A new method for rapid determination of carbohydrate and total en pt (1)

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<p>U</p><p>c</p><p>A</p><p>C</p><p>H</p><p>R</p><p>f</p><p>a</p><p>D</p><p>P</p><p>Á</p><p>C</p><p>F</p><p>M</p><p>1</p><p>a</p><p>p</p><p>2</p><p>B</p><p>2</p><p>i</p><p>M</p><p>T</p><p>)</p><p>C</p><p>a</p><p>S</p><p>F</p><p>P</p><p>n</p><p>p</p><p>c</p><p>P</p><p>C</p><p>E</p><p>0</p><p>h</p><p>Traduzido</p><p>Polímeros de Carboidratos97 (2013) 253–261</p><p>Listas de conteúdo disponíveis emCiênciaDireta do SciVerse</p><p>Polímeros de Carboidratos</p><p>página inicial do jornal:www. todos eles. com/ l oc ate / carro bpo l</p><p>m novo método para determinação rápida de concentrações de</p><p>arboidratos e carbono total usando espectrofotometria UV</p><p>mmar A. Albalasmeh, Asmeret Asefaw Berhe, Teamrat A. Ghezzehei*</p><p>iências da Vida e do Meio Ambiente, Universidade da Califórnia, Merced, Estados Unidos</p><p>informação do artigo resumo</p><p>istórico do artigo:</p><p>ecebido em 12 de novembro de 2012 Recebido em</p><p>orma revisada em 24 de abril de 2013 Aceito em 25 de</p><p>bril de 2013</p><p>isponível online em 7 de maio de 2013</p><p>Um novo método baseado em espectrofotometria UV para determinar a concentração e o conteúdo de carbono da</p><p>solução de carboidrato foi desenvolvido. Este método depende do potencial inerente de absorção UV de</p><p>subprodutos de hidrólise de carboidratos formados pela reação com ácido sulfúrico concentrado (derivados de</p><p>furfural). O método proposto é uma grande melhoria em relação ao método amplamente utilizado de Fenol-Ácido</p><p>Sulfúrico desenvolvido porDuBois, Gilles, Hamilton, Rebers e Smith (1956). No método antigo, o furfural é deixado</p><p>desenvolver cor por reação com fenol e sua concentração é detectada pela absorção de luz visível. Aqui</p><p>alavras-chave:</p><p>do Inglês para o Português - www.onlinedoctranslator.com</p><p>apresentamos um método que elimina a etapa de coloração e evita os riscos à saúde e ao meio ambiente</p><p>associados ao uso de fenol. Além disso, evitar essa etapa demonstrou melhorar a precisão da medição, ao mesmo</p><p>tempo em que reduz significativamente o tempo de espera antes da leitura de absorção de luz. Os carboidratos</p><p>para os quais as concentrações e o conteúdo de carbono podem ser estimados de forma confiável com essa nova</p><p>técnica rápida de ácido sulfúrico-UV incluem: monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos com peso molecular</p><p>cido Fenol-Sulfúrico</p><p>arboidrato</p><p>urfural</p><p>étodo UV</p><p>muito alto.</p><p>. Introdução</p><p>A determinação da concentração de carboidratos em soluções</p><p>quosas é um componente muito importante de diversas áreas da</p><p>esquisa ambiental (Fukasawa, Tateno, Hagiwara, Hirose e Osono,</p><p>012; Goupil et al., 2012; Raynaud, Vaxelaire, Olivier, Dieude-Fauvel e</p><p>audez, 2012; Takei, Bartolo, Fujihara, Ueta e Donald, 2012; Yu et al.,</p><p>012; Zhang, Bancos e Céu, 2012) bem como aplicações industriais na</p><p>ndústria do petróleo (Fujieda, Kitamura, Yamasaki, Furuishi e</p><p>otobayashi, 2012; Pilavtepe, Sargin, Celiktas e Yesil-Celiktas, 2012;</p><p>rzcinski, Hernández e Webb, 2012; Zhao et al., 2012; Zheng et al., 2012</p><p>, farmacêutica (Bai et al., 2012; Coura et al., 2012; Lee, Hsieh, Chen e</p><p>hiang, 2012; Pereira et al., 2012; Zha et al., 2012) e indústrias</p><p>limentícias (Al-Sheraji et al., 2012; Golovchenko, Khramova, Ovodova,</p><p>hashkov e Ovodov, 2012; Rondan-Sanabria, Valcarcel-Yamani, &</p><p>inardi-Filho, 2012; Sheu