1 - Descobrindo o DNA e a Origem da Vida

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<p>Biologia Molecular</p><p>Aplicada à Biomedicina</p><p>Responsável pelo Conteúdo:</p><p>Prof.ª M.ª Thaís de Oliveira Cardoso</p><p>Revisão Técnica:</p><p>Prof.ª Dra. Gabriela Cavagnolli</p><p>Revisão Textual:</p><p>Prof.ª Dra. Selma Aparecida Cesarin</p><p>Descobrindo o DNA e a Origem da Vida</p><p>Descobrindo o DNA</p><p>e a Origem da Vida</p><p>• Apresentar ao aluno as bases da Biologia Molecular, o avanço histórico e como ela se relaciona</p><p>com as demais Áreas da Ciência;</p><p>• Apresentar a estrutura do DNA e como ocorre a replicação do DNA;</p><p>• Abordar o reparo do DNA e o desenvolvimento do câncer.</p><p>OBJETIVOS DE APRENDIZADO</p><p>• A Origem da Vida e a Evolução Molecular dos Organismos;</p><p>• O Dogma Central da Biologia Molecular e suas Exceções;</p><p>• Compreendendo a Estrutura do DNA;</p><p>• Organização do DNA, Estudo dos Cromossomos e Genes;</p><p>• Replicação do DNA;</p><p>• Sistema de Reparo de DNA;</p><p>• Metilação: O Reparo de DNA e o Câncer.</p><p>UNIDADE Descobrindo o DNA e a Origem da Vida</p><p>A Origem da Vida e a Evolução</p><p>Molecular dos Organismos</p><p>Acredita-se que a primeira forma de vida na Terra tenha surgido há cerca de 3,5</p><p>bilhões de anos.</p><p>O processo evolutivo resultou em uma extraordinária diversidade de formas vivas</p><p>e, atualmente, estima-se que mais de dez milhões de espécies habitem a Terra, cada</p><p>qual com suas diferenças e, necessariamente, com capacidade de se multiplicar.</p><p>Figura 1</p><p>Fonte: Fotolia</p><p>Observando um urso e um polvo, quão parecidos você diria que eles são? E você,</p><p>comparado(a) a uma aranha?</p><p>Mesmo em meio a tal paradigma, nossos ancestrais, sem conhecimento da exis-</p><p>tência do ácido desoxirribonucleico (DNA) conseguiram determinar que tudo que era</p><p>“vivo” tinha algo em comum que o capacitava como tal.</p><p>Estudos bioquímicos revelaram que a matéria viva e a matéria inorgânica são</p><p>compostas pelos mesmos elementos, apenas com diferenças em sua organização.</p><p>Assim, tudo é um aglomerado de Sistemas Químicos.</p><p>Posteriormente, determinou-se que o padrão de organização em nível molecular é</p><p>preservado em todos os seres vivos, constituindo uma célula. Logo, a célula é a uni-</p><p>dade mínima que constitui todas as espécies, devendo possuir elementos para obter</p><p>matéria-prima do ambiente e produzir uma nova cópia.</p><p>8</p><p>9</p><p>É possível classificar as células em duas diferentes categorias – procariontes e</p><p>eucariontes (Figura 2), com a diferença de que as células procariontes não possuem</p><p>membrana nuclear e, evolutivamente, antecedem as células eucariontes.</p><p>Eucariote Procarionte</p><p>Nucléolo</p><p>Mitocôndria</p><p>Membrana celular</p><p>Ribossomos</p><p>Nucleóide</p><p>Flagelo</p><p>Núcleo fechado</p><p>por membrana Cápsula</p><p>(alguns procariontes)</p><p>Parede celular</p><p>(em alguns eucariotos)</p><p>Figura 2 – Célula eucarionte e célula procarionte</p><p>Fonte: Adaptado de Wikimedia Commons</p><p>Embora sejam diferentes, é incrível notar que todas as células vivas do Planeta</p><p>Terra, sem qualquer exceção, de acordo com nosso conhecimento, armazenam suas</p><p>informações hereditárias da mesma maneira – na forma de ácidos nucleicos.</p><p>Agora, imagine que você é um cientista vivendo no ano de 1928, e acredita que</p><p>exista alguma forma comum para que os seres vivos armazenem suas informações</p><p>(sem saber da existência do DNA).</p><p>Como você poderia comprovar sua hipótese?</p><p>Parece difícil?</p><p>Vamos facilitar!</p><p>Para isso, você dispõe, em seu Laboratório, de duas linhagens de bactérias – uma</p><p>delas é virulenta, possui uma cápsula de polissacarídeo que previne sua fagocitose e</p><p>é letal quando injetada em camundongos. A outra linhagem é avirulenta, não possui</p><p>cápsula e não transmite doença (quando injetada em camundongos, eles sobrevivem).</p><p>Agora, pense num experimento que comprove que as informações hereditárias</p><p>podem ser transmitidas de um organismo para outro.</p><p>Ficou curioso?</p><p>Então, antes de prosseguir, que tal pesquisar mais na Bibliografia recomendada</p><p>sobre o “Experimento de Griffth”?</p><p>Experimentos Clássicos: DNA como material genético . Acesse em: https://bit.ly/49FMvxG</p><p>Esse foi o primeiro indício da troca de informação genética, sem saber que o</p><p>que permitia isso era a existência do DNA. Assim, foi chamado apenas de “princí-</p><p>pio transformante”.</p><p>9</p><p>UNIDADE Descobrindo o DNA e a Origem da Vida</p><p>Somente em 1944, Avery, MacLeod e McCarty isolaram o “princípio transfor-</p><p>mante”, revelando que o componente responsável pela transformação das linhagens</p><p>bacterianas avirulentas em virulentas era o DNA, fornecendo uma das indicações</p><p>conclusivas de que o DNA é responsável por carregar a informação genética dos</p><p>seres vivos.</p><p>Tudo que se encontra no Planeta é constituído por átomos, unidade básica da</p><p>matéria, que estabelece ligações químicas e, em níveis mais complexos, resulta na</p><p>formação dos seres.</p><p>Vimos que a principal característica que constitui um ser vivo é o fato de possuir</p><p>material genético e ser capaz de transmiti-lo às células-filhas.</p><p>Compreender a estrutura do DNA, sua atuação e como é possível manipulá-lo, de-</p><p>pende do entendimento das ligações e das reações químicas dos compostos, integran-</p><p>do seus conhecimentos de Bioquímica, Química, Biologia Celular e Biologia Molecular.</p><p>Trocando Ideias</p><p>Se o DNA carrega a informação genética, essencial para definir as funções e as diferenças</p><p>entre uma célula e outra, podemos determinar, com total certeza que, quanto mais</p><p>complexo o organismo, maior será seu genoma (conjunto total de DNA contido em um</p><p>organismo), certo?</p><p>Não!!</p><p>Você consideraria uma cebola um ser mais complexo que você?</p><p>O tamanho do genoma haploide de um ser humano é de 3.000Mb e o de uma cebola,</p><p>por exemplo, é de 15.000Mb.</p><p>O que explica isso?</p><p>Fique atento, você compreenderá adiante, quando forem explicados os íntrons e os éxons.</p><p>Teste seu conhecimento:</p><p>• Qual é a diferença entre células eucariontes e procariontes?</p><p>• O que é o Experimento de Griffth?</p><p>• Qual é a função do DNA?</p><p>O Dogma Central da Biologia</p><p>Molecular e suas Exceções</p><p>As instruções requeridas para uma célula realizar suas funções estão contidas no</p><p>DNA, essa informação hereditária deve ser passada de uma célula às suas células-</p><p>-filhas durante a divisão celular (Figura 3).</p><p>10</p><p>11</p><p>Figura 3 – Divisão celular</p><p>Fonte: Getty Images</p><p>O DNA constitui-se por longas cadeias poliméricas, pareadas entre si e compostas</p><p>sempre pelos mesmos quatro monômeros – denominados nucleotídeos. Suas estrutu-</p><p>ras contêm bases orgânicas cíclicas. As duas fitas se ligam pelas bases e se enrolam, for-</p><p>mando uma estrutura de dupla-hélice (Figura 4) (descrita em 1953, por Watson e Crick).</p><p>Figura 4 – Estrutura do DNA de uma célula eucariótica</p><p>Fonte: Pixabay</p><p>A informação genética transportada pelo DNA reside na sua sequência, a ordem</p><p>linear de nucleotídeos ao longo de uma fita. Cada segmento específico de DNA</p><p>denominado gene, carrega a instrução para a produção de uma proteína específica.</p><p>11</p><p>UNIDADE Descobrindo o DNA e a Origem da Vida</p><p>Existem dois tipos de ácidos nucleicos – o ácido desoxirribonucleico (DNA) e o</p><p>ácido ribonucleico (RNA).</p><p>A diferença é que o ácido desoxirribonucleico tem um átomo de oxigênio a menos.