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<p>Isolamento de ácidos nucleicos</p><p>Prof. Eldio dos Santos, Prof.ª Thaíssa Queiróz Machado</p><p>Descrição</p><p>Isolamento dos ácidos nucleicos: coleta, transporte e armazenamento de amostras; extração e</p><p>quantificação de DNA e RNA; síntese de cDNA; desenho experimental.</p><p>Propósito</p><p>Compreender as etapas para o isolamento dos ácidos nucleicos, a partir do desenho experimental até a sua</p><p>extração e quantificação é o primeiro passo para obtenção de amostras de qualidade para a realização dos</p><p>métodos moleculares, garantindo, assim, resultados fidedignos.</p><p>Objetivos</p><p>Módulo 1</p><p>Introdução ao isolamento dos ácidos nucleicos</p><p>Descrever o desenho experimental e as fases pré-analíticas do isolamento dos ácidos nucleicos.</p><p>Módulo 2</p><p>Extração e quanti�cação do material genético</p><p>Descrever os procedimentos de extração e quantificação do DNA e RNA e síntese do cDNA.</p><p>Introdução</p><p>A Biologia Molecular é responsável por estudar as moléculas que realizam a manutenção da vida. São elas:</p><p>DNA, RNA e proteínas, que têm como função principal, considerando o dogma central da Biologia,</p><p>armazenar informações e enviar essas informações para a síntese das proteínas que realizaram as funções</p><p>celulares, respectivamente.</p><p>Atualmente, os inúmeros avanços obtidos na área médica, na ciência animal e vegetal, são resultado da</p><p>elaboração de técnicas moleculares que nos proporcionaram novas formas de estudar o DNA e o RNA.</p><p>Técnicas essas que estão em constante evolução.</p><p>No entanto, antes de analisar o material genético propriamente dito, é necessário extrair esse material das</p><p>células. Para isso, é essencial que a coleta, o armazenamento, o transporte e o processo extrativo sejam</p><p>realizados de maneira satisfatória e que tenhamos uma quantidade de material genético suficiente, de</p><p>qualidade, livre de contaminantes e íntegro para realizar a análise.</p><p></p><p>Você imagina como é feito o processo extrativo? Será que a extração de DNA ou RNA empregam a mesma</p><p>metodologia? E o que é cDNA e qual sua importância?</p><p>Vamos juntos, ao longo desta jornada, explorar todos esses questionamentos, visitando a coleta, o</p><p>transporte e armazenamento do material para análise molecular (fase pré-analítica). Após essa fase, vamos</p><p>aprender sobre as técnicas de extração de DNA e RNA, quantificação, análise da pureza e, por fim, a síntese</p><p>do cDNA. Além disso, estudaremos o desenho experimental e entenderemos a sua aplicabilidade, etapas e</p><p>importância no desenvolvimento e conhecimento científico!</p><p>1 - Introdução ao isolamento dos ácidos</p><p>nucleicos</p><p>Ao �nal deste módulo, você será capaz de descrever o desenho</p><p>experimental e as fases pré-analíticas do isolamento dos ácidos</p><p>nucleicos.</p><p>Desenho experimental</p><p>O desenho experimental é um planejamento de um estudo realizado em algumas etapas e é uma</p><p>ramificação do método científico, que é a ferramenta mais poderosa de todas para o avanço tecnológico da</p><p>humanidade e muda até mesmo a forma que pensamos nas coisas do dia a dia.</p><p>Veja a aplicação deste método em uma atividade do nosso cotidiano:</p><p>Leonardo tem o hábito de assistir ao telejornal todos os dias. Enquanto assistia ao programa, viu que o</p><p>prefeito da sua cidade participou de uma pequena entrevista e fez algumas afirmações sobre o</p><p>funcionamento da prefeitura naquele trimestre.</p><p>Primeiro, Leonardo deve parar, pensar sobre tal afirmação e aplicar o método científico, observando o que</p><p>foi falado e questionar: “Será que é verdade o que o prefeito falou?"</p><p>Em seguida, ele estabelecerá hipóteses: “É verdade que tal coisa aconteceu” ou “É mentira que tal coisa</p><p>aconteceu”.</p><p>A próxima etapa é realizar um experimento, que nesse caso é a busca de fontes confiáveis de notícia, com</p><p>credibilidade, para identificar se o que o político falou é verdade ou não, analisar o discurso e, finalmente,</p><p>Leonardo poderá tomar a sua conclusão baseado no método científico.</p><p>Pronto! Agora ele pode validar a hipótese “É verdade” ou “É mentira” ao invés de simplesmente aceitar a</p><p>afirmação dita.</p><p>O método científico foi utilizado para produzir quase tudo que existe, indo do aparelho em que você está</p><p>lendo este texto até a cadeira em que está sentado(a). Nós utilizamos esse método muitas vezes de forma</p><p>inconsciente, mas temos que ter em mente que ele existe e que devemos pensar sempre de forma</p><p>criteriosa.</p><p>Método científico.</p><p>Resumindo, as etapas do método científico são: observação, questionamento, hipótese, experimento,</p><p>análise dos resultados e conclusão. Agora que já entendemos o método científico, podemos falar sobre</p><p>desenho experimental. Ele é um conjunto de etapas que devem ser realizadas para conduzir uma hipótese</p><p>utilizando o método científico, com objetivo de estabelecer um resultado confiável e reprodutível. A</p><p>reprodutibilidade é um dos pontos mais importantes da ciência!</p><p>Observação</p><p>A partir da observação de algum evento – por exemplo, a existência do DNA –, podemos nos perguntar</p><p>(questionar): “Eu gostaria de purificar o DNA para estudar melhor como ele é construído, tem alguma forma de</p><p>fazer isso?”.</p><p>Hipótese</p><p>A partir dessa pergunta, estabelecemos uma hipótese: “Se eu aplicar um reagente específico e fizer um</p><p>determinado procedimento, será que consigo o DNA purificado?”.</p><p>Experimento</p><p>Depois vamos para a bancada, onde o experimento é feito, e a partir da análise dos resultados, as conclusões</p><p>são obtidas.</p><p>Exemplo</p><p>Suponha que sua equipe do laboratório desenvolveu uma nova técnica de quantificação de DNA. Você</p><p>deverá escrever sua metodologia passo a passo, com detalhes dos tipos de solventes necessários, as</p><p>concentrações, a pressão, a temperatura de incubação etc. Os dados devem ser claros para que, quando</p><p>outra pessoa ler essa metodologia (por exemplo, alguém do outro lado do mundo, cinco anos depois), ela</p><p>consiga chegar no mesmo resultado, considerando que todas as condições e manipulação foram realizadas</p><p>conforme o descrito.</p><p>Vejamos as etapas do desenho experimental!</p><p>A partir do desenho experimental, pretendemos dizer de que modo ou por que o fenômeno é produzido.</p><p>Assim, a partir da ideia de relação de causa-efeito em que se acredita que existe uma relação entre a</p><p>De�nir a relação causa-efeito</p><p>Estabelecer o problema existente, os objetivos do trabalho e as metas a serem cumpridas.</p><p>Planejamento</p><p>Com o projeto estabelecido, preparar a instrumentação e avaliar possíveis problemáticas do</p><p>experimento.</p><p>Execução</p><p>Realizar as medições e técnicas planejadas.</p><p>Análise e interpretação</p><p>Após a execução, analisar os dados coletados de forma criteriosa e científica.</p><p>Formular as conclusões</p><p>A partir da análise e interpretação dos resultados, devemos concluir se a relação causa-efeito</p><p>se mostrou existente e responder aos objetivos do trabalho definidos na etapa 1, fechando</p><p>dessa forma o ciclo do desenho experimental.</p><p>construção da causa e o efeito observado, formulamos as hipóteses a serem testadas, temos os vários</p><p>tratamentos (variáveis independentes) e executamos o experimento e observamos os resultados (variáveis</p><p>dependentes). Se o experimento for bem elaborado e planejado, podemos formular conclusões a respeito</p><p>da relação de causa-efeito para a hipótese estabelecida.</p><p>Hipóteses</p><p>São afirmações provisórias, enunciadas de forma curta e objetiva, que serão verificadas para ser ou não</p><p>demonstradas. Seguem teorias já existentes.</p><p>Variáveis dependentes e independentes</p><p>Mas o que são variáveis dependentes e independentes? Para responder a essa pergunta, aprenderemos</p><p>alguns conceitos essenciais para o desenho experimental!</p><p>Sempre que fazemos um experimento, queremos verificar os seus resultados. Todos os resultados (outputs)</p><p>são originados a partir das entradas do experimento (inputs).</p><p>Entradas do experimento</p><p>A palavra entrada corresponde a todos os valores inseridos em determinado modelo, ou seja, em um modelo</p><p>experimental em que valores são dados, as entradas são todos estes valores.</p><p>Considerando a necessidade de se extrair o DNA com sucesso, o input será o material coletado, por</p><p>exemplo, o raspado da face interna da bochecha, e o output será</p><p>o DNA extraído desse material.</p><p>Os inputs são suscetíveis às diversas variáveis. Elas são agrupadas em dois grupos: variáveis dependentes</p><p>e variáveis independentes. Vamos conferi-las?</p><p>Variáveis independentes</p><p>São aquelas que podemos controlar e modificar, e possuem certo efeito sobre a variável dependente.</p><p>Variáveis dependentes</p><p>São aquelas que medem o efeito do que está sendo avaliado e dependem da variável independente.</p><p>O experimento será medir a concentração plasmática do colesterol. As variáveis independentes, ou seja, as</p><p>que são possíveis controlar, seriam: “Fiz jejum? Me alimentei bem? Usei algum medicamento nos últimos</p><p>dias?” Essas perguntas influenciarão diretamente no resultado do colesterol encontrado, ou seja, na variável</p><p>dependente, que nesse caso é a concentração de colesterol dosada no soro.