e Lai, 2012; Vriesmann, Teófilo e de Oliveira</p><p>etkowicz, 2012). A grande diversidade de carboidratos envolvidos</p><p>essas áreas levou ao desenvolvimento de inúmeras técnicas analíticas</p><p>ara medir as concentrações de carboidratos, incluindo a</p><p>romatografia (Jahnel, Ilieva e Frimmel, 1998; Mason e Slover, 1971;</p><p>rodolliet et al., 1995), eletroforese capilar (Cortacero-Ramirez, Segura-</p><p>arretero, Cruces-Blanco, de Castro e Fernandez-Gutierrez, 2004;</p><p>lRassi & Mechref, 1996; Soga & Serwe,</p><p>*Autor correspondente. Tel.: +1 209 228 4711.</p><p>Endereço de email:taghezzehei@ucmerced.edu (TA Ghezzehei).</p><p>144-8617/$ – veja matéria inicial© 2013 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.</p><p>ttp://dx.doi.org/10.1016/j.carbpol.2013.04.072</p><p>© 2013 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.</p><p>2000), espectroscopia de infravermelho (IR) (Cadete, 1999; Robert &</p><p>Cadete, 1998; Wang, Liu, Li, Chang, & Jing, 2011), detecção de dispersão</p><p>de luz (Suortti, Gorenstein e Roger, 1998; Zhang, Sheng e Yu, 2008) e</p><p>espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) (Copur,</p><p>Kiemle, Stipanovic, Koskinen e Makkonen, 2003; Duquesnoy, Castola e</p><p>Casanova, 2008). O uso de muitos desses métodos requer considerável</p><p>investimento financeiro, habilidades analíticas avançadas e tempo.</p><p>Uma das abordagens mais versáteis, relativamente fáceis e baratas</p><p>para determinação de concentrações de carboidratos é o método</p><p>colorimétrico baseado na reação entre solução de carboidrato</p><p>hidrolisado e um reagente corante que desenvolve cor detectável na</p><p>faixa visível do espectro eletromagnético. Os reagentes comumente</p><p>usados para desenvolvimento de cor incluem fenol (C6O5OH) (DuBois</p><p>e outros, 1956), ferricianeto alcalino (2K4Fe(CN)6) (Inglês e Becker, 1943)</p><p>e antrona (C14O10O) (Madeira seca, 1946).</p><p>Dentre os métodos colorimétricos para análise de carboidratos,</p><p>destaca-se o método do fenol-ácido sulfúrico.DuBois e outros (1956)é</p><p>até agora o método mais confiável e tem sido amplamente utilizado em</p><p>uma ampla gama de campos. No momento em que este artigo foi</p><p>escrito, mais de 23.700 artigos distintos revisados por pares (incluindo</p><p>mais de 1.000 artigos revisados por pares somente em 2012) foram</p><p>indexados pela Web of Science®(Thommpson Reuters) citando o artigo</p><p>de métodos de DuBois e outros (1956). O método do ácido fenol-</p><p>sulfúrico depende da desidratação de sacarídeos hidrolisados em</p><p>derivados de furfural durante a reação com ácido sulfúrico concentrado</p><p>(Asghari e Yoshida, 2006; Bicker, Hirth e Vogel, 2003; DuBois et al.,</p><p>1956; Hung, Selkirk e Taylor, 1982; Itagaki, 1994; Lima et al., 2010; Rao e</p><p>Pattabiraman, 1989). Reação posterior dos derivados de furfural</p><p>dx.doi.org/10.1016/j.carbpol.2013.04.072</p><p>http://www.sciencedirect.com/science/journal/01448617</p><p>http://www.elsevier.com/locate/carbpol</p><p>http://crossmark.crossref.org/dialog/?doi=10.1016/j.carbpol.2013.04.072&domain=pdf</p><p>mailto:taghezzehei@ucmerced.edu</p><p>dx.doi.org/10.1016/j.carbpol.2013.04.072</p><p>https://www.onlinedoctranslator.com/pt/?utm_source=onlinedoctranslator&utm_medium=pdf&utm_campaign=attribution</p><p>2 s de ca</p><p>c</p><p>c</p><p>D</p><p>m</p><p>o</p><p>s</p><p>s</p><p>c</p><p>f</p><p>p</p><p>s</p><p>1</p><p>1</p><p>P</p><p>s</p><p>a</p><p>r</p><p>c</p><p>r</p><p>s</p><p>r</p><p>d</p><p>c</p><p>a</p><p>m</p><p>p</p><p>t</p><p>(</p><p>a</p><p>q</p><p>r</p><p>m</p><p>p</p><p>K</p><p>2</p><p>a</p><p>I</p><p>c</p><p>d</p><p>r</p><p>c</p><p>m</p><p>c</p><p>a</p><p>a</p><p>2</p><p>2</p><p>a</p><p>F</p><p>O</p><p>Á</p><p>p</p><p>(</p><p>f</p><p>54 AA Albalasmeh et al. / Polímero</p><p>om fenol forma complexos coloridos que absorvem luz na faixa visível,</p><p>om uma absorbância máxima no comprimento de onda de 490 nm (</p><p>uBois et al., 1956; Rao e Pattabiraman, 1989).