</p><p>A informação genética contida no DNA é copiada (ou transcrita) em moléculas de</p><p>RNA, constituído também por nucleotídeos. Sua sequência pode ser traduzida e</p><p>determinar a disposição de cada aminoácido em uma cadeia que originará uma pro-</p><p>teína (Figura 5).</p><p>Essa série de acontecimentos, nessa ordem, é conhecida como “Dogma Central</p><p>da Biologia Molecular”.</p><p>Proteína</p><p>RNA</p><p>DNA</p><p>Replicação /DNA DNA/</p><p>Transcrição /DNA RNA/</p><p>Tradução /RNA Proteína/</p><p>Figura 5 – Dogma Central da Biologia Molecular</p><p>Fonte: Adaptado de Getty Images</p><p>O Dogma Central da Biologia Molecular, proposto por Francis Crick, na época, es-</p><p>tabelecia que o fluxo de informação genética era único (DNA → RNA → Proteína), de</p><p>maneira que uma molécula de DNA serve de molde para a formação de um RNA que,</p><p>por sua vez, serve de molde para a cadeia de aminoácidos, que forma uma proteína.</p><p>Entretanto, o aprofundamento desses conhecimentos revelou novas possibilidades</p><p>a serem incluídas no fluxo de informação genética:</p><p>• Não é todo RNA que é traduzido originando uma</p><p>proteína. Existem RNAs que</p><p>por si são funcionais e apresentam importantes atividades na célula;</p><p>• Existem vírus de RNA que possuem a capacidade de, a partir de sua molécula</p><p>de RNA, originar uma molécula de DNA, processo denominado transcrição</p><p>reversa (DNA ← RNA);</p><p>• Foram descobertos os príons – Basicamente, proteínas que se propagam em cé-</p><p>lulas hospedeiras, capazes de alterar a conformação proteica de outras proteínas.</p><p>Dessa forma, o fluxo gênico pode ser interpretado como Proteína ← Proteína.</p><p>12</p><p>13</p><p>Trocando Ideias</p><p>Vamos tornar mais claro com uma analogia?</p><p>Imagine que uma pessoa cuja língua nativa é o japonês tem uma importante informa-</p><p>ção a ser passada para um brasileiro que não sabe japonês. Assim, a informação fala-</p><p>da, servindo como “molde” (seria a sequência de DNA) é captada por um dispositivo</p><p>de voz que transcreve a informação para escrita em japonês (ou seja, a informação é</p><p>transcrita – Processo no qual a “linguagem” do DNA e RNA é a mesma – Nucleotídeos).</p><p>Lembrando-se de que a fala em japonês não é magicamente transformada na escrita,</p><p>mas serve como um “molde”, sendo reconhecida na sua ordem correta e gerada a infor-</p><p>mação escrita, que é traduzida e, por fim, capaz de ser interpretada (Tradução – RNA e</p><p>proteína possuem “linguagens” diferentes, assim, a informação em nucleotídeos precisa</p><p>ser traduzida para aminoácidos).</p><p>Teste seu conhecimento:</p><p>• Qual é a diferença entre DNA e RNA?</p><p>• Quais etapas fazem parte do Dogma Central da Biologia Molecular?</p><p>• O que são príons?</p><p>Compreendendo a Estrutura do DNA</p><p>Você já aprendeu que a molécula de DNA contém a informação genética dos</p><p>seres vivos e que é constituída por longas cadeias poliméricas, pareadas entre si e</p><p>compostas por nucleotídeos (Figura 6).</p><p>Os nucleotídeos são moléculas formadas por um grupo fosfato unido por uma</p><p>ligação fosfodiéster a um carboidrato (pentose), que pode ser uma ribose ou desoxir-</p><p>ribose, conectado a um anel que contém um nitrogênio (base nitrogenada).</p><p>Grupo fosfato</p><p>Ribose</p><p>Timina Adenina</p><p>Citosina Guanina</p><p>Figura 6 – Estrutura química do nucleotídeo</p><p>Fonte: Adaptado de Getty Images</p><p>13</p><p>UNIDADE Descobrindo o DNA e a Origem da Vida</p><p>As bases nitrogenadas são divididas em purinas – adenina e guanina, que pos-</p><p>suem um par de anéis fusionados, e pirimidinas – citosina, timina e uracila, que</p><p>possuem um anel único.</p><p>A adenina (A), a guanina (G) e a citosina (C) são encontradas no DNA (Figura 7A)</p><p>e no RNA (Figura 7B). A timina (T) é encontrada apenas no DNA, e a uracila (U),</p><p>apenas no RNA.</p><p>A B</p><p>Timina</p><p>Ligação de hidrogênio</p><p>Adenina</p><p>Adenina</p><p>Adenina</p><p>Citosina</p><p>Citosina</p><p>Citosina</p><p>Uracilo</p><p>Uracilo</p><p>Nucleotídeo</p><p>Nucleotídeo</p><p>Fosfato</p><p>Espinha dorsal do</p><p>fosfato de açúcar</p><p>Ribose</p><p>Guanina</p><p>Guanina</p><p>Guanina</p><p>Açucar</p><p>Purinas Pirimidinas</p><p>Purinas</p><p>Base</p><p>BASE</p><p>Pirimidinas</p><p>Fosfato</p><p>Figura 7 – Estrutura do DNA (A), estrutura do RNA (B)</p><p>Fonte: Adaptado de Getty Images</p><p>Com base em seus conhecimentos químicos, observe a molécula de DNA e de RNA e responda:</p><p>Por qual razão o DNA é o carreador da informação genética nas células e não o RNA? É im-</p><p>portante lembrar qual a diferença entre uma desoxirribose e uma ribose.</p><p>A razão encontra-se no hidrogênio, na posição 2’ da desoxirribose do DNA, vez que o grupo</p><p>hidroxila presente no RNA na posição 2’ da ribose o deixa suscetível a ataques nucleofílicos.</p><p>A ausência de hidroxila do DNA reduz sua suscetibilidade à hidrólise alcalina e favorece a</p><p>formação de dupla hélice, tornando-o uma molécula mais estável, característica essencial</p><p>para sua função de armazenamento da informação genética em longo prazo.</p><p>A ligação fosfodiéster é feita entre um grupo químico hidroxila (OH) ligado ao 3º</p><p>carbono da pentose de um nucleotídeo e o fosfato do nucleotídeo seguinte ligado ao</p><p>carbono 5 da pentose dele (Figura 8).</p><p>Na estrutura do DNA, a extremidade da molécula que contém a pentose com o</p><p>carbono 5 livre é denominada extremidade 5′, a que tem a pentose com o carbono</p><p>3 livre é denominada extremidade 3′.</p><p>Importante!</p><p>Note que é uma ligação fosfodiéster pois o ácido fosfórico foi unido a dois álcoois</p><p>(os grupos hidroxila das pentoses) por uma ligação do tipo éster em ambos os lados,</p><p>logo → diéster.</p><p>14</p><p>15</p><p>A B</p><p>Adenina</p><p>Extremidade</p><p>5’ fosfato Extremidade</p><p>5’ – fosfato</p><p>Ligação</p><p>glicosídica</p><p>Ligação</p><p>glicosídica</p><p>Extremidade</p><p>3’ – hidroxila</p><p>Extremidade</p><p>3’ – hidroxila</p><p>Ligação</p><p>fosfodiéster</p><p>Ligação</p><p>fosfodiéster</p><p>Citosina</p><p>Guanina</p><p>Timina</p><p>Figura 8 – Ligação fosfodiéster</p><p>Fonte: Adaptado de ZAHA et al., 2014, p. 21</p><p>Observe que o ácido fosfórico utiliza dois de seus três grupamentos ácidos nas</p><p>ligações 3′,5′ – diéster, e o grupamento restante confere ao ácido nucleico suas pro-</p><p>priedades ácidas</p><p>Importante!</p><p>O caráter ácido do DNA possibilitará a formação de ligações iônicas com proteínas básicas.</p><p>Além disso, torna os ácidos nucleicos basófilos (evidenciados por corantes básicos).</p><p>Os nucleotídeos também são descritos como monofosfato de nucleosídeo (NMP).</p><p>Por sua vez, a adição de um ou dois grupos fosfatos resulta em difosfatos de nucleo-</p><p>sídeo (NDP) e trifosfato de nucleosídeo (NTP) (Figura 9).</p><p>É necessário destacar a forma trifosfato que você verá adiante como a molécula</p><p>precursora durante a síntese do ácido nucleico no interior da célula.</p><p>Além do mais, sem dúvida, você conhece outras moléculas trifosfatadas essenciais</p><p>para a célula – o ATP (trifosfato de adenosina) e o GTP (trifosfato de guanosina),</p><p>fundamentais na bioenergética celular, em vista da enorme quantidade de energia</p><p>envolvida na adição ou remoção do grupo fosfato terminal.</p><p>15</p><p>UNIDADE Descobrindo o DNA e a Origem da Vida</p><p>Nucleosídeo monofosfato</p><p>Pirimidinas</p><p>Purinas</p><p>Deoxirribose</p><p>Pentose</p><p>Ligação glicosídica</p><p>Base</p><p>Ribose</p><p>Nucleosídeo difosfato</p><p>Nucleosídeo trifosfato</p><p>Nucleosídeo</p><p>Adenina Guanina</p><p>Citosina Uracila Timina</p><p>Figura 9 – Nucleotídeos</p><p>Fonte: Adaptado de Wikimedia Commons</p><p>As fitas de DNA são complementares (conhecida como Regra de Chargaff): sempre</p><p>que há um A, a fita correspondente apresenta um T. Por sua vez, o C pareia com G.