</p><p>Hipótese nula e hipótese alternativa</p><p>Após os resultados do experimento, baseando-se nos dados coletados e processos realizados, como</p><p>garantir que o dado obtido em uma amostra pode ser generalizado para toda a população e verificar se a</p><p>hipótese inicial estava correta?</p><p>Amostra</p><p>Subconjunto de pessoas, itens ou eventos de uma população selecionados para analisar e fazer inferências.</p><p>Resposta</p><p>Para tentar responder a essas perguntas, os cientistas utilizam modelos estatísticos e testes de hipóteses</p><p>para analisar os dados e testar a validade desses resultados. Por meio da inferência estatística, os testes de</p><p>hipótese são utilizados para tomar a decisão de aceitar ou rejeitar uma hipótese estabelecida no início do</p><p>desenho experimental.</p><p>Existem dois tipos de hipótese:</p><p>Hipótese nula</p><p>Indica que não há uma relação causa-efeito.</p><p>Hipótese alternativa</p><p></p><p>Indica que existe uma relação causa-efeito, ou seja, rejeita a hipótese nula.</p><p>Vamos entender melhor a partir de um exemplo:</p><p>Para provar que existe um padrão, ou seja, uma relação causa-efeito, vamos estudar se, ao falar com um</p><p>papagaio, ele repete exatamente o que nós falamos. Nesse caso, a hipótese inicial, aquela que se deseja</p><p>provar, é que o papagaio repete o que falamos.</p><p>Para isso, o experimento será falar várias vezes para o papagaio a palavra Vasco e observar o que ele diz.</p><p>Como resultado, podemos esperar que ele repita a mesma palavra (Vasco) ou não (Flamengo, ou qualquer</p><p>outra palavra diferente de Vasco). Assim, teremos duas hipóteses: a hipótese nula (aquela em que não há</p><p>relação causa-efeito), que ele não repete o que falamos, ou seja, ao ouvir Vasco, ele diz Flamengo. Quando</p><p>isso acontece, dizemos que a H0 é verdadeira; e a hipótese alternativa (aquela que confirma a relação</p><p>causa-efeito), em que ele repete o que estamos falando, ao ouvir Vasco, ele repete Vasco. Nesse caso,</p><p>rejeitamos a H0 e a H1 é verdadeira.</p><p>Hipótese nula</p><p>Hipóteses alternativa.</p><p>Tipos de erros</p><p>Todos os experimentos e análises de resultados são passíveis de erros de interpretação e/ou do processo</p><p>realizado. Os erros são causados quando temos uma interpretação errônea dos dados, o que nos leva a</p><p>rejeitar uma hipótese verdadeira (falso positivo) ou não rejeitar uma hipótese falsa (falso negativo). Os erros</p><p>podem ser classificados como tipo 1 e 2, de acordo com a hipótese que será rejeitada.</p><p>A hipótese nula é</p><p>verdadeira</p><p>A hipótese nula é</p><p>falsa</p><p>Decisão</p><p>Decidimos rejeitar a</p><p>hipótese nula.</p><p>Erro tipo 1 (rejeição</p><p>de uma hipótese</p><p>nula verdadeira)</p><p>Decisão correta</p><p>Aceita-se a hipótese</p><p>nula.</p><p>Decisão correta</p><p>Erro tipo 2 (não</p><p>rejeição ou aceitação</p><p>de uma hipótese nula</p><p>falsa)</p><p>Erros do tipo 1 e 2.</p><p>Vamos voltar ao exemplo anterior para entender melhor esses erros:</p><p>Como aprendemos anteriormente, ao falar para o papagaio a palavra Vasco e ele repetir Flamengo ou</p><p>qualquer outra palavra além de Vasco, a hipótese nula é verdadeira (sem relação causa-efeito). No entanto,</p><p>quando falamos Vasco para o papagaio e ele repete outra palavra, enviesados para a obtenção de uma</p><p>relação de causa-efeito, rejeitamos a H0, mesmo ela sendo verdadeira. Temos um erro do tipo 1 ou falso</p><p>positivo. Nesse tipo de erro, a hipótese nula é verdadeira (ou seja, ele não repetiu a palavra Vasco) e nós a</p><p>rejeitamos (pois entendemos Vasco).</p><p>Vimos também que, quando falamos Vasco, e ele repete Vasco, a H0 é falsa. Qualquer outra palavra dita</p><p>pelo papagaio torna a H0 verdadeira, pois ele não repetiu a palavra que queríamos (Vasco). No entanto, se</p><p>ao falar Vasco ele repetir a exata palavra Vasco e nós entendermos “Asco” por engano, vamos entender que</p><p>a H0 é verdadeira, porém, nesse caso, a hipótese nula é falsa, uma vez que ele de fato repete a palavra</p><p>Vasco. Esse é um erro do tipo 2 ou falso negativo: aceitamos uma H0 verdadeira (pois entendemos que ele</p><p>disse Asco), mas, na verdade, a hipótese nula era falsa (ou seja, ele disse Vasco).</p><p>Saiba mais</p><p>Esses conceitos podem ser utilizados em qualquer desenho experimental e são muito comuns na área</p><p>médica, principalmente em testes de diagnóstico clínico, nos quais kits de diagnóstico demonstram</p><p>resultado positivo para uma doença inexistente ou resultado negativo, quando, na verdade, há presença de</p><p>doença.</p><p>O desenho experimental</p><p>Entenda melhor o desenho experimental.</p><p>Seleção de participantes</p><p>A seleção dos participantes, população de estudo, deve ser a mais representativa possível, para termos</p><p>menor chance de errar ao generalizar os resultados.</p><p>A seleção de participantes de um estudo também pode ser chamada de amostragem, que pode ser não</p><p>probabilística ou probabilística.</p><p>A amostragem não probabilística ocorre quando a probabilidade da seleção de cada participante não é</p><p>conhecida. A seleção da amostra depende do julgamento do pesquisador e esta pode ser feita pela</p><p>amostragem por conveniência (o pesquisador escolhe quem está disponível) ou julgamento (o</p><p>pesquisador escolhe quem ele acha interessante).</p><p>A amostragem probabilística ocore quando cada elemento da população possui a mesma</p><p>probabilidade de ser selecionado para compor a amostra. Nesse caso, a probabilidade da seleção de</p><p></p><p></p><p>cada participante é conhecida. Por exemplo, em uma amostra aleatória simples com 10 participantes,</p><p>a chance de um deles ser escolhido é 1/10, ou seja, 10%.</p><p>A amostragem probabilística pode ser:</p><p>Participantes são selecionados aleatoriamente em uma determinada população. Em uma população</p><p>de 12 participantes, eu escolho 9 de forma aleatória, ou seja, ao acaso. Isso poderia ser realizado por</p><p>sorteio, por exemplo.</p><p>O primeiro participante é selecionado a partir de um número preestabelecido e os outros</p><p>participantes são escolhidos seguindo um mesmo coeficiente. Por exemplo, em uma população com</p><p>13 participantes, vamos padronizar um coeficiente de 3. Além disso, vamos utilizar a fórmula 1 + (K x</p><p>N), onde K é meu coeficiente e N o número do participante. Se definimos o primeiro participante</p><p>como o número 1 (poderia ser qualquer outro), quais seriam os outros participantes?</p><p>O segundo participante será o número 1 + o coeficiente (3) X a quantidade de participantes já</p><p>escolhidos, assim teríamos 1 + 3 (coeficiente) X 1 (número já selecionado). Ou seja, o participante</p><p>seria o número 4.</p><p>O terceiro participante será o número 1 + 3 x 2 = 7.</p><p>O quarto 1 + 3 x 3 = 10.</p><p>O quinto 1 + 3 x 4 = 13, fechando, assim, a amostra.</p><p>Amostragem aleatória simples </p><p>Amostragem sistemática </p><p>Com os conceitos básicos sobre desenho experimental estabelecidos, podemos seguir para as próximas</p><p>etapas da fase pré-analítica do isolamento de ácidos nucleicos. Os conceitos aprendidos neste tópico são</p><p>valiosos e podem ser utilizados em qualquer situação da vida, seja ela profissional ou do nosso cotidiano.</p><p>Coleta, transporte e armazenamento de</p><p>amostras biológicas destinadas aos</p><p>testes moleculares</p><p>Atualmente, o mercado dos testes moleculares está em intensa expansão. O marketing feito pelos</p><p>laboratórios, as divulgações promovidas por celebridades, as regulações nos preços dos testes, o</p><p>desenvolvimento de marcadores e os kits acessíveis, entre outros fatores colaboram para o crescimento</p><p>desse ramo de mercado.</p><p>São várias as empresas</p><p>que fazem testes utilizando material genético para diferentes fins, por exemplo,</p><p>indicar a ancestralidade e a origem genética, e apontar marcadores genéticos para doenças, além dos</p><p>testes laboratoriais para diversos tipos de infecções (incluindo covid-19).</p><p>Saiba mais</p><p>Em um passado recente, pensar nesse tipo de tecnologia de diagnóstico era deixado para filmes de ficção</p><p>científica, aqueles em que um médico high-tech coleta o sangue do paciente, passa em uma máquina e</p><p>depois de alguns segundos um papel é impresso indicando todas as doenças e quais os medicamentos</p><p>utilizar.</p><p>Hoje, esse tipo de abordagem é real, ou pelo menos bem parecido com filmes, pois a população tem acesso</p><p>aos testes de forma mais fácil e barata. É importante ressaltar que, no Brasil, existem algumas empresas</p><p>com esse perfil.</p><p>Sempre que pensamos nos testes moleculares, automaticamente, temos a ideia de perfeição, por se tratar</p><p>de tecnologia de ponta, pela propaganda ser sempre bem feita e por ser algo muito misterioso, de</p><p>entendimento distante do senso comum. Apesar de muitos acharem que os resultados de testes genéticos</p><p>são absolutos, isso não é uma verdade: eles estão sujeitos a erros assim como qualquer teste de laboratório</p><p>e a maioria desses erros ocorre justamente na fase pré-analítica, que compreende desde a coleta do</p><p>material até o cadastro e armazenamento das amostras no laboratório, antes da análise propriamente dita.