</p><p>Embora seja mais fácil de usar do que muitos dos métodos disponíveis, o</p><p>étodo do fenol-ácido sulfúrico tem algumas desvantagens sérias. Primeiro,</p><p>agente corante usado neste método, o fenol, apresenta vários riscos à</p><p>aúde. O fenol e seus vapores são corrosivos para a pele, os olhos e o</p><p>istema respiratório. O contato repetido e prolongado com a pele pode</p><p>ausar dermatite ou queimaduras de segundo e terceiro graus. Da mesma</p><p>orma, a inalação prolongada ou repetida de vapores de fenol causa edema</p><p>ulmonar. A exposição prolongada ao fenol também tem impacto sério no</p><p>istema nervoso central (é uma forte neurotoxina), rins e fígado (Budavari,</p><p>996; Lin, Lee, Lai e Lin, 2006; Michalowicz e Duda, 2007). O fenol é um dos</p><p>26 "poluentes prioritários" atualmente regulamentados pela Agência de</p><p>roteção Ambiental dos EUA (Apêndice A da Parte 423 do CFR 40). Em</p><p>egundo lugar, o resultado do método padrão de fenol-ácido sulfúrico é</p><p>presentado em termos de concentrações equivalentes de glicose. Essa</p><p>epresentação pode ter limitações potenciais ao lidar com carboidratos</p><p>omplexos que não são polímeros simples de glicose. Finalmente, a</p><p>eatividade química dos carboidratos com o reagente de derivatização (ácido</p><p>ulfúrico) depende muito se os carboidratos são neutros ou aniônicos. Como</p><p>esultado, os coeficientes de absorção molar podem variar muito</p><p>ependendo da carga dos carboidratos analisados (Mecozzi, 2005).</p><p>O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma alternativa para o método</p><p>olorimétrico deDuBois e outros (1956)que alivia as desvantagens listadas</p><p>cima,</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0080</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0080</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0080</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0080</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0080</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0080</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0080</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0080</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0080</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0080</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0085</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0090</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0095</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0095</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0095</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0095</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0095</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0095</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0095</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0095</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0095</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0095</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0095</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0095</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0095</