</p><p>A complementaridade é tamanha que, mesmo sendo separadas, elas se juntam es-</p><p>pontaneamente sob condições adequadas de concentração salina e temperatura.</p><p>Dessa forma, a detecção de uma das fitas já permite descobrirmos a sequência da</p><p>correspondente, o que pode ser muito útil em diversos experimentos e técnicas de</p><p>Biologia Molecular.</p><p>A estrutura tridimensional do DNA, em dupla hélice, deve-se às características</p><p>químicas e estruturais das duas fitas, mantidas unidas por ligações de hidrogênio</p><p>(Figura 10).</p><p>Além disso, há ligações hidrofóbicas e de van der Waals entre os pares de bases</p><p>adjacentes, contribuindo para a estabilidade da estrutura de hélice.</p><p>As bases de cada nucleotídeo são voltadas para o interior da dupla hélice e a</p><p>pentose ligada ao fosfato posiciona-se na região externa.</p><p>Perceba que, em um DNA nativo, uma base de anel único (pirimidina) sempre se</p><p>liga a uma base de dois anéis (purina), de forma que A sempre está ligada com T, e</p><p>G com C. Essa é a disposição energeticamente mais favorável e, dessa forma, cada</p><p>base apresenta uma largura semelhante e a estrutura de pentose ligada ao fosfato</p><p>encontra-se equidistante na molécula de DNA.</p><p>Em vista dessa disposição e da complementaridade das bases, necessariamente,</p><p>para que seja possível esse encaixe, as duas fitas são antiparalelas (uma fita deve</p><p>estar em orientação oposta à da outra fita).</p><p>Observe na Figura que, enquanto numa fita observa-se a extremidade 5’, na sua</p><p>complementar está a extremidade 3’ (Figura 10).</p><p>16</p><p>17</p><p>Bases nitrogenadas</p><p>Ligações de hidrogênio</p><p>Esqueleto de</p><p>açúcar–fosfato</p><p>Esqueleto de</p><p>açúcar–fosfato</p><p>Bases</p><p>Par de bases</p><p>Açucar</p><p>Adenina</p><p>Adenina</p><p>Timina</p><p>Timina</p><p>Guanina</p><p>Guanina</p><p>Citosina</p><p>Citosina</p><p>Figura 10 – Fita dupla com extremidade 5’, na sua</p><p>complementar está a extremidade 3’ e ligações de hidrogênio</p><p>Fonte: Adaptado de Wikimedia Commons</p><p>Em teoria e nos DNAs sintéticos, outros pares de bases podem ser formados,</p><p>como, por exemplo, a</p><p>guanina (G) poderia teoricamente formar ligações de hidro-</p><p>gênio com a timina (T), resultando em uma pequena distorção na hélice e poderia</p><p>ocorrer, também, o pareamento entre citosina (C) e timina (T).</p><p>Os pares de bases não convencionais G-T e C-T, via de regra, não são encontrados</p><p>no DNA e, por sua vez, pares de bases G-U podem ser comuns em regiões de dupla-</p><p>-hélice que se formam com o RNA, originalmente de fita simples.</p><p>A enzima responsável pela cópia do DNA (discutida adiante) não permite que-</p><p>pares de bases não convencionais ocorram naturalmente na dupla fita de DNA.</p><p>O DNA das células encontra-se majoritariamente na forma B, uma dupla hélice</p><p>dextrógira (seu sentido de rotação é para a direita). A cada volta completa da hélice,</p><p>há cerca de 10 a 10,5 pares de bases por volta.</p><p>Apesar de a maioria do DNA cromossômico estar na forma B, sob certas condi-</p><p>ções, assume a forma A ou Z (Figura 11). Em condições laboratoriais, a retirada da</p><p>maior parte da água do DNA resulta na estrutura cristalográfica do DNA na forma</p><p>A, mais larga e mais curta do que a forma B.</p><p>É também uma dupla hélice dextrógira e para completar uma volta na hélice são ne-</p><p>cessários 11 pares de bases. O DNA, em solução com altas concentrações de cátions,</p><p>assume a conformação Z-DNA.</p><p>A forma Z-DNA é uma dupla hélice levógira, seu sentido de rotação é para a</p><p>esquerda, apresenta uma conformação mais alongada e mais fina do que o B-DNA e</p><p>para completar uma volta da hélice são necessários 12 pares de bases.</p><p>17</p><p>UNIDADE Descobrindo o DNA e a Origem da Vida</p><p>Figura 11 – Formas de DNA</p><p>Fonte: Adaptado de Wikimedia Commons</p><p>Estudos mais recentes demonstraram que o DNA em forma de tripla hélice pode</p><p>ocorrer espontaneamente no organismo, possivelmente relacionado à regulação</p><p>dos genes.</p><p>Constatamos, portanto, que estamos longe de atingir o completo entendimento</p><p>sobre a incrível molécula que é o DNA, o que deixa aberto um vasto campo de pes-</p><p>quisa e de novas descobertas surpreendentes.</p><p>Teste seu conhecimento:</p><p>• Como é constituído o DNA?</p><p>• O que são nucleotídeos?</p><p>• O que são as bases nitrogenadas? Quais os tipos?</p><p>• Como as bases nitrogenadas são pareadas?</p><p>• O que é uma ligação fosfodiéster?</p><p>• Quais os tipos de DNA existentes? Quantos pares de bases são necessários em cada</p><p>tipo para completar uma volta na hélice?</p><p>• O que significa dizer que a disposição e a complementaridade das bases são antiparalelas?</p><p>Organização do DNA, Estudo</p><p>dos Cromossomos e Genes</p><p>Para atingir o complexo empacotamento do DNA necessário a suas funções e</p><p>armazenamento na célula, existem proteínas especializadas que se ligam ao DNA e</p><p>o dobram. Por conseguinte, uma série de alças e espirais são formadas e permitem</p><p>níveis elevados de organização, impedindo que o DNA se emaranhe (Figura 12).</p><p>18</p><p>19</p><p>O DNA presente no núcleo encontra-se compactado e distribuído em múltiplas</p><p>estruturas lineares longas denominadas cromossomos. A compactação do DNA cro-</p><p>mossômico é realizada por uma família de proteínas nucleares denominadas histonas.</p><p>O complexo de histonas associadas ao DNA é chamado de cromatina.</p><p>Figura 12 – Diferentes níveis de condensação do DNA</p><p>Fonte: Wikimedia Commons</p><p>(1) Cadeia de DNA em dupla hélice – (2) Filamento de cromatina (DNA</p><p>com histonas) – (3) Cromatina condensada em interfase com centrômeros –</p><p>(4) Cromatina condensada em prófase (Existem agora duas cópias da molé-</p><p>cula de DNA) – (5) Cromossomo em metáfase.</p><p>Se fosse possível pegar todo o DNA que compõe uma célula humana e o reunir numa fita</p><p>ligada à extremidade da outra, isso resultaria em um comprimento total de aproximada-</p><p>mente 2 metros!</p><p>Pense bem: o DNA é armazenado no núcleo, que possui somente cerca de 6µm de diâmetro.</p><p>Como pode ser possível compactar o DNA de maneira precisa e que caiba em um espaço tão</p><p>pequeno? Lembre-se: é essencial que essas compridas fitas de DNA não sejam desordena-</p><p>damente emaranhadas umas nas outras, sobretudo na divisão celular, em que elas devem</p><p>ser separadas e divididas entre as células-filhas.</p><p>Em células procarióticas, quase todo o genoma está em uma única molécula de DNA circular</p><p>dobrada várias vezes sobre si mesma, situando-se na região central da célula.</p><p>Por outro lado, nas células eucarióticas, o DNA presente no núcleo encontra-se</p><p>compactado e distribuído em múltiplas estruturas lineares longas, denomina-</p><p>das cromossomos.</p><p>Apesar de a grande molécula de DNA genômica em procariotos estar associada a</p><p>proteínas e ser referida como cromossomo, a disposição dentro de um cromossomo</p><p>bacteriano difere bastante da observada em cromossomos de células eucarióticas</p><p>(Figura 13).</p><p>19</p><p>UNIDADE Descobrindo o DNA e a Origem da Vida</p><p>DNA humano</p><p>DNA bacteriano</p><p>Figura 13 – DNA de humano e DNA bacteriano</p><p>Fonte: Adaptado de Getty Images</p><p>Em eucariotos, cada cromossomo compreende uma única molécula de DNA asso-</p><p>ciada a numerosas proteínas. A compactação do DNA cromossômico é realizada por</p><p>uma família de proteínas nucleares denominadas histonas (Figura 14). O complexo</p><p>de histonas associadas ao DNA é chamado de cromatina.