</p><p>Diferentes amostras biológicas podem ser coletadas para os testes moleculares, como sangue, escarro,</p><p>amostra de tecidos, um fio de cabelo, dentre outras. A partir dessas amostras, podemos detectar a presença</p><p>tanto do nosso material genético (DNA/RNA) quanto o de microrganismos, conseguindo verificar e</p><p>quantificar a presença de vírus, bactérias, protozoários; analisar a predisposição ou o estado de doenças</p><p>genéticas; e fazer os famosos testes de paternidade. Além disso, é amplamente utilizado em perícias</p><p>médicas: o jornalista Tim Lopes foi identificado com auxílio dos testes moleculares.</p><p>ornalista Tim Lopes</p><p>Arcanjo Antonino Lopes do Nascimento, conhecido como Tim Lopes, foi um repórter investigativo brasileiro. Ele</p><p>desapareceu em 2 de junho de 2002, porém sua morte somente foi confirmada no mês seguinte, após exame</p><p>de DNA dos fragmentos de ossos encontrados em um cemitério clandestino.</p><p>Atenção!</p><p>É importante destacar que, além das amostras biológicas, os testes moleculares podem ser realizados a</p><p>partir de cultura de células e de microrganismos. Nesses casos, também é essencial os cuidados com a</p><p>fase pré-analítica, para um resultado de qualidade. A coleta e manipulação de todas essas amostras, assim</p><p>como na coleta de qualquer material biológico, deve ser realizada seguindo todas as normas de</p><p>biossegurança, com utilização dos equipamentos de proteção individual, para evitar contaminação.</p><p>Além disso, as amostras devem estar devidamente identificadas com o nome do paciente e data da coleta,</p><p>assinatura de quem coletou e um código numérico para dupla verificação. Amostras que não estiverem</p><p>identificadas corretamente ou aquelas que apresentem características que impossibilitem o teste, como a</p><p>presença de hemólise no tubo de sangue, devem ser descartadas.</p><p>Hemólise</p><p>Extravasamento de componentes intracelulares das hemácias para o meio extracelular, por conta de um</p><p>rompimento das membranas celulares.</p><p>Alguns tipos de testes possuem critérios específicos de acordo com o procedimento realizado. É obrigação</p><p>do laboratório deixar evidente para os pacientes os critérios de aceitação e exclusão de amostras para cada</p><p>tipo de ensaio.</p><p>A quantidade de material genético extraído depende diretamente do local de coleta, do número de células</p><p>presentes e pode variar conforme a idade do paciente, além de depender diretamente das condições de</p><p>transporte e armazenamento.</p><p>Em algumas ocasiões, um resultado negativo em um exame pode ser resultado de um erro durante a fase</p><p>pré-analítica, uma vez que o material genético tem que estar viável para conseguir realizar as técnicas</p><p>moleculares que envolvem sua amplificação. É sempre preferível trabalhar com amostras frescas para</p><p>melhorar o rendimento.</p><p>Vamos conferir alguns cuidados para extração de amostras de DNA e RNA:</p><p>Para extração de DNA, a coleta deve seguir alguns cuidados, pois, no nosso organismo, existem</p><p>moléculas capazes de degradar o DNA, como as desoxirribonucleases (DNases) que necessitam de</p><p>íons metal para a sua atividade. Então, para inativação da enzima, pode ser necessária a utilização</p><p>de agentes quelantes como o EDTA. Ela também é inativada pelo calor durante 10 minutos a 65°C.</p><p>A coleta de amostras para a extração de RNA requer mais cuidados. O RNA é uma molécula</p><p>altamente instável e que apresenta grande fragilidade e se degrada rapidamente pela ação de</p><p>ribonucleases (RNase). Essas enzimas não precisam de cofator para se ativar, são estáveis, ficando</p><p>ativas mesmo após a fervura e autoclavagem, e estão presentes em uma série materiais biológicos e</p><p>na nossa pele. É muito importante a adição de agentes estabilizadores (Os agentes estabilizadores</p><p>de RNA são reagentes que visam inativar enzimas capazes de degradar o RNA.) de RNA o mais</p><p>Extração de DNA </p><p>Extração de RNA </p><p>rápido possível e que o recipiente utilizado seja certificado como Ribonucleases (RNase) free, ou</p><p>seja, livre de agentes degradantes de RNA, estéril, e sempre deve ser manipulado com luvas!</p><p>Agora é hora de conhecer as peculiaridades de algumas amostras destinadas à extração do DNA/RNA.</p><p>Vamos lá?</p><p>Sangue e aspirado de medula óssea</p><p>Amostras de sangue e aspirado de medula óssea precisam ser armazenados junto a agentes</p><p>anticoagulantes para manter a estabilidade da amostra, impedindo a coagulação sanguínea. Entretanto, a</p><p>heparina (agente anticoagulante amplamente utilizado) é um potente inibidor de algumas técnicas</p><p>moleculares, dentre elas o famoso PCR (Polymerase Chain Reaction).</p><p>PCR</p><p>É a técnica utilizada para amplificar a quantidade de material genético e que é fundamental para as análises</p><p>posteriores ou até pode ser utilizada como ferramenta principal de diagnóstico.</p><p>Saiba mais</p><p>A impossibilidade do uso de heparina fez com que outros anticoagulantes fossem preferíveis, sendo</p><p>normalmente utilizados o EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) ou o ACD (citrato de dextrose) para essas</p><p>amostras. A coleta de amostras com o anticoagulante EDTA, apesar de ser mais utilizada e indicada para</p><p>amostras de sangue, também pode interferir em algumas metodologias, já que o EDTA pode inibir</p><p>drasticamente a atividade da DNA polimerase se estiver em excesso.</p><p>Quando o objetivo é a análise do DNA, o sangue total é estável por até 24 horas em temperatura ambiente.</p><p>Na temperatura de 2°C a 8°C, é estável por até oito dias. De forma diferente, o plasma fica estável apenas 5</p><p>dias na temperatura de 2°C a 8°C, suportando tempos maiores se for congelado, e a amostra deve ser</p><p>transportada em ambiente refrigerado.</p><p>Além disso, se congelada, é necessário que não haja ciclos de congelamento-descongelamento. Para</p><p>análise de RNA viral, o sangue deve ser centrifugado e o plasma transferido para outro tubo estéril e livre de</p><p>RNases em até quatro horas da coleta.</p><p>Para as amostras de aspirado de medula óssea, a seringa deve conter EDTA e, após a coleta, o aspirado</p><p>pode ser armazenado por até 72 horas na temperatura de 2°C a 8°C. Caso seja necessário maior tempo para</p><p>o processamento, os eritrócitos precisam ser removidos e a amostra congelada a -20°C, assim a</p><p>estabilidade do material permanece por meses.</p><p>Atenção!</p><p>A amostra só pode ser congelada após a remoção dos eritrócitos!</p><p>Vamos entender um pouco mais a seguir:</p><p>Para a extração de RNA após a coleta, esta deve ser colocada imediatamente em solução estabilizante de</p><p>RNA. Caso não tenha essa solução e não seja congelada, ela deve ser transportada em gelo seco e</p><p>analisada em até 4 horas.</p><p>O grupamento heme presente nas hemoglobinas pode inibir a reação de PCR, então amostras que tenham</p><p>algum tipo de hemólise não</p><p>são satisfatórias para análise. Além disso, caso haja necessidade de remoção</p><p>dos eritrócitos, esta deve ser feita de forma cuidadosa, para evitar a hemólise e liberação do grupo heme e</p><p>causar problemas nos testes moleculares.</p><p>Amostra de tecidos</p><p>As amostras de tecido são preferíveis quando os agentes etiológicos estão alojados no tecido e/ou o</p><p>diagnóstico das possíveis infecções seja difícil por meio da simples coleta de sangue. Além disso, essas</p><p>amostras são as de escolha durante as autópsias e para a análise de tecidos tumorais para comparar o DNA</p><p>das células tumorais com as normais.</p><p>Saiba mais</p><p>Para garantir uma boa análise, é recomendado coletar de 1g a 2g de tecido-alvo. No entanto, a quantidade</p><p>pode variar de acordo com o tecido. Apenas para termos uma ideia, 10mg de tecido fornece cerca de 10µg</p><p>de material genético. Essa quantidade já é suficiente para análise, mas sempre devemos trabalhar com uma</p><p>margem de segurança, pois possíveis perdas de material podem ocorrer.</p><p>Para tecidos, o ideal, após a coleta por biópsia, é o rápido congelamento em nitrogênio líquido (-196°C) ou</p><p>manter esse tecido em solução de preservação de ácidos nucleicos. Não é recomendável manter esse tipo</p><p>de material em temperatura ambiente por muito tempo.</p><p>Amostras pequenas devem ser embrulhadas em gazes umedecidas com salina para evitar ressecamento,</p><p>além da solução de preservação de ácidos nucleicos. Tecidos sólidos apresentam muitas endonucleases e</p><p>devem ser processados ou congelados o mais rápido possível!</p><p>Tecidos de biopsia embebidos em fixadores utilizados para a preservação de</p><p>tecidos para exame histopatológico não devem ser empregados para os exames de</p><p>biologia molecular!</p><p>A estabilidade do tecido depende do tipo de tecido coletado.</p><p>Observe a estabilidade do DNA nas seguintes condições:</p><p>Mantido em banho de gelo triturado ou refrigerado em temperatura entre 2°C</p><p>e 8°C</p><p>Até 24h</p><p>Congelado a -20°C Duas semanas</p><p>Congelado a -70°C Dois anos</p><p>Eldio dos Santos.