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0095</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0095</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0095</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0095</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0100</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0100</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0100</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-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f0285</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0285</p><p>http://refhub.elsevier.com/S0144-8617(13)00436-0/sbref0285</p><p>A new method for rapid determination of carbohydrate and total carbon concentrations using UV spectrophotometry</p><p>1 Introduction</p><p>2 Materials and methods</p><p>2.1 Reagents and apparatus</p><p>2.2 Analytical methods</p><p>2.2.1 Phenol–Sulfuric Acid method</p><p>2.2.2 Sulfuric Acid–UV method</p><p>2.2.3 Total carbon analysis</p><p>2.3 Interaction time</p><p>2.4 Method validation</p><p>2.5 Statistical analysis</p><p>3 Results and discussion</p><p>3.1 Absorption spectra</p><p>3.2 Effects of reaction time</p><p>3.3 Measurement of carbohydrate concentrations</p><p>3.4 Measurement of total carbon content</p><p>3.5 Method validation</p><p>4 Conclusion</p><p>Acknowledgements</p><p>Appendix A Supplementary data</p><p>Appendix B Supplementary Data</p><p>reduzindo o tempo de espera da reação, melhorando a precisão das</p><p>edições, eliminando os riscos representados pelo uso de fenol e</p><p>ermitindo a correlação direta da absorbância de luz com a concentração</p><p>otal de carbono em soluções aquosas.</p><p>A motivação para este estudo foi derivada do trabalho de Itagaki</p><p>1994), que mostrou que a solução aquosa de furfural tem máximos de</p><p>bsorção de luz UV em 277 nm. Além disso,Itagaki (1994) mostraram</p><p>ue a glicose e a celulose absorvem luz UV a 323 nm após hidrólise por</p><p>eação com ácido sulfúrico concentrado. A mudança batocrômica nos</p><p>áximos de absorção de 277 nm para 323 nm foi causada pela</p><p>resença de ácido sulfúrico em solução (Hammond e Modic, 1953;</p><p>anetake e Otomo, 1988; Premakumari et al., 2011; Srivastava e Kumar,</p><p>007). Foi demonstrado que o deslocamento batocrômico geralmente</p><p>umenta com a concentração de ácido sulfúrico usado como solvente (</p><p>tagaki, 1994; Layne, Jaffe, & Zimmer, 1963; LP, 1974).</p><p>Neste artigo, apresentaremos um método para determinação de</p><p>oncentrações de açúcar e teor de carbono de soluções aquosas que</p><p>epende da absorbância UV de derivados de furfural produzidos por</p><p>eação com ácido sulfúrico concentrado. Apresentaremos uma</p><p>omparação entre o método padrão de ácido sulfúrico-fenol e o</p><p>étodo proposto de ácido sulfúrico-UV usando soluções aquosas de</p><p>arboidratos neutros (glicose, frutose, sacarose, amido, dextrano e</p><p>ctigum) e aniônicos (ácido poligalacturônico (PGA) e xantana) que são</p><p>mplamente usados em pesquisas ambientais e aplicações industriais.</p><p>. Materiais e métodos</p><p>.1. Reagentes e aparelhos</p><p>Todos os produtos químicos utilizados no estudo eram de grau</p><p>nalítico reagente. Glicose (C6O12O6) foi obtido da Sigma–Aldrich.</p><p>rutose (C6O12O6), sacarose (C12O22O11), amido ((C6O10O5)e), fenol (C6O6</p><p>) e hidróxido de potássio (KOH) foram obtidos da Fischer Scientific.