</p><p>As histonas são proteínas de caráter básico que interagem com os grupos fosfato</p><p>de carga negativa do DNA e seus principais tipos são: Hl, H2A, H2B, H3 e H4.</p><p>As histonas agrupam-se em um octâmero, formando um centro proteico, no qual o</p><p>DNA enrola-se como em um carretel. Essa estrutura formada consiste no nucleossomo.</p><p>O DNA que compõe os nucleossomos é muito menos suscetível à digestão por</p><p>enzimas nucleases, possibilitando sua proteção, organização e elevada compactação.</p><p>Figura 14 – Compactação do DNA cromossômico</p><p>Fonte: Adaptado de Wikimedia Commons</p><p>20</p><p>21</p><p>O comprimento e o número de cromossomos são os mesmos em todas as células</p><p>de um organismo eucarioto, mas variam entre as diferentes espécies.</p><p>Os cromossomos (em metáfase) coram-se intensamente com corantes básicos e</p><p>são visíveis em microscópios óptico e eletrônico, mas apenas durante a divisão celular.</p><p>Cada cromossomo é uma unidade estrutural distinta, e uma cópia de cada um</p><p>deve ser transmitida à célula-filha durante a divisão celular.</p><p>Durante a interfase, ocorre a duplicação dos cromossomos. Na mitose, eles ficam</p><p>altamente condensados (possibilitando sua visualização em microscópio), o que é im-</p><p>portante para a correta separação dos cromossomos duplicados pelo fuso mitótico.</p><p>Você quer saber como a divisão celular é observada no microscópio? Acesse o Atlas Digital ,</p><p>disponível em: https://bit.ly/32fxK46</p><p>Os cromossomos carregam os genes, designados como um segmento de DNA</p><p>com as “instruções” para produzir uma proteína.</p><p>No entanto, devemos considerar que certos genes apresentam como produto final</p><p>uma molécula de RNA funcional ao invés de uma proteína.</p><p>A complexidade de um organismo deve estar relacionada ao número de genes em</p><p>seu genoma. Uma bactéria simples, em geral, apresenta cerca de 500 genes e, você,</p><p>como ser humano, apresenta cerca de 25 mil genes.</p><p>No entanto, o tamanho dos genomas é muito variável e não reflete a sua complexidade.</p><p>O genoma humano é 200 vezes menor que de uma espécie de ameba. Lembra-</p><p>-se de que ficou curioso se uma cebola seria um ser vivo mais complexo que você?</p><p>Essa discrepância acontece porque nem todo o DNA presente em um cromossomo</p><p>será codificado e originará uma proteína.</p><p>Existem regiões de DNA – íntrons – que são DNAs não codificantes. Essas re-</p><p>giões não formam um RNA mensageiro (mRNA). As regiões de DNA codificantes</p><p>são denominadas éxons e sua sequência de nucleotídeos corresponderá à sequência</p><p>do mRNA.</p><p>Posteriormente, você aprenderá que tanto os éxons quanto os íntrons são trans-</p><p>critos para produzir um longo transcrito de RNA primário (Figura 15).</p><p>Contudo, os íntrons são removidos por splicing para formar um mRNA maduro.</p><p>Durante muito tempo, os íntrons eram classificados como “DNA lixo”, vez que era</p><p>desconhecida qualquer função para essas regiões de DNA. Atualmente, sabemos</p><p>que são indispensáveis para a correta expressão gênica de muitos genes, tal como</p><p>você poderá ver em outras Unidades.</p><p>21</p><p>UNIDADE Descobrindo o DNA e a Origem da Vida</p><p>Além disso, o fato de a variação no número de genes não explicar a variação no</p><p>tamanho dos genomas entre os eucariotos, em grande parte, é devido à variação na</p><p>quantidade de DNA repetitivo.</p><p>Em procariotos, diz-se que há colinearidade da informação genética, isto é, a</p><p>sequência nucleotídica do DNA equivale à sequência de aminoácidos na proteína,</p><p>portanto íntrons são praticamente inexistentes.</p><p>Figura 15 – Regiões de DNA codificantes</p><p>Fonte: ZAHA et al., 2014, p. 87</p><p>Teste seu conhecimento:</p><p>• Em que local da célula o DNA se encontra? Qual formato fica armazenado nesse local?</p><p>• O que é cromatina?</p><p>• O que é histona?</p><p>• Como o DNA é compactado?</p><p>• Qual é a diferença entre o DNA humano e o DNA bacteriano?</p><p>• O que são íntrons e éxons?</p><p>Replicação do DNA</p><p>Em algum momento, você já se perguntou: “Qual o sentido da vida?”. Devemos</p><p>nos lembrar de que, para a existência de vida, a unidade mínima é a célula. Sabemos,</p><p>também, que, na célula, é fundamental a presença de material genético e sua trans-</p><p>missão para células-filhas, sendo isso o que caracteriza a “vida”.</p><p>22</p><p>23</p><p>Na estrutura do DNA, ao ser sintetizada, são adicionados nucleotídeos por liga-</p><p>ções fosfodiéster sempre seguindo o sentido 5’ para o sentido 3’ e, por esse motivo,</p><p>diz-se que: “O sentido da vida é 5’ → 3’.”</p><p>É do nosso conhecimento que, durante a divisão celular, cada célula-filha deve</p><p>herdar o material genético contido em sua célula progenitora. Para que isso ocorra,</p><p>cada molécula de DNA deve gerar uma outra idêntica à original.</p><p>Pensando que no DNA constam todas as “instruções” para as funções celulares,</p><p>o que aconteceria se a cada vez que ele fosse duplicado houvesse algumas alterações</p><p>nessas sequências?</p><p>Em longo prazo, pequenas alterações genéticas aleatórias constituem um fator que</p><p>aumenta a sobrevivência de uma espécie e confere variabilidade genética. No entan-</p><p>to, a alta estabilidade genética é fundamental para a sobrevivência de um organismo.</p><p>O processo em que o DNA é duplicado denomina-se replicação, no qual costuma</p><p>ser muito raro que ocorra qualquer alteração na sequência de nucleotídeos. Quando</p><p>ocorre uma alteração, denominada mutação, pode ocorrer alteração de funções</p><p>celulares, levando a doenças ou até mesmo à destruição do organismo.</p><p>A duplicação do DNA atinge uma velocidade de até mil nucleotídeos por segundo! Ainda</p><p>assim, a maquinaria de replicação é tão elaborada e coordenada que o faz com alta precisão</p><p>e estabilidade genética.</p><p>Primeiramente, para que ocorra a duplicação da dupla hélice de DNA, suas fitas</p><p>precisam ser separadas e, assim, são utilizadas como fitas moldes para a construção</p><p>de cadeias complementares.</p><p>A dupla-hélice de DNA é muito estável sob condições fisiológicas normais. Conse-</p><p>quentemente, para que haja a abertura das fitas, é necessária a participação de duas</p><p>proteínas – as DNA–helicases e as proteínas ligadoras de DNA de fita simples</p><p>(SSB, single strand DNA-binding).</p><p>As helicases usam energia da hidrólise do ATP para separar as fitas parentais</p><p>(moldes) de DNA (Figura 16).</p><p>As SS B não realizam a abertura da dupla-fita, contudo, são importantes estabilizando</p><p>a conformação de fita simples, o que evita a formação de pequenos grampos de DNA.</p><p>Essas ligações em forma de grampos podem prontamente ocorrer em fitas sim-</p><p>ples com a complementaridade de bases e acarreta no impedimento da síntese de</p><p>DNA catalisada pela DNA polimerase.</p><p>23</p><p>UNIDADE Descobrindo o DNA e a Origem da Vida</p><p>DNA Original</p><p>Topoisomerase</p><p>Nucleotídeos livres</p><p>Helicase</p><p>DNA polimerase</p><p>Adenina Timina Citosina Guanina</p><p>Figura 16 – Replicação do DNA</p><p>Fonte: Adaptado de Getty Images</p><p>As fitas moldes, uma vez separadas, não voltam a se unir. Isso se dá, pois, as</p><p>cadeias recém-sintetizadas permanecem ligadas às suas respectivas fitas de DNA</p><p>molde, formando duas novas duplas-hélices de DNA idênticas à anterior.</p><p>As novas duplas-hélices portarão uma fita preexistente e uma fita recém-sintetizada.</p><p>Esse mecanismo de replicação é determinado como semiconservativo.</p><p>As posições nas quais a hélice inicialmente é aberta são chamadas de origens</p><p>de replicação.