</p><p>Se houver impossibilidade de congelar ou usar a solução preservadora, a amostra deve permanecer em</p><p>ambiente com gelo, inclusive no transporte e ser processada em 24 horas para o isolamento do DNA.</p><p>Quando a amostra for coletada para a extração do RNA, essa amostra deve ser rapidamente congelada em</p><p>nitrogênio líquido (-196°C) antes de ser congelada a -70°C, processada em no máximo uma hora após a</p><p>coleta ou colocada em solução estabilizadora do RNA. No momento da extração, as amostras não podem</p><p>ser descongeladas, e sim homogeneizadas diretamente em solução adequada para a extração (chamado</p><p>agente de extração, geralmente isotiocianato de guanidina). Os tubos de coleta também devem ser livres de</p><p>RNases, estéreis e apenas manipulá-los com luvas, para evitar a degradação do RNA.</p><p>Normalmente, em temperatura de -20°C, as RNases ainda estão ativas, assim, é recomendado manter as</p><p>amostras para análise de RNA em temperaturas inferior ou igual a -70°C.</p><p>Células bucais</p><p>A coleta das células bucais para a extração de DNA ou RNA pode ser realizada por meio de um raspado de</p><p>células da parte interna da boca utilizando um swab (cotonete estéril, específico para coleta de exames</p><p>microbiológicos) ou a partir do bochecho. Para extração de RNA, essa amostra deve ser inserida em um</p><p>tubo contendo solução estabilizante de RNA/DNA. De forma diferente, amostras para extração de DNA</p><p>podem ser secas ou estabilizadas e transportadas à temperatura ambiente. As amostras estabilizadas</p><p>dentro do tubo possuem validade de até uma semana em temperatura ambiente, podendo ser transportadas</p><p>sem maiores cuidados.</p><p>Alguns swabs mais longos também podem ser utilizados para coletar material presente na orofaringe e na</p><p>nasofaringe para o diagnóstico de algumas doenças, em que o agente infectante colonize as vias</p><p>respiratórias, como o novo coronavírus e o vírus influenza.</p><p>Atualmente, as empresas enviam os kits de coleta para o paciente realizar o procedimento em casa: o swab</p><p>deve ser esfregado na parte interna da bochecha, cerca de 10 vezes de cada lado e, em seguida, inserido no</p><p>tubo que vem no kit contendo a solução estabilizante. Os erros mais comuns que ocorrem nesse tipo de</p><p>abordagem são: o paciente descartar a solução estabilizante, a contaminação do swab com restos de</p><p>alimentos, batom e em outros casos até mesmo o paciente não identificar corretamente o tubo.</p><p>Deve-se evitar a coleta desse material após refeições, pois não é tão raro encontrar, nas amostras</p><p>encaminhadas para o laboratório, o DNA de alimentos, como frango, bovino etc. nos testes onde</p><p>supostamente era para ser feita a detecção de DNA de um ser humano.</p><p>Coleta de líquido cefalorraquidiano (líquor ou LCR)</p><p>O LCR quando coletado para análise do DNA deve ser coletado em frascos estéreis, transportado na</p><p>temperatura de 2°C a 8°C e, caso não seja processado rapidamente, congelado na temperatura a partir de</p><p>-20°C. Para análise de RNA, se o processamento não for realizado em até 4 horas, essa amostra deve ser</p><p>congelada. No entanto, caso a amostra tenha eritrócitos, esses devem ser removidos antes do</p><p>congelamento.</p><p>Falta pouco para atingir seus objetivos.</p><p>Vamos praticar alguns conceitos?</p><p>Questão 1</p><p>Estudamos as diferenças entre hipótese nula e hipótese alternativa e os possíveis erros gerados a partir</p><p>da interpretação errada dessas análises. O erro tipo 1 consiste em:</p><p>Parabéns! A alternativa E está correta.</p><p>O erro tipo 1 acontece quando rejeitamos a hipótese nula, sendo esta verdadeira, ou seja, não</p><p>aceitamos que não existe relação causa-efeito. Sendo assim, temos um resultado falso-positivo. Um</p><p>resultado falso-positivo é quando, por exemplo, assumimos que um paciente tem uma doença, quando</p><p>na verdade ele não tem.</p><p>Questão 2</p><p>O armazenamento de amostras biológicas é fundamental para uma boa análise. Com base no que</p><p>estudamos, qual seriam as melhores condições para armazenamento de uma amostra de tecido, por</p><p>mais de 1 semana, para a extração de RNA?</p><p>A Não rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese nula é falsa.</p><p>B Não rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese nula é verdadeira.</p><p>C Não rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese nula e a alternativa são falsas.</p><p>D Rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese nula é falsa.</p><p>E Rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese nula é verdadeira.</p><p>A Após a coleta, manter em temperatura ambiente.</p><p>B</p><p>Após a coleta, um rápido congelamento em nitrogênio líquido (-196°C), seguido do</p><p>congelamento a -70°C.</p><p>Parabéns! A alternativa B está correta.</p><p>O RNA tende a uma maior estabilidade quando primeiro congelado em nitrogênio líquido (-196°C), e</p><p>depois em -70°C. Na temperatura de -20°C, as RNases que ainda estão presentes no tecido podem</p><p>degradar o RNA ao longo do tempo. Além disso, amostras de tecidos para análise de material genético</p><p>não podem ser fixadas em soluções fixadoras como o formol!</p><p>2 - Extração e quanti�cação do material</p><p>genético</p><p>C Após a coleta, colocar o tecido em um pote com formol, congelar em nitrogênio líquido</p><p>(-196°C), seguido do congelamento a -70°C.</p><p>D Após a coleta, manter na temperatura de 2°C-8°C por 24 horas.</p><p>E</p><p>Após a coleta, colocar o tecido em um pote com formol, congelar em nitrogênio líquido</p><p>(-196°C), seguido do congelamento a -20°C.</p><p>Ao �nal deste módulo, você será capaz de descrever os</p><p>procedimentos de extração e quanti�cação do DNA e RNA e síntese</p><p>do cDNA.</p><p>Extração do DNA e do RNA a partir das</p><p>amostras coletadas</p><p>Agora que conhecemos todas as etapas pré-analíticas, estamos prontos para colocar a mão na massa!</p><p>Vamos então estudar de fato como é feita a extração do DNA e do RNA a partir das amostras coletadas</p><p>para a obtenção do nosso material genético.</p><p>No entanto, antes de começarmos a estudar a extração, é interessante relembrar que qualquer técnica ou</p><p>procedimento utilizado no laboratório – seja ele qual for – é como fazer um bolo, e por isso devemos seguir</p><p>determinada receita.</p><p>No laboratório, chamamos a receita de POP (procedimento operacional padrão) e temos que ter os</p><p>ingredientes (os reagentes) e os utensílios para fazer o bolo (os materiais e instrumentos).</p><p>Ler a receita e fazer o bolo é um processo mecânico, qualquer pessoa com um mínimo de conhecimento e</p><p>que saiba como manusear os instrumentos consegue seguir o passo a passo, e dependendo da experiência,</p><p>vai conseguir ter um resultado satisfatório.</p><p>No fim do procedimento, pode ser que saia um bolo maravilhoso ou pode ser que não saia. Dessa forma,</p><p>percebemos que é importante saber qual é a função de cada componente do bolo para entendermos o</p><p>processo como um todo. Caso o bolo saia pequeno, faltou fermento, se ele saiu seco é porque faltou leite, e</p><p>assim temos uma noção de causa-efeito. O inverso também é válido: podemos saber tudo sobre como</p><p>funcionam os ingredientes do bolo, o nome da levedura usada no fermento, a temperatura ideal para assar o</p><p>bolo, qual a importância de cada componente na construção do bolo, mas se não soubermos como mexer o</p><p>bolo ou como ligar o forno, o processo simplesmente não funciona!</p><p>Assim como fazer um bolo, é de suma importância primeiro entender os conceitos teóricos da extração do</p><p>DNA e depois ver como funciona o passo a passo da técnica.</p><p>Atenção!</p><p>Antes de iniciar nos procedimentos, é importante ressaltar que, após a obtenção de nossa amostra,</p><p>devemos sempre tomar cuidado onde ela será manipulada e com a preparação dos reagentes, evitando,</p><p>assim, a contaminação com materiais genéticos de outros organismos, ou até mesmo com enzimas que</p><p>podem degradar o nosso material de estudo e gerar resultados falhos.</p><p>Procedimentos de extração de dna</p><p>As células eucariontes possuem uma membrana celular, formada por uma bicamada fosfolipídica, além de</p><p>diversos elementos dispersos no citoplasma, como as proteínas, os carboidratos, as organelas, os lipídios e</p><p>os elementos minerais (sódio, potássio, magnésio, cálcio, entre outros). Além disso, a célula eucarionte</p><p>também possui uma membrana nuclear e dentro do núcleo estão as proteínas, DNA e RNA</p><p>majoritariamente.</p><p>Para a extração do DNA, todos os outros elementos são considerados contaminantes, até mesmo o RNA.</p><p>Assim, a estratégia básica da extração de DNA é, então, separar o DNA de todos esses outros elementos</p><p>que não são DNA. Existem algumas formas diferentes de se fazer isso, mas alguns procedimentos devem</p><p>ser feitos independentemente da forma de extração. A partir da amostra de células, a primeira etapa a ser</p><p>realizada é o rompimento da parede celular (quando as células são de origem vegetal ou fungos), da</p><p>membrana plasmática e da membrana nuclear, liberando, assim, o material genético.</p><p>Podemos fazer isso de diversas formas, a saber: com o uso de detergentes específicos de desestabilizar a</p><p>membrana celular e nuclear, abrasão física, ação de enzimas capazes de degradar a membrana e/ou parede</p><p>celular, pressão osmótica, aquecimento, entre outras.