</p><p>cido sulfúrico concentrado (H2ENTÃO4) foi obtido da ACROS. Ácido</p><p>oligalacturônico (PGA) ((C6O8O6)e), xantana ((C35O49O25)e) e dextrano</p><p>(C6O12O6)e) foram obtidos da MP Biomedicals. Actigum ((C24O40O19)e)</p><p>oi obtido da Cargill</p><p>rboidratos97 (2013) 253–261</p><p>empresa. As medições de absorção foram feitas em um</p><p>espectrofotômetro Thermo Scientific Evolution 300 UV–vis.</p><p>Uma solução estoque de cada carboidrato foi preparada</p><p>dissolvendo 0,1 g de carboidrato seco em 1 L de água de miliporo duplo</p><p>(DDI). Como o PGA é insolúvel em água, ele foi tornado solúvel pela</p><p>adição de hidróxido de potássio (KOH). Foi relatado anteriormente que</p><p>0,46 mL de KOH são necessários para dissolver 100 mg de PGA (</p><p>Czarnes, Hallett, Bengough e Young, 2000). No entanto, nossos</p><p>experimentos preliminares indicaram que o pH da solução preparada é</p><p>um melhor indicador da solubilidade do PGA. Descobrimos que o pH da</p><p>solução tem que ser elevado para 12,4 para dissolução completa e esse</p><p>procedimento foi usado ao longo deste estudo. Várias diluições das</p><p>soluções de carboidratos de estoque foram feitas pipetando um</p><p>volume conhecido da solução de estoque e completando o volume com</p><p>água DDI. As concentrações que foram preparadas para este estudo</p><p>são: 0, 0,01, 0,03, 0,05 e 0,07 g/L.</p><p>2.2. Métodos analíticos</p><p>Nos parágrafos abaixo descrevemos dois métodos que se baseiam</p><p>na absorção de luz na faixa visível e UV: o Método do Fenol-Ácido</p><p>Sulfúrico (DuBois e outros, 1956) e o método proposto de ácido</p><p>sulfúrico-UV, respectivamente.</p><p>2.2.1. Método do ácido fenol-sulfúrico</p><p>Este é o método colorimétrico mais amplamente utilizado até o</p><p>momento para determinação da concentração de carboidratos em soluções</p><p>aquosas (DuBois e outros, 1956). O princípio básico deste método é que os</p><p>carboidratos, quando desidratados pela reação com ácido sulfúrico</p><p>concentrado, produzem derivados de furfural. A reação posterior entre</p><p>derivados de furfural e fenol desenvolve cor detectável. O procedimento</p><p>padrão deste método é o seguinte. Uma alíquota de 2 mL de uma solução de</p><p>carboidrato é misturada com 1 mL de solução aquosa de fenol a 5% em um</p><p>tubo de ensaio. Posteriormente, 5 mL de ácido sulfúrico concentrado são</p><p>adicionados rapidamente à mistura. Após deixar os tubos de ensaio em</p><p>repouso por 10 min, eles são agitados por 30 s e colocados por 20 min em</p><p>banho-maria em temperatura ambiente para desenvolvimento da cor. Em</p><p>seguida, a absorção de luz a 490 nm é registrada em um espectrofotômetro.</p><p>As soluções de referência são preparadas de maneira idêntica à acima,</p><p>exceto que a alíquota de 2 mL de carboidrato é substituída por água DDI. O</p><p>fenol usado neste procedimento foi redestilado e 5% de fenol em água (p/p)</p><p>foi preparado imediatamente antes das medições.</p><p>2.2.2. Método do ácido sulfúrico-UV</p><p>O procedimento do método proposto Ácido Sulfúrico-UV é o seguinte.</p><p>Uma alíquota de 1 mL de solução de carboidrato é rapidamente misturada</p><p>com 3 mL de ácido sulfúrico concentrado em um tubo de ensaio e agitada</p><p>por 30 s. A temperatura da mistura sobe rapidamente dentro de 10–15 s</p><p>após a adição de ácido sulfúrico. Então, a solução foi resfriada em gelo por 2</p><p>min para trazê-la à temperatura ambiente. Finalmente, a absorção de luz UV</p><p>a 315 nm é lida usando espectrofotômetro UV. Soluções de referência são</p><p>preparadas seguindo o mesmo procedimento acima, exceto que a alíquota</p><p>de carboidrato é substituída por água DDI.