</p><p>Para que ocorra a síntese da nova fita (cadeia polinucleotídica), as enzimas DNA</p><p>polimerases (Figura 17) catalisam as ligações fosfodiésteres da desoxirribose de um</p><p>nucleotídeo com o fosfato do nucleotídeo livre a ser adicionado.</p><p>Diz-se que são polimerases com atividade exonucleolítica revisora, o que implica</p><p>que possuem a incrível e importante capacidade de, imediatamente após a adição de</p><p>nucleotídeos, rever se o pareamento da base adicionada com a base da fita molde foi</p><p>correto. Caso contrário, o nucleotídeo é retirado e adicionado o correto.</p><p>Os nucleotídeos livres que servem como substrato à enzima DNA polimerase são</p><p>desoxirribonucleosídeos 5’ trifosfatos. Todavia, para a polimerização, essa enzima</p><p>necessita que haja uma pequena fita simples preexistente de RNA ou DNA iniciador</p><p>com uma extremidade 3’-OH livre (também chamado de primer).</p><p>Para resolver esse problema, uma enzima especializada do tipo RNA-polimerase</p><p>nomeada DNA-primase forma um pequeno fragmento de RNA como iniciador, com</p><p>cerca de 10 nucleotídeos, complementar às fitas-molde (já separadas pela helicase).</p><p>Ao contrário da DNA polimerase, a primase pode iniciar uma nova cadeia de</p><p>polinucleotídeos pela ligação de dois trifosfatos de nucleosídeo (Figura 17).</p><p>24</p><p>25</p><p>DNA polimerase</p><p>Fragmento</p><p>de Okazaki Iniciador</p><p>de RNA</p><p>DNA original</p><p>Helicase</p><p>Primase</p><p>Topoisomerase</p><p>Fita molde</p><p>Fita descontínua</p><p>Fita contínua</p><p>Figura 17 – Enzimas presentes na replicação do DNA</p><p>Fonte: Adaptado de Getty Images</p><p>Vimos que a estrutura do RNA é muito semelhante à do DNA. Assim, ribonucleotídeos</p><p>podem parear suas bases com as de uma fita de DNA se as duas sequências forem</p><p>complementares, produzindo uma dupla-hélice híbrida DNA/RNA.</p><p>O iniciador de RNA, que apresenta um grupo 3’-OH livre, pode ser estendido</p><p>pela DNA-polimerase a partir dessa extremidade.</p><p>A síntese de DNA sempre ocorrerá na direção 5’ → 3’, já que o crescimento da</p><p>cadeia se deve à formação da ligação fosfodiéster entre o oxigênio 3’ de uma fita</p><p>crescente e o fosfato de um dNTP. Além do mais, já sabermos que não existe DNA-</p><p>-polimerase capaz de adicionar desoxirribonucleosídeos trifosfatos na direção 3’ → 5’.</p><p>Com um iniciador pareado à fita-molde, a DNA-polimerase segue catalisando as</p><p>ligações ao grupo hidroxila livre na extremidade 3’ do iniciador conforme especifica-</p><p>do pela sequência da fita-molde.</p><p>A energia necessária para a replicação do DNA é obtida dos próprios desoxirribo-</p><p>nucleosídios trifosfato, que liberam dois fosfatos (pirofosfato) quando se ligam entre</p><p>si. A síntese do DNA ocorre pela ação da DNA polimerase e pelo fornecimento</p><p>de desoxirribonucleotídios.</p><p>Estes estão localizados no núcleo como desoxirribonucleosídios trifosfato (dATP,</p><p>dTTP, dCTP, dGTP) e são adicionados sequencialmente na extremidade 3’ da cadeia</p><p>em crescimento, seguindo a ordem marcada pelos nucleotídeos da cadeia de DNA</p><p>que serve de molde.</p><p>Se a duplicação do DNA começasse em uma das extremidades do cromossomo, seguindo</p><p>continuamente até alcançar a outra extremidade, todo o processo demoraria aproximada-</p><p>mente 30 dias! No entanto, sabemos que o tempo que o DNA leva para se duplicar (fase S</p><p>do ciclo celular) dura cerca de 7 h. Isso é possível porque, na realidade, a replicação do DNA</p><p>acontece com múltiplas origens de replicação, uma quantidade estimada entre 20 e 80 para</p><p>cada alça da cromatina.</p><p>Ao decorrer da replicação, é natural a formação de supertorções de DNA emara-</p><p>nhados. Estas, por sua vez, são desfeitas por proteínas DNA topoisomerase.</p><p>25</p><p>UNIDADE Descobrindo o DNA e a Origem da Vida</p><p>Um tipo, a topoisomerase I, realiza uma temporária clivagem na fita simples, vez</p><p>que faz uma ligação covalente a um fosfato quebrando a ligação fosfodiéster.</p><p>Como a ligação covalente que une a proteína topoisomerase I ao fosfato do DNA</p><p>conserva a energia da ligação fosfodiéster,</p><p>a religação é rápida e não requer forneci-</p><p>mento adicional de energia.</p><p>Um segundo tipo, a topoisomerase II, forma uma ligação covalente com ambas</p><p>as fitas da hélice de DNA ao mesmo tempo, formando uma quebra de fita dupla</p><p>temporária na hélice.</p><p>Quando em uma origem de replicação a dupla-hélice do DNA se abre, forma-se a</p><p>chamada bolha de replicação, cujo tamanho, em ambas as extremidades, aumenta</p><p>à medida que se avança na separação das cadeias. Em cada extremidade é formada</p><p>uma estrutura em formato de Y denominada forquilha de replicação.</p><p>À medida em que a replicação procede, a forquilha de replicação e as proteínas</p><p>associadas distanciam-se da origem de replicação.</p><p>A replicação do DNA ocorre por um mecanismo dito bidirecional, não apenas</p><p>porque as duas cadeias são sintetizadas em direções opostas, mas também porque</p><p>duas forquilhas se formam em uma origem de replicação e se movem em direções</p><p>opostas, sendo ambas as fitas-molde copiadas em cada forquilha.</p><p>É importante estabelecer que cada molécula de DNA cromossomal eucariótica</p><p>possui múltiplas origens de replicação.</p><p>As duas forquilhas que nascem em cada origem avançam em sentidos opostos e</p><p>desaparecem quando colidem com seus semelhantes nas bolhas contíguas.</p><p>Em vista da orientação antiparalela das duas fitas da dupla hélice de DNA, em cada</p><p>forquilha, a sequência de uma das fitas caminha na direção 5’ → 3’ e da outra fita na</p><p>direção 3’ → 5’. Portanto, a primeira, ao ser copiada, teria de gerar uma fita-filha na</p><p>direção 3’ → 5’, o que já sabemos que nenhuma DNA polimerase é capaz de fazer.</p><p>Como, então, pode ser feita a cópia das duas fitas?</p><p>A solução da célula é utilizar diferentes estratégias para a síntese de cada uma.</p><p>Na síntese da fita-filha que cresce na direção 5’ → 3’ (também chamada de fita</p><p>contínua ou líder), cujo molde é a fita progenitora 3’ → 5’, não há grandes com-</p><p>plicações e é necessário apenas um iniciador (sintetizado pela primase) para que</p><p>ocorra a replicação.</p><p>Na fita líder, a DNA polimerase é mantida até o término da sua síntese, ocorrendo</p><p>o acréscimo contínuo de nucleotídeos em sua extremidade 3’ à medida que a forqui-</p><p>lha se desloca.</p><p>No caso da outra fita-filha, que teria sua síntese teoricamente crescendo em sen-</p><p>tido 3’ → 5’ (também chamada fita descontínua ou atrasada), há a formação</p><p>de uma série de segmentos transitórios com cerca de 100 a 200 nucleotídeos de</p><p>26</p><p>27</p><p>comprimento (em eucariotos), comumente conhecidos como fragmentos de Okazaki.</p><p>Observou-se que esses fragmentos descontínuos são sintetizados apenas nesta fita.</p><p>Cada vez que a DNA polimerase completa um pequeno fragmento de Okazaki,</p><p>ela deve novamente iniciar a síntese de um novo fragmento em um sítio mais adiante</p><p>na fita molde.</p><p>Um mecanismo especial produz uma fita iniciadora complementar à DNA poli-</p><p>merase, a partir da DNA primase para sintetizar pequenos iniciadores de RNA. Em</p><p>eucariotos, esses iniciadores possuem cerca de 10 nucleotídeos e são produzidos em</p><p>intervalos de 100 a 200 nucleotídeos na fita descontínua.</p><p>Além de bidirecional, diz-se que a replicação do DNA é assimétrica, já que uma</p><p>mesma cadeia se replica de modo contínuo de um lado da bolha e de maneira des-</p><p>contínua do outro lado.