</p><p>Quando a intenção é extrair o DNA, junto ao rompimento das membranas, é importante adicionar uma</p><p>enzima capaz de destruir outras proteínas (proteinases), principalmente para inativar todas as DNases,</p><p>impedindo a degradação do DNA. Em seguida, para remover o RNA, que neste caso é um contaminante,</p><p>basta adicionar RNase no meio. Nessa etapa, já removemos lipídios, proteínas e o RNA, mas ainda faltam os</p><p>carboidratos e os elementos minerais.</p><p>Existem algumas formas de se realizar essa etapa, vamos conhecer as 3 principais.</p><p>Adição de solvente orgânico</p><p>Podemos usar um solvente como o fenol ou o clorofórmio. É importante lembrar que já degradamos</p><p>lipídeos e RNA, rompemos as membranas e, se for o caso, a parede celular. Mas o que acontece?</p><p>O fenol ou clorofórmio tornam essas moléculas insolúveis, assim como os carboidratos e todos os</p><p>elementos minerais. Após a adição dos solventes, seguida da centrifugação, formam-se duas fases:</p><p>Fase aquosa: DNA</p><p>Nesta fase superior, o DNA, que não é solubilizado nos solventes (fenol ou clorofórmio), vai permanecer na</p><p>fase aquosa.</p><p>Fase orgânica</p><p>Nesta fase, todos os outros elementos irão para a fase orgânica (inferior), como proteínas, lipídeos, RNA</p><p>degradados, carboidratos e outros elementos minerais solúveis em fenol/clorofórmio.</p><p>Assim, com auxílio de uma pipeta, podemos transferir a fase aquosa com o DNA para outro tubo.</p><p>Saiba mais</p><p>O RNA degradado se torna nsolúvel, pois forma reações de complexação com outros elementos do</p><p>citoplasma. Se estiver íntegro, ele pode ir para a fase aquosa, dependendo do pH do solvente orgânico.</p><p>Solução concentrada de NaCl</p><p>O cloreto de sódio concentrado é capaz de precipitar os elementos degradados do citoplasma, deixando o</p><p>DNA íntegro na fase aquosa. Assim, basta centrifugar e remover a fase aquosa do pellet precipitado, ou</p><p>seja, recuperar apenas o sobrenadante, pois nele estão nossas substâncias de interesse.</p><p>Pellet</p><p>Pequena porção precipitada de uma solução.</p><p>Coluna de adsorção do DNA</p><p>O DNA possui carga total negativa vinda do grupamento fosfato. Assim, podemos adicionar uma coluna</p><p>com carga positiva (normalmente é utilizada uma coluna de sílica) no nosso tubo e centrifugar. Dessa</p><p>forma, o DNA vai ficar retido na coluna devido à sua carga negativa e os outros elementos irão passar direto</p><p>pela coluna, ficando no fundo do tubo. Para remover o DNA da coluna, usamos um tampão de eluição</p><p>carregado negativamente em grande quantidade. Normalmente, são usados os tampões Tris-HCl ou o</p><p>EDTA. Eles irão competir com o DNA pela ligação na coluna de adsorção e, como estão em grande</p><p>quantidade, ganham a competição e se aderem à coluna expulsando o DNA. O procedimento é feito</p><p>também por centrifugação, porém o material que sairá da coluna será rico em DNA.</p><p>Após a obtenção do DNA por qualquer um desses métodos supracitados, precisamos eliminar qualquer</p><p>resíduo que por um acaso ainda esteja misturado ao DNA. Para isso, adicionamos isopropanol, que precipita</p><p>apenas o DNA. Após centrifugação, como o DNA encontra-se precipitado, nosso DNA puro encontra-se no</p><p>pellet.</p><p>Curiosidade</p><p>O pellet fica bem aderido no fundo do tubo, podemos lavar o tubo com etanol 70%, por exemplo, para</p><p>remover todos os reagentes e secar o tubo, que o DNA continua aderido ao tubo.</p><p>A etapa final consiste em ressuspender DNA (técnica que possibilita que um pellet volte a ficar em solução),</p><p>em água ou em tampão de eluição, basta adicionar um pouco do líquido escolhido e forçar a quebra do</p><p>pellet, no final de todo o protocolo, teremos um tubo contendo apenas o DNA puro.</p><p>O processo de extração de DNA nos plasmídeos é bem semelhante ao processo</p><p>geral de extração de DNA. No entanto, depois da lise da membrana e precipitação</p><p>das proteínas citoplasmáticas, é adicionada uma solução de NaOH com pH</p><p>bastante básico a ponto de desnaturar o DNA cromossomal e o também o próprio</p><p>DNA plasmidial. Em seguida, é adicionada uma solução ácida neutralizadora que</p><p>regenera o DNA plasmidial, mas não o cromossomal. Assim, podemos então</p><p>separar por centrifugação, pois o DNA do plasmídeo fica em suspensão enquanto o</p><p>DNA cromossomal precipita.</p><p>Agora que sabemos os princípios teóricos da extração do DNA, vamos simular uma situação em que</p><p>estamos no laboratório e temos que extrair o DNA de uma amostra coletada. Para isso, vamos utilizar o</p><p>protocolo desenvolvido pela Embrapa (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária) (OLIVEIRA et al.,</p><p>2007).</p><p>Vamos ver se você consegue identificar e entender o passo a passo de um POP utilizado em uma situação</p><p>real. Parece desafiador, mas não se assuste, vamos juntos!</p><p>A primeira etapa é conferir todos os reagentes que vamos precisar. São eles:</p><p>Tampão de digestão.</p><p>Solução de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico (25:24:1).</p><p>Microtubos de polipropileno; frascos e bastões esterilizados.</p><p>Solução Tampão TE (tris-HCL 10 mM; EDTA 1 mM com pH 8.0; tris = hidroximetil aminometano).</p><p>Etanol 70%; etanol absoluto; acetato de amônio 7,5M; micropipetas de 1mL, 200μL, 100μL e 10μL.</p><p>Centrífuga.</p><p>Isopor com gelo.</p><p>Vidraria de laboratório; banho-maria a 50°C.</p><p>Tampão de digestão</p><p>No POP da EMBRAPA, o tampão de digestão</p><p>é formado por NaCl 100 mM; Tris-HCl com pH 8.0 10 mM; EDTA,</p><p>com pH 8.0 25 mM; SDS 0,5% (usado como detergente) e proteinase K 0,1 mg/mL.</p><p>Álcool isoamílico</p><p>O álcool isoamílico serve para prevenir a formação de espuma quando a mistura é agitada, facilitando a</p><p>separação da fase orgânica da aquosa.</p><p>Solução de tampão</p><p>Solução tampão é uma solução em que o pH permanece em uma determinada faixa de pH, mesmo após a</p><p>adição de substâncias ácida ou básica, a não ser que o “tamponamento” seja extrapolado.</p><p>Após conferirmos todo o material, vamos começar a extração do DNA de um tecido de origem animal, e que</p><p>por isso não apresenta parede celular.</p><p>Dica</p><p>Lembre-se de que nossa amostra depois da coleta tem que estar armazenada no gelo, para manter a</p><p>temperatura entre 2°C a 8°C.</p><p>Vamos entender melhor esse processo:</p><p>Se o tecido for duro, devemos macerar, usando um bastão de vidro, e se tiver grande</p><p>quantidade de líquidos, a amostra deve ser centrifugada para remover o líquido em excesso.</p><p>Na primeira etapa da extração, adicionamos o tampão de digestão, na concentração de 1,2mL</p><p>de tampão para cada 100mg de tecido.</p><p>Em seguida, devemos deixar o tubo em banho-maria a 50°C por cerca de 8 a 16 horas, para</p><p>garantir a digestão completa das membranas plasmáticas e nucleares e proteínas. No final, o</p><p>material apresentará um aspecto viscoso. O tempo de incubação no banho-maria varia de</p><p>acordo com o tamanho da amostra.</p><p>A segunda etapa é a extração do DNA com fenol e precipitação dos compostos indesejáveis.</p><p>Para isso, o tubo é retirado do banho-maria e esperamos ele chegar a 37°C para adicionar 5μL</p><p>de RNase, e depois incubamos por 15 minutos sob leve agitação. A adição de RNase é</p><p>opcional e deve ser empregada quando o RNA é considerado um contaminante.</p><p>Nesse POP do EMBRAPA, o etanol é utilizado como agente precipitante do DNA, entretanto poderíamos</p><p>utilizar o isopropanol também.</p><p>Saiba mais</p><p>A unidade volume é usada para padronizar as quantidades em qualquer sistema, supondo um volume de</p><p>500μL de fase aquosa, meio volume significa 250μL e dois volumes significam 1.000μL</p><p>O acetato de amônio facilita a precipitação do DNA pelo etanol e o etanol absoluto, além de concentrar o</p><p>DNA, também ajuda a remover os resíduos remanescentes de fenol e clorofórmio. Centrifugamos a amostra</p><p>a 1.700g por cerca dois minutos. Após a centrifugação, será possível visualizar o >em>pellet bem aderido</p><p>ao fundo do tubo. Removemos toda a solução alcoólica e depois vamos ressuspender o pellet em etanol</p><p>70%. Centrifugamos novamente a 1.700g por dois minutos e tiramos o sobrenadante (uma dica é deixar o</p><p>Em seguida, a solução de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico é adicionada na proporção de</p><p>1:1 com a quantidade de amostra do tubo, ou seja, para cada 500μL de material, adicionamos</p><p>500μL de solução de fenol. É importante atentarmos para o pH da solução de fenol, pois em</p><p>pH abaixo de 7.0 o DNA é degradado e vai para a interface, região entre a fase orgânica e a</p><p>fase aquosa, mas é preconizado para extração de RNA. Resumindo: a solução de fenol com</p><p>pH em torno de 7.0 é usada para extração de DNA e em pH entre 4,5 e 5,5 é usado na</p><p>extração de RNA.</p><p>Após a adição do fenol, homogeneizamos e centrifugamos o tubo por dez minutos a 1.700g.</p><p>Uma vez com as fases aquosa e orgânica bem definidas, separamos a fase aquosa contendo</p><p>o DNA e descartamos a fase orgânica com todos os contaminantes. Nessa etapa, é</p><p>importante separar bem as fases, pois o fenol pode ser um contaminante, então é</p><p>recomendado centrifugar duas vezes.