</p><p>2.2.3. Análise de carbono total</p><p>Um dos objetivos deste trabalho foi determinar se há uma relação</p><p>linear entre a absorção espectrofotométrica das soluções de açúcar e a</p><p>concentração total de carbono das soluções aquosas. Para este</p><p>propósito, a concentração de carbono de todos os açúcares foi medida</p><p>usando um analisador Shimadzu TOC-Vcsh. No entanto, a análise de</p><p>carbono total de soluções de xantana e actigum usando o analisador</p><p>TOC não foi confiável. Como esses carboidratos formam suspensões</p><p>viscosas, o pequeno volume de amostra extraído pelo</p><p>s de ca</p><p>A</p><p>P</p><p>[</p><p>o</p><p>e</p><p>c</p><p>m</p><p>d</p><p>c</p><p>2</p><p>m</p><p>c</p><p>f</p><p>5</p><p>2</p><p>r</p><p>s</p><p>2</p><p>m</p><p>l</p><p>p</p><p>n</p><p>p</p><p>v</p><p>c</p><p>a</p><p>d</p><p>a</p><p>N</p><p>L</p><p>relacionada a diferenças na concentração de ácido sulfúrico nas alíquotas</p><p>o</p><p>v</p><p>f</p><p>e</p><p>u</p><p>m</p><p>c</p><p>c</p><p>p</p><p>p</p><p>t</p><p>a</p><p>d</p><p>e</p><p>o</p><p>d</p><p>AA Albalasmeh et al. / Polímero</p><p>agulha do analisador de TOC não é necessariamente representativa.</p><p>ortanto, aproximamos o conteúdo de carbono dessas soluções como:</p><p>e MCp S</p><p>MS</p><p>C] = (1)</p><p>nde [C] é o carbono total calculado teoricamente (em massa/volume),</p><p>é o número de átomos de C na unidade básica da molécula de</p><p>arboidrato,MCé a massa molar do átomo de carbono,MSé a massa</p><p>olar de uma única unidade da molécula de carboidrato,pé a pureza</p><p>o reagente de carboidrato usado expressa como fração, eSé a</p><p>oncentração preparada da solução de carboidrato (em massa/volume).</p><p>.3. Tempo de interação</p><p>Testamos o efeito do tempo de interação na precisão de ambos os</p><p>étodos. Isso foi feito variando o tempo de espera após ácido sulfúrico</p><p>oncentrado ser adicionado às soluções de carboidratos. O efeito do tempo</p><p>oi testado em soluções de glicose de 0,01 e 0,07 g/L e tempos de espera de</p><p>, 15, 30, 45, 75, 105, 135 e 225 min.</p><p>.4. Validação do método</p><p>A validação do novo método (método Ácido Sulfúrico-UV) foi</p><p>ealizada de acordo com as diretrizes da Conferência Internacional</p><p>obre Harmonização (ICH) (Diretrizes Tripartites Harmonizadas do ICH,</p><p>005). O processo de validação foi realizado em termos das seguintes</p><p>étricas: limite de detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ),</p><p>inearidade, precisão e exatidão. Além disso, o novo método foi testado</p><p>ara possível interferência de componentes da solução que absorvem</p><p>a faixa UV de interesse, principalmente proteínas e flavonoides.</p><p>O limite de detecção (LOD) é a menor concentração de analito que</p><p>ode ser detectada, mas não necessariamente quantificada como um</p><p>alor exato, enquanto o limite de quantificação (LOQ) é a menor</p><p>oncentração de analito que pode ser medida com precisão e exatidão</p><p>dequadas (Currie, 1999). LOD e LOQ são calculados para concentração</p><p>e carboidratos versus absorbância e carbono total versus relações de</p><p>bsorbância como</p><p>ível de detalhe = 3,52-b (2)</p><p>OQ = 16,67-b (3)</p><p>nde -bé o respectivo desvio padrão</p><p>do branco.</p><p>A linearidade de um ensaio se refere à capacidade do ensaio de obter</p><p>alores de resposta que são relacionados à concentração do analito por uma</p><p>unção matemática definida. Em termos quantitativos, a linearidade é</p><p>xpressa como o coeficiente de regressão para ajustar os pontos de dados a</p><p>ma linha reta. A linearidade foi avaliada pelo método de regressão dos</p><p>ínimos quadrados com determinações triplicadas em cada nível de</p><p>oncentração.