</p><p>As enzimas DNA-polimerases são de dissociação rápida, isto é, possuem a ten-</p><p>dência de sintetizar pequenos fragmentos de DNA e já desfazerem sua ligação. Isso</p><p>confere uma vantagem no caso da síntese da fita descontínua, permitindo que a</p><p>DNA polimerase que recém terminou a síntese de um fragmento de Okasaki seja</p><p>reciclada e rapidamente já inicie a síntese de um próximo fragmento de Okasaki na</p><p>mesma fita.</p><p>Diante disso, como pode ser possível a síntese de longas fitas contínuas?</p><p>Existe uma proteína acessória denominada cinta reguladora, a qual encaixa-se</p><p>de forma a manter a DNA-polimerase firmemente associada ao DNA enquanto está</p><p>sintetizando a nova fita, porém, caso a polimerase encontre uma região de DNA de</p><p>fita dupla, ela é rapidamente libertada e se associa a uma nova cinta montada sobre</p><p>o iniciador de RNA para a síntese do próximo fragmento de Okazaki.</p><p>E agora, você deve estar se perguntando: como é possível que a cinta evite a</p><p>dissociação da polimerase e isso não impeça o rápido deslocamento e a síntese da</p><p>fita de DNA?</p><p>Ela liga-se ao redor da hélice de DNA como se fosse um anel, de maneira que</p><p>apenas uma pequena parte se liga na DNA-polimerase, e toda a cinta pode deslizar</p><p>ao longo da molécula de DNA conjuntamente ao deslocamento da DNA-polimerase</p><p>(Figura 18).</p><p>A ilustração a seguir mostra a diferença entre uma DNA-polimerase processiva</p><p>e uma nã o processiva.</p><p>Ambas as DNA-polimerases se ligam à junção iniciador: molde. Após a ligação,</p><p>a enzima não processiva adiciona um único dNTP à extremidade 3’ do iniciador e é</p><p>liberada da junção iniciador: molde.</p><p>Em contrapartida, uma DNA-polimerase processiva adiciona vários dNTPs cada</p><p>vez que se liga ao molde.</p><p>27</p><p>UNIDADE Descobrindo o DNA e a Origem da Vida</p><p>Figura 18 – As DNA-polimerases sintetizam o DNA de maneira processiva</p><p>Fonte: WATSON et al., 2015, p. 267</p><p>Para que a cadeia da fita descontínua possa ser uma fita completa de DNA, um</p><p>Sistema de Reparo atua rapidamente para a retirada do iniciador. Dessa forma, os</p><p>ribonucleotídeos na extremidade 5’ de cada fragmento de Okazaki são removidos e</p><p>substituídos por desoxirribonucleotídeos.</p><p>Uma enzima chamada DNA-ligase faz a ligação dos fragmentos de Okasaki,</p><p>completando o processo. A DNA-ligase religa a ligação fosfodiéster utilizando uma</p><p>molécula de ATP para ativar a extremidade 5’ antes da formação da nova ligação.</p><p>Embora didaticamente expliquemos a replicação etapa a etapa, com uma série</p><p>de proteínas, como se atuassem de forma independente, é necessário imaginar que</p><p>tudo isso está ocorrendo praticamente junto (Figura 19).</p><p>Figura 19 – Replicação do DNA</p><p>Fonte: Adaptado de Pixabay</p><p>28</p><p>29</p><p>Para visualizar melhor e compreender estas etapas acesse o vídeo “DNA replication – 3D”.</p><p>Disponível em: https://youtu.be/TNKWgcFPHqw</p><p>Apesar da alta eficiência das DNA-polimerases, elas, eventualmente, cometem</p><p>erros. Contudo, existe outro processo que possibilita corrigi-los, chamado de reparo</p><p>de pareamento incorreto. Você vai ver isso mais adiante.</p><p>Após termos compreendido o princípio básico da replicação do DNA, que se aplica</p><p>tanto a procariotos quanto a eucariotos, agora vamos estudar, de maneira mais</p><p>detalhada, como ela é executada e regulada, evidenciando o que difere entre esses</p><p>dois grupos.</p><p>Primeiramente, iremos considerar o caso das bactérias, mais simples e melhor</p><p>compreendido e, por fim, discutiremos processos mais complexos observados em le-</p><p>veduras (principal organismo eucarioto utilizado em estudos) e em outros eucariotos.</p><p>Teste seu conhecimento:</p><p>• Qual é a função da enzima DNA-Helicase?</p><p>• Qual é a função da enzima DNA-Polimerase?</p><p>• O que são fragmentos de Okazaki?</p><p>• Qual é a função da enzima DNA-Ligase?</p><p>• Qual é a função da DNA-primase?</p><p>• Qual é a função da Topoisomerase?</p><p>• Em qual direção a síntese de DNA sempre ocorre?</p><p>Replicação do DNA em Procariontes</p><p>Em células mais simples, como de bactérias, as origens de replicação são de-</p><p>terminadas por sequências de DNA fita dupla formadas por centenas de pares de</p><p>nucleotídeos, segmentos que atraem proteínas iniciadoras e são especialmente fáceis</p><p>de separar.</p><p>Vimos que o par de base A-T é unido por duas ligações de hidrogênio, enquanto</p><p>o par G-C é unido por três ligações de hidrogênio. Isso implica que segmentos de</p><p>DNA ricos em pares de bases A-T são relativamente mais fáceis de serem separados</p><p>e estão normalmente presentes nas origens de replicação.</p><p>No caso dos procariotos, usaremos como referência a bactéria Escherichia coli.</p><p>Em bacté rias, uma vez que a proteína iniciadora está corretamente ligada à única</p><p>origem de replicação, as forquilhas de replicação seguem de modo quase automático,</p><p>em direções opostas, distanciando-se da origem até que todo o DNA contido em um</p><p>único cromossomo circular seja replicado</p><p>(Figura 20).</p><p>29</p><p>UNIDADE Descobrindo o DNA e a Origem da Vida</p><p>Figura 20 – Replicação do cromossomo de E. coli, com uma única</p><p>origem de replicação; portanto, com um único replicon</p><p>Fonte: Adaptado de edisciplinas.usp.br</p><p>O genoma bacteriano é relativamente pequeno, levando cerca de 30 minutos</p><p>para ser totalmente duplicado (Figura 21).</p><p>Figura 21 – Genoma bacteriano</p><p>Fonte: Adaptdo de ufjf.br</p><p>Uma característica interessante de procariotos é sua organização de genes em</p><p>operons, de forma que genes que codificam produtos com funções relacionadas são</p><p>agrupados, tais como componentes de uma mesma rota metabólica.</p><p>30</p><p>31</p><p>Enfim, o único ponto de controle da replicação do DNA é o seu início. Dessa</p><p>forma, o início da replicação deve ser um processo altamente controlado.</p><p>O processo inicia quando múltiplas cópias de proteínas iniciadoras se ligam a sí-</p><p>tios específicos no DNA localizados nas origens de replicação, enrolando o DNA em</p><p>volta das proteínas, formando um grande complexo proteína-DNA que desestabiliza</p><p>a dupla-hélice adjacente.</p><p>A seguir, esse complexo atrai duas DNA-helicases, cada uma ligada a um carrega-</p><p>dor de helicase, e elas são colocadas em torno de fitas simples de DNA adjacentes,</p><p>cujas bases foram expostas pela montagem do complexo de iniciação proteína-DNA.</p><p>O carregador da helicase é análogo ao montador da cinta visto anteriormente,</p><p>mas possui a tarefa adicional de manter a helicase na forma inativa até que ela esteja</p><p>corretamente colocada na forquilha de replicação nascente. Uma vez colocadas na</p><p>posição, os carregadores se dissociam e as helicases começam a desenrolar o DNA,</p><p>expondo DNA de fita simples suficiente para a DNA-primase sintetizar os primeiros</p><p>iniciadores de RNA.</p><p>Isso rapidamente determina o arranjo das demais proteínas para formar duas</p><p>forquilhas de replicação, com maquinarias que se deslocam em direções opostas em</p><p>relação à origem de replicação. Elas continuam a sintetizar DNA, até que toda a fita</p><p>de DNA-molde à frente de cada forquilha tenha sido replicada.</p><p>Na E. coli, a interação da proteína iniciadora com a origem de replicação é cuidado-</p><p>samente regulada, e o início ocorre apenas quando há nutrientes suficientes disponí-</p><p>veis para a bactéria completar todo o processo de replicação.</p><p>A iniciação também é controlada de maneira a garantir que ocorra somente um</p><p>ciclo de replicação do DNA a cada divisão celular. Após o início da replicação, a</p><p>proteína iniciadora é inativada pela hidrólise da molécula de ATP ligada, e a origem</p><p>de replicação passa por um “período refratário”.