</p><p>A terceira fase é a purificação do DNA por meio da precipitação com etanol. Antes de</p><p>usarmos o etanol em si, adicionamos meio volume de acetato de amônio 7,5M e dois</p><p>volumes de etanol absoluto.</p><p>tubo aberto por um tempo, para o etanol evaporar por inteiro). Agora com o pellet limpo, a fase final é a</p><p>adição do tampão TE, para facilitar a dissolução do DNA, ou ainda podemos deixar o tubo em banho-maria a</p><p>50°C por algumas horas.</p><p>Recomendação</p><p>Vale lembrar que, nesse exemplo, estamos extraindo o DNA a partir de amostras de tecidos. No entanto,</p><p>existem variações do protocolo. Mesmo que a amostra também seja proveniente de tecido, o protocolo</p><p>pode ser modificado, com a utilização de outros reagentes. Entretanto, esse é o procedimento básico e em</p><p>geral usado em laboratórios para extração de DNA.</p><p>Procedimentos de extração de RNA</p><p>O procedimento de extração de RNA é bem parecido com o método de extração de DNA, mesmo o RNA</p><p>sendo mais frágil e demandando mais cuidados. Todo material que entra em contato com a amostra deve</p><p>ser tratado com soluções neutralizadoras de RNase e possuir a característica de ser RNase free. Além disso,</p><p>a amostra deve sempre ser refrigerada em nitrogênio líquido ou gelo para evitar a ação de alguma RNase</p><p>remanescente.</p><p>Vamos agora rever as três etapas do protocolo de extração de DNA, ressaltando quais são as diferenças</p><p>entre a extração do DNA e RNA.</p><p>Fase 1</p><p>Quebra da membrana - A quebra pode ser feita de forma mecânica ao invés de utilizar o tampão de</p><p>digestão, usando um pistilo, bastão ou sonicador, aparelho capaz de utilizar energia das ondas sonoras para</p><p>agitar partículas. Esta técnica apresenta uma vantagem: por ser mais rápida, diminui a chance de</p><p>degradação do RNA.</p><p>Fase 2</p><p>Extração do RNA - Não são utilizadas as RNases. A solução de fenol/clorofórmio na extração de RNA deve</p><p>ter pH ácido (entre 4,5 e 5,5) para que o RNA fique na fase aquosa e o DNA fique na interface (essa fase</p><p>intermediária só é formada durante a extração do RNA devido ao pH ácido).</p><p>Fase 3</p><p>Purificação do RNA - A purificação do RNA é muito parecida com a do DNA, a diferença está no</p><p>armazenamento: para RNA é preferível utilizar nitrogênio líquido.</p><p>Vamos acompanhar o passo a passo a seguir:</p><p>Extração de DNA/RNA</p><p>Amostra inicial com as células digeridas.</p><p>Adição de solução fenol/clorofórmio</p><p>Centrifugação da amostra, formando duas fases: orgânica (em amarelo no fundo do tubo) e</p><p>aquosa (em azul acima da fase orgânica). No tubo A, temos DNA e RNA dissolvidos na fase</p><p>aquosa e no tubo B o DNA degradado fica na interface.</p><p>Separação da fase orgânica por centrifugação</p><p>A fase orgânica é descartada, permanecendo apenas a fase aquosa no tubo.</p><p>Adição de acetato de amônio e etanol absoluto</p><p>Após centrifugar, ocorre a formação de um pellet no fundo do tubo. Todo o líquido restante é</p><p>descartado.</p><p>Importância do DNA na Biologia</p><p>Molecular</p><p>Confira agora a importância do DNA na Biologia Molecular, entendendo como o material genético obtido</p><p>será utilizado.</p><p>Armazenamento do DNA e do RNA</p><p>puri�cados</p><p>Ressuspensão e armazenamento do material genético</p><p>extraído</p><p>O pellet é ressuspendido em tampão TE e agora o DNA ou RNA pode ser armazenado.</p><p></p><p>Após o isolamento (purificação), o DNA e o RNA precisam receber cuidados imediatos. Para o DNA,</p><p>devemos armazená-lo em um tubo de plástico (preferencialmente de propileno) vedado a fim de evitar</p><p>evaporação, em uma temperatura abaixo de 0°C. Dessa forma, diminuímos a atividade biológica das</p><p>DNases.</p><p>O DNA purificado é mantido em solução tampão tris-EDTA, com pH 7,2. A validade do DNA nessas</p><p>condições, é bastante alta. Confira:</p><p>Plástico</p><p>O DNA tem afinidade por vidro, por isso o uso de tubos de plástico.</p><p>Propileno</p><p>Tipo de polímero que não interage com o DNA.</p><p>Temperatura ambiente Até 26 semanas</p><p>Temperaturas baixas de 2°C a 8°C 1 ano</p><p>Congelado a -20°C 7 anos</p><p>Congelado a -70°C +7 anos</p><p>Atenção!</p><p>O DNA purificado é bastante resistente, uma vez que a sua solução não contenha água, pois a água quando</p><p>congela forma cristais que podem danificar os materiais orgânicos.</p><p>Após a extração do RNA, ele deve ser armazenado como um precipitado em etanol a 70% congelado na</p><p>temperatura de -70°C. Alguns estudos mostram que, após 2 meses, mantido na temperatura de -20°C, o RNA</p><p>não perde sua integridade. No entanto, é importante destacar que, na temperatura de -20°C, ainda temos</p><p>uma atividade RNases, sendo assim mais recomendado o congelamento em temperaturas de -70°C ou</p><p>inferior. Assim como no DNA, os tubos devem ser de plástico estéril e manuseados com luvas limpas por</p><p>uma solução de água com dietilpirocarbonato (composto capaz de eliminar RNases dos tubos) ou então por</p><p>tubos com garantia de serem RNase-free.</p><p>O etanol auxilia na precipitação do RNA, ajudando a concentrá-lo. Dessa forma, o RNA fica menos suscetível</p><p>a agentes degradantes.</p><p>Quanti�cação, análise de pureza e</p><p>integridade do material molecular</p><p>A extração do DNA/RNA é sem nenhuma dúvida um dos processos mais importantes da Biologia Molecular,</p><p>pois esses materiais servem de matéria-prima para diversas outras técnicas da Biologia Molecular, como a</p><p>reação da cadeia da polimerase (PCR), sequenciamento, clonagem, hibridização, entre outras. Uma boa</p><p>extração determina a qualidade do resultado dessas técnicas. O controle de qualidade da extração é dado</p><p>pela quantificação, pureza e integridade desses materiais.</p><p>Vamos entender melhor esses procedimentos?</p><p>Quanti�cação</p><p>Na quantificação, determinamos a quantidade de DNA/RNA extraído da amostra inicial. A técnica mais</p><p>utilizada é a fluorometria. Nesta técnica, uma pequena alíquota da amostra é transferida para outro tubo,</p><p>onde é adicionada uma solução e um agente fluorescente capaz de se ligar entre as bases do DNA e RNA.</p><p>Quando o agente fluorescente (fluoróforo) se liga a algo (DNA ou RNA), ele emite fluorescência e assim</p><p>podemos medir, com ajuda de um aparelho (fluorímetro), a quantidade de fluorescência da amostra.</p><p>A quantidade de fluorescência da amostra é diretamente proporcional, ou seja,</p><p>quanto maior for a fluorescência, maior é a quantidade de DNA ou RNA.</p><p>Uma vantagem dessa técnica é que ela é simples e, após a quantificação, sabemos se temos a quantidade</p><p>de material suficiente para as próximas etapas. Além disso, podemos utilizar diferentes agentes</p><p>fluorescentes: um específico para DNA e outro específico para RNA. Assim, podemos quantificar o quanto</p><p>temos de cada um desses materiais moleculares.</p><p>Quantificação do DNA fluorescente. Na foto, temos o gráfico de duas amostras de DNA diferentes. Tradução: dsDNA = double-strand DNA;</p><p>A1= amostra 1; A2= amostra2.</p><p>Pureza</p><p>Em relação à pureza, podemos avaliar se um DNA ou RNA apresenta contaminantes. A pergunta aqui é: será</p><p>que com o material extraído temos também fenol, álcool, proteínas, RNA (quando o desejo é DNA) e algum</p><p>reagente residual?</p><p>Para essa análise, a técnica mais utilizada é a espectrofotometria.</p><p>Antes de entender a técnica, é importante lembrar que luz visível é uma pequena parte de todo o espectro de</p><p>radiação eletromagnética existente, compreendendo comprimentos de onda entre 380-750 nm. Os</p><p>comprimentos de ondas inferiores estão na zona de espectro da ultravioleta (UV) e superiores na zona de</p><p>infravermelho. Quando uma luz branca passa por um prisma, ela se decompõe em raios de luz de diferentes</p><p>comprimentos de onda, variando do vermelho ao violeta. Em um arco-íris, por exemplo, enxergamos 7</p><p>diferentes cores, cada uma dessas cores representa uma diferente faixa de comprimento de onda.</p><p>Comprimento de onda no espectro da luz. UV e infravermelho não são visíveis.</p><p>Além disso, é importante relembrar que todo o composto químico apresenta a capacidade de absorver,</p><p>transmitir ou refletir a luz em determinado comprimento de onda.</p><p>Assim, a espectrofotometria tem como princípio básico utilizar a capacidade das moléculas orgânicas de</p><p>absorverem (absorbância) ou transmitir (transmitância) luz em determinado comprimento de onda, em um</p><p>equipamento chamado de espectrofotômetro.</p><p>A partir dela, podemos identificar os componentes em uma solução, pois as biomoléculas apresentam</p><p>espectros característicos ao UV, visível ou infravermelho. Por exemplo, já é estabelecido que as proteínas</p><p>absorvem comprimentos de onda de 280nm; o RNA e DNA absorvem no comprimento de onda de 260nm e</p><p>o fenol e outros constituintes no comprimento de onda de 230nm.</p><p>Saiba mais</p><p>Além da possibilidade de indicar a biomolécula presente, podemos quantificá-la. Na prática, a quantidade de</p><p>luz absorvida é diretamente proporcional à concentração da substância, assim, quanto maior for a</p><p>concentração, maior é a absorção de luz (medido pela densidade óptica – OD).