislação, porém, novas metodologias vêm sendo desenvolvidas, de modo a promover alternativas de análise mais rápidas e in loco nas indústrias e unidades de alimentação e nutrição. Evitar a contaminação é o processo mais confiável para impedir qualquer tipo de surto alimentar. Existem diferentes métodos de conservação que objetivam evitar o crescimento da população microbiana, porém, os métodos apresentam limitações.Desse modo, é necessário, muitas vezes, fazer uso de técnicas de forma associada ou combinada. Além da manutenção da segurança alimentar, o nutricionista de controle de qualidade deve ter atenção ao fato de que os alimentos serão consumidos por um público cada vez mais exigente. Assim, é importante evitar alterações nas características sensoriais do produto. AVALIAÇÃO DO TEMA: REFERÊNCIAS BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária/Diretoria Colegiada. Instrução Normativa n° 60, de 23 de dezembro de 2019. Estabelece as listas de padrões microbiológicos para alimentos. BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária/Diretoria Colegiada. Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) no 331, de 26 de dezembro de 2019. Dispõe sobre os padrões microbiológicos de alimentos e sua aplicação. FORSYTHE, S. J. Microbiologia da Segurança Alimentar. Rio Grande do Sul: Artmed, 2002. FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos Alimentos. São Paulo: Atheneu, 2008. IBIAPINA, A.; AGUIAR, A. O.; TORRES, E. A.; SOARES, C. M. A.; ZUNIGA, A. D. G. Obtenção de pó de polpa detox utilizando liofilização e spray drying como método de secagem. Global Science and Technology, v. 11, n. 3, p. 269-276, 2018. JAY, J. M. Microbiologia de Alimentos. 6. ed. Rio Grande do Sul: Artmed, 2005. LEITE, P. B.; MIRANDA, A. L.; SOUZA, C. O.; MACHADO, W. M.; MOURA, L. E.; DRUZIAN, J. I. Estudo prospectivo sobre métodos de conservação de bebidas alcoólicas e tecnologias correlatas sob o enfoque em documentos de patentes. Caderno de Prospecção, v. 8, n, 1, p. 74-84, 2015. MAGALHÃES, M. P.; GOMES, F. S.; MODESTA, R. C. D.; MATTA, V. M.; CABRAL, L. M. C. Conservação de água de coco verde por filtração com membrana. Food Science and Technology, 2005. MENEZES, E. M. S.; TORRES, A. T.; SRUR, A. U. S. Valor nutricioional da polpa de açaí (Euterpe oleracea Mart) liofilizada. Acta Amazonica, v. 38, n. 2, 2008. SHINOHARA, N. K. S.; BARROS, V. B.; JIMENEZ, S. M. C.; MACHADO, E. C. L.; DUTRA, R. A. F.; FILHO, J. L. L. Salmonella spp., importante agente patogênico veiculado em alimentos. Ciência e Saúde Coletiva, 2008. TEJADA, T. S.; CONCEIÇÃO, R. C. S.; TIM, C. D. Detecção de Campylobacter jejuni em produtos de frango utilizando separação imunomagnética. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 71, n. 5, p. 1565-1570, 2019. EXPLORE+ Os restaurantes do tipo self service apresentam alta exposição dos alimentos. Entenda melhor como ocorre a contaminação e a qualidade dos alimentos no artigo Restaurantes self-service: segurança e qualidade sanitária dos alimentos servidos, de Mariana Gardin Alves e Mariko Ueno, publicado na Revista de Nutrição em 2010. CONTEUDISTA Carolina Beres CURRÍCULO LATTES javascript:void(0);
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