</p><p>O período refratário é causado por um atraso na metilação de nucleotídeos “A”</p><p>recém-incorporados na origem. A iniciação não pode ocorrer novamente até que os</p><p>As estejam metilados e a proteína iniciadora restaurada ao estado com ATP-ligado.</p><p>Replicação do DNA em Eucariotos</p><p>A proteína SSB de eucariotos possui três subunidades, enquanto a procariótica</p><p>possui apenas uma. Além disso, a DNA-primase eucariótica está incorporada em</p><p>uma enzima com múltiplas subunidades que também contém a DNA-polimerase,</p><p>chamada de DNA-polimerase α-primase.</p><p>Esse complexo proteico inicia cada fragmento de Okasaki na fita descontínua</p><p>com o RNA e, então, estende o iniciador de RNA com um pequeno segmento de</p><p>DNA. Nesse ponto, as duas principais polimerases eucarióticas de replicação, δ e ε,</p><p>atuam completando cada fragmento de Okasaki ao mesmo tempo em que estendem</p><p>a fita contínua.</p><p>31</p><p>UNIDADE Descobrindo o DNA e a Origem da Vida</p><p>Devemos considerar que, no caso dos eucariotos, há um fator complicador, já que</p><p>a maquinaria deve passar pelos nucleossomos, dispostos em intervalos de cerca de</p><p>200 pares de nucleotídeos ao longo de todo DNA. Isso pode explicar porque cada</p><p>novo fragmento de Okasaki na fita descontínua é sintetizado em intervalos de 100</p><p>a 200 nucleotídeos nos eucariotos, em vez de 1000 a 2000 nucleotídeos observa-</p><p>dos nas bactérias.</p><p>Como os cromossomos eucarióticos são muito maiores que os dos procariotos,</p><p>necessitam de uma estratégia diferente que possibilite sua replicação em tempo hábil.</p><p>Como esperado, diversas forquilhas, em bolhas de replicação diferentes, deslo-</p><p>cam-se de forma simultânea em cada cromossomo eucariótico. Portanto, há várias</p><p>forquilhas operando de forma independente em cada cromossomo, resultando em</p><p>duas hélices de DNA filhas completas.</p><p>Sabemos que as várias origens de replicação não são todas ativadas simultanea-</p><p>mente. Foi descoberto ativarem-se em blocos com cerca de 50 origens adjacentes, e</p><p>cada uma é replicada apenas em um restrito período da fase S.</p><p>Basicamente, determinou-se que uma origem contém: um sítio de ligação para a</p><p>proteína de iniciação com múltiplas subunidades chamada ORC (complexo de reco-</p><p>nhecimento da origem. Do inglês: origin recognition complex), uma região de DNA</p><p>rica em A-T, que vimos ser mais fácil de desnaturar, e ao menos um sítio de ligação</p><p>para proteínas que facilitem a ligação do ORC (Figura 22).</p><p>Figura 22 – Início da replicação em organismos eucarióticos</p><p>Fonte: ZAHA et al., 2014, p. 123</p><p>32</p><p>33</p><p>Com tantos locais para iniciar a replicação, como o processo é controlado para</p><p>assegurar que todo o DNA seja copiado uma única vez?</p><p>A explicação é a sequencialidade das etapas durante o ciclo celular. Durante a</p><p>fase G1, as helicases replicativas são ligadas no DNA próximas ao ORC, criando um</p><p>complexo pré-replicativo.</p><p>Na passagem da fase G1 para fase S, as helicases são ativadas. A conseguinte aber-</p><p>tura da dupla-hélice permite a montagem das demais proteínas replicativas, incluindo</p><p>as DNA-polimerases. Há proteínas que impedem a formação de novos complexos</p><p>pré-replicativos até a próxima fase M, quando todo o ciclo é reiniciado. Em geral,</p><p>essas proteínas realizam a fosforilação do ORC, produzindo um complexo incapaz</p><p>de interagir com novas helicases.</p><p>Cada origem de replicação é ativada apenas uma vez durante cada ciclo celular.</p><p>No entanto, há muitos detalhes que ainda não são compreendidos, principalmente</p><p>em eucariotos.</p><p>Teste seu conhecimento:</p><p>• Como são organizados os genes dos procariotos?</p><p>• Qual é a diferença da replicação do DNA de um procarionte de um eucarionte?</p><p>• O que é o sítio de ligação ORC?</p><p>Sistema de Reparo de DNA</p><p>A manutenção da estabilidade genética de um organismo necessária à sobrevivência</p><p>requer não apenas um mecanismo extremamente preciso para replicar o DNA, mas</p><p>também mecanismos para corrigir as diversas lesões acidentais que ocorrem conti-</p><p>nuamente no DNA.</p><p>Grande parte das alterações espontâneas é temporária, pois são imediatamente</p><p>corrigidas por um conjunto de processos chamados coletivamente de reparo do DNA.</p><p>Das dezenas de milhares de alterações aleatórias geradas a cada dia no DNA de</p><p>uma célula humana por calor, acidentes metabólicos, radiações de vários tipos e</p><p>exposição a substâncias ambientais, apenas algumas alterações (menos de 0,02%)</p><p>acumulam-se como mutações permanentes na sequência de DNA.</p><p>O restante é eliminado com uma eficiência impressionante pelo reparo de DNA.</p><p>Quem nunca foi à praia no verão pegar aquele bronze que atire a primeira pedra! Nossa</p><p>sorte é que as células possuem um mecanismo para consertar as lesões do DNA provocadas</p><p>pela luz UV do Sol, que causa câncer. O professor Carlos Menck explica como isso funciona.</p><p>Disponível em: https://youtu.be/Z6X4opmzhdI</p><p>33</p><p>UNIDADE Descobrindo o DNA e a Origem da Vida</p><p>Sem o reparo do DNA, as lesões espontâneas rapidamente modificariam as sequ-</p><p>ências de DNA. A estrutura de dupla-hélice do DNA é perfeitamente adequada para</p><p>o reparo, pois possui duas cópias separadas de toda a informação genética – uma</p><p>em cada fita.</p><p>Portanto, quando uma das fitas é danificada, a fita complementar possui uma</p><p>cópia intacta da mesma informação, sendo normalmente usada para restaurar a</p><p>sequência nucleotídica correta na fita danificada.</p><p>Uma indicação da importância da dupla hélice é que todas as células a utilizam.</p><p>Apenas uns poucos vírus utilizam uma fita simples de DNA ou de RNA como ma-</p><p>terial genético.</p><p>Uma mutação potencial pode ser introduzida pela incorporação errônea de uma G</p><p>base em um primeiro ciclo de replicação. No segundo ciclo de replicação, a mutação</p><p>torna-se permanentemente incorporada à sequência de DNA (WATSON et al., 2015).</p><p>Figura 23 – A replicação pode transformar uma base</p><p>mal-incorporada em uma mutação permanente</p><p>Fonte: WATSON et al. , 2015, p. 315</p><p>Há duas principais vias de reparo. Em ambas, a lesão é removida, a sequência</p><p>de DNA é restaurada por uma DNA-polimerase utilizando a fita não danificada como</p><p>molde, e a quebra resultante na dupla-hélice é ligada pela DNA-ligase.</p><p>As duas vias, no entanto, removem as lesões de diferentes formas. A primeira, deno-</p><p>minada reparo por excisão de bases, utiliza enzimas DNA-glicosilases, capazes de</p><p>reconhecer cada qual um tipo específico de base alterada no DNA e de catalisar a</p><p>remoção hidrolítica.</p><p>O principal fator de reconhecimento de qual base está errada é a projeção do</p><p>nucleotídeo alterado para fora da hélice. Uma vez reconhecida a lesão, a enzima</p><p>remove a base do açúcar e a lacuna originada é reconhecida pela endonuclease AP</p><p>(AP para apúrica ou apirimídica, e endo refere-se à nuclease que cliva dentro da</p><p>cadeia polinucleotídica) que cliva a cadeia fosfodiéster. A depurinação, tipo de lesão</p><p>34</p><p>35</p><p>mais frequente sofrida pelo DNA, também é diretamente corrigida começando pela</p><p>endonuclease AP.</p><p>A segunda principal via de reparo é chamada de reparo por excisão de nucleo-</p><p>tídeos. Esse mecanismo pode corrigir uma lesão causada por praticamente qualquer</p><p>alteração volumosa na estrutura da dupla-hélice de DNA.</p><p>Uma vez encontrada uma lesão, a cadeia fosfodiéster da fita anormal é clivada nos</p><p>dois lados da distorção, e a DNA-helicase remove o oligonucleotídeo de fita simples</p><p>contendo a lesão.