</p><p>Confira o passo a passo para a realização dessa técnica:</p><p>Etapa 1</p><p>Nesta etapa, precisamos indicar para o aparelho onde nossa amostra está diluída um procedimento</p><p>parecido com a tara da balança. Para isso, apenas o tampão usado na extração é colocado em uma cubeta</p><p>transparente e limpa, e no aparelho, ajustamos o comprimento de onda desejado.</p><p>Etapa 2</p><p>Nesta etapa, quando a luz incide na cubeta, apenas uma quantidade consegue ultrapassar a amostra e o</p><p>aparelho consegue quantificar a luz que é absorvida (absorbância) e isso gera um valor.</p><p>Etapa 3</p><p>Nesta etapa, como nesse momento apenas temos o tampão, informamos ao aparelho que esse é nosso</p><p>controle e que essa leitura não deve ser considerada, zerando o aparelho.</p><p>Etapa 4</p><p>Nesta etapa, colocamos a amostra com o material purificado em outra cubeta transparente e limpa e</p><p>medimos a luz absorvida, que representa a quantidade da substância analisada.</p><p>Lembre-se de que isso depende do comprimento de onda que estamos pesquisando (280nm, 260nm ou</p><p>230nm). Novamente, aqui, quanto maior for a absorção de luz, maior a quantidade de determinado material.</p><p>Na imagem a seguir, vemos um resultado de uma análise espectrofotométrica, mostrando um pico de</p><p>absorção da luz no comprimento de onda 260nm, o que indica a presença de DNA ou RNA.</p><p>Resultado de uma análise de espectrofotometria.</p><p>Com os resultados, podemos verificar a pureza a partir da razão (divisão) da densidade óptica (OD) no</p><p>comprimento de onda 260nm pela OD no comprimento de onda 280nm.</p><p>Dizemos que o material genético está puro quando essa relação é maior ou igual a 1,8. Valores inferiores a</p><p>esse indicam contaminação com proteínas e que o processo extrativo não foi realizado de forma correta.</p><p>Outra forma de verificar essa pureza seria pela razão entre a OD 260nm OD 230nm, com material genético</p><p>considerado puro quando estiver na faixa entre 1,8-2,2.</p><p>Integridade</p><p>Integridade avalia se o DNA/RNA extraído está íntegro. Essa avaliação é feita a partir da técnica</p><p>de eletroforese. A eletroforese é uma técnica com uma enorme quantidade de variações e desdobramentos</p><p>e é utilizada para os mais variados objetivos. Aqui iremos nos ater ao princípio básico da técnica e a sua</p><p>aplicação no controle da integridade do material que foi extraído.</p><p>Esta técnica consiste na migração e separação de moléculas de acordo com a carga após a geração de um</p><p>campo elétrico. Ela utiliza diferentes meios de suporte, como fitas ou membranas de poliacetato de celulose</p><p>e géis de agarose, que apresentam poros por onde as moléculas devem passar.</p><p>Saiba mais</p><p>No nosso organismo, as moléculas apresentam diferentes cargas. O DNA/RNA, devido ao grupamento</p><p>fosfato, apresenta carga negativa. Além disso, as moléculas são separadas pelo tamanho.</p><p>Para isso, uma pequena quantidade de amostra é aplicada em um gel, geralmente a agarose, inerte (que não</p><p>reage com a amostra) em um poço (local de aplicação da amostra). Em seguida, é gerado um campo</p><p>elétrico onde um polo do gel fica com a carga negativa (local onde a amostra é aplicada) e outra positiva.</p><p>Como o DNA/RNA possui carga negativa, migrará para o polo positivo através do gel. No entanto, esse gel</p><p>apresenta poros, conferindo resistência ao movimento das moléculas. Assim, moléculas mais pesadas e</p><p>maiores ficarão presas no gel, enquanto as menores e mais leves migram com mais facilidade no gel.</p><p>Esquema da eletroforese para DNA.</p><p>Após a eletroforese, podemos detectar o DNA/RNA pela coloração (normalmente é utilizado o brometo de</p><p>etídio, um corante que intercala no DNA) e visualização de bandas de DNA em um equipamento chamado</p><p>transiluminador. Se a amostra estiver íntegra, verificamos apenas uma marca (banda) intensa no gel de</p><p>eletroforese. No entanto, caso a nossa amostra esteja fragmentada, essa banda se apresenta</p><p>“espalhada”</p><p>(arraste) ao longo do comprimento do gel, indicando que existem diversos fragmentos, ou seja, o DNA/RNA</p><p>não está íntegro.</p><p>Bandas bem de�nidas</p><p>Bandas com arraste</p><p>Síntese de cDNA</p><p>Como aprendemos anteriormente, existem várias técnicas na Biologia Molecular, PCR, sequenciamento,</p><p>clonagem e hibridização que são dependentes da matéria-prima (DNA, na maioria dos casos). Essas</p><p>técnicas podem ser utilizadas para diferentes fins, mas nem sempre a simples extração de DNA/RNA é</p><p>suficiente para analisar o que se deseja.</p><p>Vamos supor que queremos verificar se a expressão de uma proteína x está alta ou baixa nas células de um</p><p>tecido. Para isso, extraímos o DNA e o material purificado representa todo o DNA da célula, incluindo o gene</p><p>x, responsável pela expressão da proteína x. Entretanto, a detecção do gene x não indica muito sobre a</p><p>expressão da proteína, uma vez que não conseguimos saber se ele foi transcrito, se o splicingalternativo</p><p>gerou a proteína correta, se o RNAm foi devidamente processado. Nesse caso, o ideal é avaliar o RNAm, já</p><p>processado, sem a presença de íntrons.</p><p>Além disso, algumas técnicas utilizam apenas o DNA para realizar a amplificação e detecção, como PCR.</p><p>Splicing alternativo</p><p>Procedimento realizado pelas células para a maturação do RNA mensageiro (RNAm).</p><p>ntrons</p><p>Íntrons são trechos de RNA retirados do RNAm maduro durante o processamento do RNA.</p><p>Por exemplo, queremos ver se uma pessoa tem uma infecção pelo novo coronavírus (Sars-CoV-2), um vírus</p><p>de RNA. Nesse caso, a amostra extraída é o RNA viral, mas é inviável a sua detecção, pois precisamos de</p><p>grandes quantidades de material, preferencialmente de DNA, por ser mais estável. Logo, o material precisa</p><p>ser multiplicado o suficiente para poder ser devidamente analisado. Para isso, usamos a técnica do PCR,</p><p>que consiste em amplificar uma amostra de DNA.</p><p>Então fica uma dúvida: como fazer essa análise? Isso porque, segundo o dogma central da Biologia, o DNA é</p><p>transcrito em RNA e o RNA é traduzido em proteína.</p><p>Essa questão foi resolvida por meio de outro vírus, o vírus da imunodeficiência humana (HIV), que</p><p>revolucionou a Biologia Molecular. Vamos entender como?</p><p>Este é um vírus de RNA, que após a penetração na célula-alvo, injeta o RNA viral no citoplasma. Lá, uma</p><p>proteína do vírus chamada transcriptase reversa converte o RNA em DNA, esse DNA entra no núcleo e outra</p><p>proteína chamada integrase junta o DNA do vírus com o da célula-alvo. Agora, a célula-alvo é capaz de</p><p>transcrever o DNA viral (presente no genoma da célula hospedeira) em RNA viral, que forma outro vírus de</p><p>HIV, e assim continua o processo de infecção.</p><p>Comentário</p><p>Nesse processo, algo muito curioso acontece: a transcriptase reversa do vírus é capaz de alterar o dogma</p><p>central da Biologia, transformando o RNA em DNA.</p><p>E se usássemos essa polimerase na Biologia Molecular para gerar DNA a partir de, por exemplo, um RNA</p><p>mensageiro (RNAm)? E assim foi feito.</p><p>O DNA obtido a partir do RNA é chamado de cDNA (DNA complementar). Recebe esse nome pois é</p><p>complementar ao RNA molde.</p><p>A construção do cDNA é feita em um tubo contendo:</p><p>RNA molde: é a sequência de RNA usada para a construção do cDNA.</p><p>Transcriptase reversa: é a polimerase capaz de transcrever o RNA em cDNA.</p><p>Nucleotídeos (A, T, C, G): são unidades funcionais para a síntese do cDNA.</p><p>Íon bivalente de magnésio (Mg2+): é um cofator essencial para o funcionamento da transcriptase reversa.</p><p>Primers: são pequenos fragmentos de DNA fita simples que se complementam ao RNA para dar início à</p><p>transcrição reversa.</p><p>DNA polimerase: responsável por sintetizar o DNA a partir dos nucleotídeos presentes.</p><p>A síntese do cDNA começa pelo anelamento do primer no RNA, seguido pelo acoplamento da transcriptase</p><p>reversa e início da sua atividade, formando o cDNA no sentido 5’ – 3’. Uma vez formado o cDNA, o</p><p>fragmento de RNA usado como molde é degradado pela RNase H, um domínio do próprio complexo da</p><p>transcriptase reversa.</p><p>Síntese do cDNA.</p><p>Durante a construção do cDNA, uma etapa crítica para termos um cDNA de boa qualidade é a construção do</p><p>primers. Existem três estratégias gerais de construção de primers:</p><p>É o primer formado por vários nucleotídeos do tipo timina que se anela a cauda poli-A do RNAm</p><p>maduro. A cauda tem esse nome por ser formada de 80 a 250 resíduos de adenina. A cauda serve</p><p>para proteger o RNAm de degradação enzimática durante todo o processo de locomoção em direção</p><p>ao ribossomo. A cauda poli-A é clivada por endonucleases quando o RNAm encontra o ribossomo.</p><p>Ele é preferencialmente utilizado quando queremos fazer cDNA de RNAm. Para o oligo dT é</p><p>importante que o RNAm esteja íntegro, uma vez que ele se anela na extremidade 3’ do molde. Se o</p><p>RNAm estiver fragmentado, o cDNA vai ser feito apenas de um pequeno trecho e talvez seja não</p><p>funcional.