</p><p>A precisão de um procedimento analítico descreve o quão bem as</p><p>oncentrações medidas concordam com os valores de referência aceitos. A</p><p>recisão foi avaliada em termos de erro relativo percentual e recuperação</p><p>ercentual média. Para esse propósito, um conjunto separado de amostras</p><p>riplicadas foi preparado e suas concentrações foram determinadas usando</p><p>s equações de calibração ajustadas. Erro relativo percentual (eu)foi</p><p>eterminado como</p><p>[C]*− [C]</p><p>[C]u =100 (4)</p><p>nde [C]*denota a concentração de carboidratos (teor de carbono)</p><p>eterminada pelo novo método e [C]está preparado</p><p>rboidratos97 (2013) 253–261 255</p><p>concentração de carboidratos (teor de carbono). Da mesma forma, a porcentagem de</p><p>recuperação (r)foi calculado como</p><p>[C]*</p><p>[C]r =100 (5)</p><p>A precisão de um procedimento analítico expressa a proximidade da</p><p>concordância (grau de dispersão) entre uma série de medições obtidas</p><p>de múltiplas amostragens da mesma amostra homogênea sob as</p><p>condições prescritas. A precisão de um procedimento analítico é</p><p>geralmente expressa em termos de desvio padrão (DP) dentro da série</p><p>de medições.</p><p>Para testar a possível interferência da presença de proteínas e/ou</p><p>flavonoides em soluções de amostra, testamos a absorbância UV de</p><p>soluções de albumina de soro bovino (BSA) e ácido cinâmico que foram</p><p>submetidas ao procedimento completo do método proposto Ácido</p><p>Sulfúrico–UV. O objetivo deste teste foi verificar se a reação com ácido</p><p>sulfúrico concentrado reduziria ou eliminaria a absorbância UV desses</p><p>compostos que são conhecidos por absorver luz UV na faixa alvo.</p><p>2.5. Análise estatística</p><p>Todas as medições neste estudo foram conduzidas em três amostras</p><p>replicadas. Todos os pontos de dados e espectros relatados denotam as</p><p>médias das replicadas. Barras de erro não são mostradas nos gráficos</p><p>porque a desordem dificulta a distinção entre os símbolos que representam</p><p>diferentes carboidratos. A média e o erro padrão de todos os dados</p><p>relatados nas figuras são fornecidos nos dados suplementares eletrônicos. A</p><p>análise de dados foi conduzida usando o programa de software de análise</p><p>estatística R. Diferenças significativas entre as médias foram analisadas pelo</p><p>teste HSD (diferença honestamente significativa) de Tukey em nível de</p><p>probabilidade < 0,05.</p><p>3. Resultados e discussão</p><p>Oito carboidratos foram testados no estudo, incluindo</p><p>monossacarídeos (glicose e frutose), dissacarídeo (sacarose) e</p><p>polissacarídeos (amido, actigum, dextrano, PGA e xantana). PGA e</p><p>xantana são carboidratos inerentemente aniônicos, enquanto todos os</p><p>outros são neutros.</p><p>3.1. Espectros de absorção</p><p>Absorção de luz em toda a faixa visível do espectro eletromagnético</p><p>para todas as soluções de carboidratos preparadas de acordo com o</p><p>método do fenol-ácido sulfúrico (DuBois e outros, 1956) é apresentado</p><p>na Fig. A1 (Dados suplementares). As figuras representam a fração da</p><p>luz absorvida (e-eixo) como uma função do comprimento de onda (x-</p><p>eixo). Todos os carboidratos, com exceção do PGA, apresentam máximo</p><p>de absorção em 490 nm, de acordo com o método original (DuBois et</p><p>al., 1956; Rao e Pattabiraman, 1989). Todas as concentrações de PGA</p><p>apresentaram pico de absorção em 478 nm. No entanto, no restante</p><p>deste artigo, a absorção padrão de 490 nm é usada consistentemente</p><p>para PGA, bem como para o restante dos carboidratos.