</p><p>O intervalo produzido na hélice de DNA é corrigido pela DNA-polimerase e pela</p><p>DNA-ligase. Uma situação especial ocorre no DNA de vertebrados, em que determi-</p><p>nados nucleotídeos C são metilados em sequências CG específicas e é associado a</p><p>genes inativos.</p><p>Se o DNA celular estiver extremamente danificado, esses principais mecanismos de</p><p>reparo, em geral, não serão suficientes para corrigi-lo. As DNA-polimerases altamente</p><p>precisas param quando encontram um DNA danificado e, no caso de emergências,</p><p>as células usam polimerases de reserva. Utilizam-se as polimerases menos precisas,</p><p>conhecidas como polimerases translesão, para replicação durante a lesão do DNA.</p><p>Essas polimerases não possuem atividade de correção e são muito menos criterio-</p><p>sas do que as polimerases replicativas na escolha do nucleotídeo a ser inicialmente</p><p>incorporado. Provavelmente por isso, essas polimerases translesão são capazes de</p><p>adicionar apenas um ou poucos nucleotídeos antes de a polimerase replicativa de</p><p>alta precisão continuar a síntese de DNA.</p><p>Um tipo de lesão no DNA potencialmente perigosa ocorre quando as duas fitas</p><p>da dupla-hélice são quebradas, não havendo uma fita molde intacta para o reparo.</p><p>As quebras desse tipo são causadas por radiação ionizante, erros na replicação,</p><p>agentes oxidantes e alguns outros metabólitos produzidos pela célula.</p><p>Se essas lesões não forem corrigidas, rapidamente resultarão na degradação dos</p><p>cromossomos em fragmentos menores e na perda de genes na divisão celular.</p><p>Um dos mecanismos para corrigir esse tipo de dano é a ligação de extremidades</p><p>não homólogas, em que as extremidades da quebra são simplesmente justapostas e</p><p>religadas, geralmente, com a perda de nucleotídeos no sítio da ligação.</p><p>Esse mecanismo de ligação de extremidades é uma resposta comum nas células</p><p>somáticas de mamíferos, parecendo uma solução aceitável para religar cromosso-</p><p>mos “quebrados”.</p><p>Um mecanismo de reparo de quebras na fita dupla mais preciso acontece quando o</p><p>DNA é recém-sintetizado, ocorrendo reparação usando a cromátide-irmã como molde.</p><p>35</p><p>UNIDADE Descobrindo o DNA e a Origem da Vida</p><p>Teste seu conhecimento:</p><p>• O que é reparo de DNA? Quais são as 2 principais vias?</p><p>• Qual é o principal fator de reconhecimento de qual base está errada?</p><p>• Que fatores podem ocasionar lesão no DNA onde as duas fitas da dupla-hélice</p><p>são quebradas?</p><p>• O que acontece se as lesões não forem corrigidas rapidamente?</p><p>Metilação: O Reparo de DNA e o Câncer</p><p>A importância da correção de pareamento incorreto em humanos é bem evidente</p><p>em indivíduos que herdam uma cópia defeituosa de um gene de reparo (com uma</p><p>cópia funcional do gene no outro cromossomo).</p><p>Esses indivíduos apresentam uma predisposição significativa para certos tipos</p><p>de câncer. Em um tipo de câncer de cólon, chamado de Câncer de Cólon Heredi-</p><p>tário sem Polipose (HNPCC, Hereditary Non-Polyposis Colon Cancer), mutações</p><p>espontâneas no único gene funcional produzem clones de células somáticas que,</p><p>devido à deficiência no Sistema de Reparo de pareamento incorreto, acumulam</p><p>mutações rapidamente.</p><p>Determinados genes são chamados genes supressores de tumor, nos quais mu-</p><p>tações que levem à perda de função podem contribuir para o câncer.</p><p>Dessa forma, uma alteração em um gene humano cujo produto atua no reparo</p><p>de pares de bases mal pareadas resultantes de erros na replicação do DNA podem</p><p>causar predisposição hereditária a cânceres de cólon e alguns outros órgãos, devido</p><p>à aumentada taxa de mutações.</p><p>Um outro exemplo são mutações nos genes BRCA1 e BRCA2, que comprome-</p><p>tem um tipo de reparo de DNA conhecido como recombinação homóloga e são a</p><p>causa do câncer hereditário de mama e ovário.</p><p>Talvez você se lembre de um caso famoso em que uma atriz fez a retirada desses</p><p>órgãos por possuir a mutação nos genes BRCA1 e BRCA2 o que lhe conferia um</p><p>risco aumentado de câncer.</p><p>Entenda mais sobre os genes BRCA1 e BRCA2. Acesse em: https://bit.ly/3R1Zdzi</p><p>A metilação do DNA eucariótico possui vários usos e ocorre, sobretudo, nos</p><p>nucleotídeos de citosina (C), principalmente, na sequência CG. Um reflexo da impor-</p><p>tância da metilação do DNA em humanos é a associação dos padrões de metilação</p><p>“incorretos” durante a progressão do câncer.</p><p>36</p><p>37</p><p>Por exemplo, o MLH1 e outros genes de reparo de pareamento incorreto de DNA</p><p>silenciados por metilação do DNA estão envolvidos na causa de câncer de cólon.</p><p>O vídeo disponível no link a seguir mostra os mecanismos epigenéticos e a sua importân-</p><p>cia no desenvolvimento e no crescimento celular e como eles são fundamentais na altera-</p><p>ção de genes que levam à formação de tumores. Explica detalhadamente os processos de</p><p>metilação e de desmetilação do DNA, enfatizando o papel de cada enzima nesse processo.</p><p>Disponível em: https://youtu.be/6pS0BiizwWg</p><p>Apesar de apenas cerca de 3% dos nucleotídeos C serem metilados no DNA de</p><p>humanos, as mutações nesses nucleotídeos metilados respondem por cerca de um</p><p>terço das mutações pontuais (envolvendo uma única base) observadas nas doen-</p><p>ças hereditárias.</p><p>A maioria dos cânceres surge a partir de células que acumularam múltiplas muta-</p><p>ções. As células deficientes para esse Sistema de Reparo apresentam chance muito</p><p>aumentada de se tornarem cancerosas.</p><p>Todas as células de um organismo têm a mesma sequência de DNA, mas cada</p><p>tipo de célula usa só uma parte da informação total contida na molécula. No câncer,</p><p>esse processo é alterado por meio da chamada metilação de DNA.</p><p>Para entender esses conceitos e como eles afetam a progressão dos tumores e saber o que</p><p>é Epigenética, veja os vídeos apontados nos links a seguir.</p><p>• Expressão de genes e metilação de DNA, disponível em: https://youtu.be/i8UaHnorqcQ</p><p>• Como as escolhas que você faz podem afetar seus genes – Carlos Guerrero-Bosagna,</p><p>disponível em: https://youtu.be/_aAhcNjmvhc</p><p>Teste seu conhecimento:</p><p>• O que são genes supressores de tumor?</p><p>• O que é metilação?</p><p>37</p><p>UNIDADE Descobrindo o DNA e a Origem da Vida</p><p>Material Complementar</p><p>Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade:</p><p>Livros</p><p>Biologia Molecular da célula</p><p>ALBERTS, B. Biologia Molecular da célula. 6.ed. Porto Alegre ArtMed 2017.</p><p>Leitura</p><p>Dogma Central e material genético</p><p>https://bit.ly/2DBskGo</p><p>Velocidade e precisão na replicação do DNA</p><p>https://bit.ly/3iX1tVD</p><p>Replicação do DNA em procariontes e eucariontes</p><p>https://bit.ly/2DCnx7z</p><p>Verificação e reparo do DNA</p><p>https://bit.ly/3iX1Q2t</p><p>Predisposição hereditária ao câncer de mama e sua</p><p>relação com os genes BRCA1 e BRCA2: revisão da literatura</p><p>https://bit.ly/3h02wSY</p><p>38</p><p>39</p><p>Referências</p><p>ALBERTS, B. Biologia Molecular da célula. 6.ed. Porto Alegre: ArtMed, 2017.</p><p>DE ROBERTIS, E. M. Biologia celular e molecular. 16.ed. Rio de Janeiro: Guanabara</p><p>Koogan, 2014.</p><p>JUNQUEIRA, L. C. U.; CARNEIRO, J. Biologia Celular e Molecular. 9.ed. Rio de</p><p>Janeiro: Guanabara, 2015.</p><p>LODISH, H. et al. Biologia celular e molecular. 7.ed. Porto Alegre: ArtMed, 2014.</p><p>WATSON, J. D. et al. Biologia Molecular do Gene. 7.ed. Porto Alegre: Artmed, 2015.</p><p>ZAHA, A, et al. Biologia Molecular Básica. 5.ed. Porto Alegre: Artmed, 2014.</p><p>39</p>