</p><p>Este primer é feito de pequenas sequências aleatórias que se anelam a qualquer RNA presente,</p><p>incluindo rRNA (RNA ribossomal) e tRNA (RNA transportador). Ele é indicado para amostras de</p><p>sequência desconhecida ou de difícil manipulação.</p><p>Oligo dt </p><p>Randômico </p><p>É o primer construído especificamente para um determinado RNA, sendo utilizado quando se tem um</p><p>alvo determinado, por exemplo, diagnosticar um RNA viral. O primer é desenhado de forma</p><p>complementar ao RNA viral. Por isso, ao término da reação, só teremos cDNA se o primer encontrar</p><p>o seu RNA alvo. Para o primer específico, é fundamental que toda a sequência do DNA/RNA seja</p><p>conhecida.</p><p>É importante ressaltar que os três tipos de primers podem ser combinados, formando um primer com um</p><p>trecho oligo dT e outro trecho específico. Dessa forma, teremos uma transcrição da porção 3’ de um RNA</p><p>molde específico ou oligo dT com um randômico, para tentar formar cDNA de qualquer RNAm do material</p><p>inicial. A combinação de primers depende de criatividade do pesquisador e da sua capacidade de otimizar a</p><p>síntese do cDNA.</p><p>Nesse ponto, temos então uma fita de cDNA íntegra, recém-formada pela transcriptase reversa e uma fita de</p><p>RNA ligada ao cDNA parcialmente degradada pela RNase H. Assim, sintetizamos um RNAm maduro, sem a</p><p>presença de íntrons. Esses fragmentos de RNA serão utilizados como primers de iniciação pela DNA</p><p>polimerase que irá construir o DNA complementar ao cDNA.</p><p>Com isso, temos finalmente a fita dupla de DNA formada.</p><p>Formação da fita dupla de cDNA.</p><p>Na imagem, vemos que o RNAm se liga ao primer oligo dT(1). Em seguida, a transcriptase reversa sintetiza</p><p>uma fita de cDNA (sequência de bases representada pela linha azul), a partir do primer oligo dT ligado ao</p><p>RNA(2). A RNAse H quebra o RNAm associado ao cDNA recém sintetizado. Os dNTPs presentes no meio</p><p>reacional são usados para a construção de uma nova fita de DNA complementar ao cDNA, pela ação da</p><p>DNA polimerase(3). Com isso, a fita dupla de cDNA é formada (4).</p><p>A construção de cDNA tem como funções principais:</p><p>Específico </p><p>Possibilitar a construção de uma biblioteca genômica, estabelecendo relações de quais genes podem</p><p>expressar determinadas proteínas, o que pode ser aplicado para elaboração de terapias, estudo de</p><p>espécies, doenças etc.</p><p>Possibilitar a amplificação de RNA pela PCR.</p><p>Determinar o nível de expressão gênica de uma determinada proteína no organismo.</p><p>O cDNA pode ser utilizado na clonagem, criação de bibliotecas, testes de microarranjo, detecção de SNP</p><p>etc.</p><p>Clonagem</p><p>Formação de novos trechos de DNA em outro indivíduo.</p><p>Bibliotecas</p><p>São responsáveis por identificação e armazenamento de informação gênica.</p><p>Microarranjo</p><p>Serve como uma coleção de DNAs presos em uma superfície sólida, para estudos de genotipagem, expressão,</p><p>entre outros.</p><p>SNPs</p><p>Do inglês Single Nucleotide Polymorphism, são variações pontuais encontradas ao longo do DNA, isto é, são</p><p>diferenças num único nucleotídeo.</p><p>Falta pouco para atingir seus objetivos.</p><p>Vamos praticar alguns conceitos?</p><p>Questão 1</p><p>Vimos que existem diferentes técnicas para avaliação da qualidade das amostras de DNA e RNA</p><p>obtidas. Além disso, vimos que uma das técnicas</p><p>é a mais utilizada para quantificar as amostras. Sobre</p><p>esse assunto, marque a alternativa correta.</p><p>Parabéns! A alternativa C está correta.</p><p>A técnica mais utilizada para quantificação de amostras de RNA e DNA é a fluorometria, a partir da</p><p>detecção da fluorescência, podemos inclusive diferenciar o RNA e o DNA com essa técnica. Também</p><p>podemos usar a espectrofotometria, mas esta é limitada, uma vez que RNA e DNA se encontram na</p><p>mesma faixa de absorção de luz.</p><p>Questão 2</p><p>A extração de DNA/RNA é uma importante técnica de biologia molecular a qual pode ser empregada</p><p>em amostras clínicas, alimentos, forenses, plantas entre outras. A partir da extração de DNA/RNA, é</p><p>possível a realização de outras técnicas moleculares como a quantificação de material genético e</p><p>reação em cadeia de polimerase (PCR). Sobre a técnica de extração de DNA/RNA, responda qual</p><p>desses elementos abaixo é empregado na extração de DNA/RNA?</p><p>A Espectrofotometria: conseguimos quantificar a partir do valor de luz refratada.</p><p>B Eletroforese: quantificamos a partir do tamanho da banda final gerada.</p><p>C Fluorometria: quantificamos a partir da intensidade da fluorescência.</p><p>D PCR: quantificamos a partir da quantidade de DNA final gerado.</p><p>E Precipitação em NaCl: quantificamos a partir do tamanho do pellet gerado.</p><p>A Transcriptase reversa</p><p>B Nucleotídeos</p><p>Parabéns! A alternativa C está correta.</p><p>Todos os itens citados são utilizados em algum momento na síntese do cDNA, com exceção da</p><p>solução de fenol/clorofórmio. Esta é utilizada na extração de DNA/RNA. A transcriptase reversa faz a</p><p>fita de cDNA a partir do RNA, os nucleotídeos são usados para a construção do cDNA, o RNA molde é o</p><p>que queremos usar para ter o DNA complementar e o Mg2+ é um cofator da reação da transcriptase</p><p>reversa.</p><p>Considerações �nais</p><p>Ao longo desta jornada, aprendemos que é possível usar o método científico para quase todas as ações do</p><p>nosso dia a dia. Vimos também que o desenho experimental é uma ramificação do método científico.</p><p>Visitamos todas as suas etapas, variáveis, hipóteses, erros e o tipo de amostragem que devemos utilizar</p><p>para chegar a uma conclusão confiável.</p><p>Com o desenho experimental em mente, partimos para as etapas pré-analíticas de transporte, coleta e</p><p>armazenamento do material biológico seguido da extração de DNA e RNA, e o controle de qualidade do</p><p>purificado obtido.</p><p>Por fim, entendemos a importância do cDNA e a técnica de construção do cDNA. Esse foi, sem dúvida um</p><p>marco que possibilitou o aprofundamento de diversas técnicas da Biologia Molecular. Ao longo dos anos, a</p><p>Biologia Molecular está sendo desenovelada, mostrando a sua face e permitindo que você adentre ainda</p><p>mais em seus conceitos. Agora cabe a você continuar esta jornada!</p><p>C Solução de fenol/clorofórmio</p><p>D RNA molde</p><p>E Mg2+</p><p>Podcast</p><p>Ouça agora um resumo do tema estudado.</p><p></p><p>Explore +</p><p>Para saber mais sobre os assuntos tratados neste tema:</p><p>Assista:</p><p>Ao vídeo Como é feito um TESTE DE DNA?</p><p>Ao vídeo Eletroforese horizontal de DNA em gel de agarose.</p><p>Leia:</p><p>Aprenda a fazer extração de DNA em casa, Hemocentro da FMRP-USP, e conheça a técnica de extração</p><p>utilizando cebola e materiais que temos dentro de casa.</p><p>O artigo Coleta, transporte e armazenamento de amostras para diagnóstico molecular, de Murilo Rezende</p><p>Melo e colaboradores (2010).</p><p>Referências</p><p>AL SOUD, W. A.; RADSTROM, P. Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood</p><p>cells. J Clin Microbiol, v. 39, p. 485-93, 2001.</p><p>AUSUBEL, F. M. Current protocols in molecular biology ‒ 1987‒1988. Hoboken, NJ: John Wiley & Sons, 1987.</p><p>BELOTSERKOVSKII, B. P. et al. Polypropylene tube surfaces may induce denaturation and multimerization of</p><p>DNA. Science, v. 271, p. 222, 1996.</p><p>FEIGELSON, H. S. et al. Determinants of DNA yield and quality from buccal cell samples collected with</p><p>mouthwash. Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers, v. 10, n. 9, p. 1005-1008, 2001.</p><p>GUBLER, U.; HOFFMAN, B. J. A simple and very efficient method for generating cDNA libraries. Gene, v. 25,</p><p>n. 2-3, p. 263-269, 1983.</p><p>LAZAR, J.; FENG, J. H.; HOCHHEISER, H. Research methods in human-computer interaction. Burlington,</p><p>Massachusetts: Morgan Kaufmann, 2017.</p><p>MELO, M. R. et al. Coleta, transporte e armazenamento de amostras para diagnóstico molecular. In: Jornal</p><p>Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial, v. 46, n. 5, p. 375-381, 2010.</p><p>NUOVO, G. J. In situ detection of PCR-amplified DNA and cDNA: a review. Journal of Histotechnology, v. 17,</p><p>n. 3, p. 235-246, 1994.</p><p>OLIVEIRA, M. C. de S. et al. Fundamentos teórico-práticos e protocolos de extração e de amplificação de</p><p>DNA por meio da técnica de reação em cadeia de polimerase. Embrapa Pecuária Sudeste - Livro científico,</p><p>2007.</p><p>RODRIGUES JR., J. F. Pesquisa Experimental. 2018. Escrita Científica USP, s. d.</p><p>SANTELLA, R. M. Approaches to DNA/RNA extraction and whole genome amplification. Cancer</p><p>Epidemiology and Prevention Biomarkers, v. 15, n. 9, p. 1585-1587, 2006.</p><p>SHOKERE, L. A.; HOLDEN, M. J.; JENKINS, G. R. Comparison of fluorometric and spectrophotometric DNA</p><p>quantification for real-time quantitative PCR of degraded DNA. Food control, v. 20, n. 4, p. 391-401, 2009.</p><p>VISVIKIS, S.; SCHLENCK, A.; MAURICE, M. DNA extraction and stability for epidemiological studies. In:</p><p>Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM), v. 36, n. 8, p. 551-555, 1998.</p><p>Material para download</p><p>Clique no botão abaixo para fazer o download do conteúdo completo em formato PDF.</p><p>Download material</p><p>O que você achou do conteúdo?</p><p>Relatar problema</p><p>javascript:CriaPDF()</p>