</p><p>Da mesma forma, a absorção de luz UV no espectro total de luz UV para</p><p>todas as soluções de carboidratos preparadas de acordo com o método</p><p>Ácido Sulfúrico–UV é apresentada na Fig. A2 (Dados suplementares). Todos</p><p>os carboidratos, com exceção do PGA, mostraram absorção máxima em 315</p><p>nm. Observe que esse pico de absorção é ligeiramente menor do que o</p><p>relatado porItagaki (1994)(322 nm). Essa ligeira mudança batocrômica está</p><p>analisadas. Todas as concentrações de PGA tiveram absorção máxima em</p><p>297 nm. No entanto, no restante deste artigo, a absorção em 315 nm é</p><p>usada para PGA a fim de ser consistente com o restante dos carboidratos.</p><p>256 AA Albalasmeh et al. / Polímeros de ca</p><p>1</p><p>0,8</p><p>0,6</p><p>0,4</p><p>0,2 0,01 g/L</p><p>0,07 g/L</p><p>0</p><p>1 10 100</p><p>Tempo de reação (minutos)</p><p>Figura 1.Comparação dos efeitos do tempo de reação na absorbância para o método do</p><p>ácido sulfúrico-fenol (símbolos preenchidos) e o método do ácido sulfúrico-UV (símbolos</p><p>abertos) para duas concentrações de glicose. Note que a absorbância escalonada denota</p><p>a</p><p>o</p><p>sulfúrico também foi observada anteriormente porMecozzi (2005).</p><p>3</p><p>d</p><p>S</p><p>d</p><p>A</p><p>e</p><p>s</p><p>p</p><p>d</p><p>q</p><p>e</p><p>></p><p>r</p><p>r</p><p>(</p><p>a</p><p>c</p><p>F</p><p>l</p><p>s</p><p>Ab</p><p>so</p><p>rb</p><p>ân</p><p>ci</p><p>a</p><p>es</p><p>ca</p><p>lo</p><p>na</p><p>da</p><p>absorbância em cada tempo de reação normalizada pela absorbância em 225 min, para</p><p>respectivo método e concentração.</p><p>.2. Efeitos do tempo de reação</p><p>O método Fenol–Ácido Sulfúrico requer vários minutos para o</p><p>esenvolvimento de cor visível. Em contraste, o método Ácido</p><p>ulfúrico–UV proposto é baseado na absorção de luz UV do carboidrato</p><p>esidratado, o que requer apenas vários segundos para ser concluído.</p><p>ssim, uma das características atraentes do método proposto é a</p><p>conomia de tempo.</p><p>EmFigura 1, o tempo de reação após a adição de ácido sulfúrico à</p><p>olução de carboidrato é comparado com a absorbância escalonada</p><p>ara ambos os métodos. A absorbância escalonada foi calculada</p><p>ividindo a absorbância em cada tempo pela absorbância em 225 min,</p><p>ue consideramos como a leitura estável. A partir desses resultados, é</p><p>vidente que o método Fenol-Ácido Sulfúrico requer</p><p>30 minutos para coloração completa dos derivados de furfural por</p><p>eação com fenol. Recomendação de tempo de espera semelhante foi</p><p>elatada anteriormente porDuBois e outros (1956)eRao e Pattabiraman</p><p>1989). Em contraste, a absorção UV do furfural no método proposto</p><p>tinge um nível estável rapidamente assim que a reação entre os</p><p>arboidratos e o ácido sulfúrico concentrado é concluída</p><p>0,1</p><p>0,09</p><p>0,08</p><p>0,07</p><p>0,06</p><p>0,05</p><p>0,04</p><p>0,03</p><p>0,02</p><p>0,01</p><p>0</p><p>- 0,01</p><p>- 0,02</p><p>(um)</p><p>Glicose</p><p>Frutose</p><p>Sacarose</p><p>Amido</p><p>Dextrano</p><p>Actigum</p><p>Xantana</p><p>PGA</p><p>0 0,2 0,4 0,6 0,8 1</p><p>Absor</p><p>igura 2.Resposta de absorbância a diferentes concentrações de carboidratos usando o método (a) Feno</p><p>inear aos dados e as linhas tracejadas representam o intervalo de confiança de 95% da linha de regressã</p><p>ímbolos abertos representam os açúcares neutros. Para os dados estatísticos, consulteTabela 1.</p><p>Co</p><p>nc</p><p>en</p><p>tr</p><p>aç</p><p>ão</p><p>d</p><p>e</p><p>aç</p><p>úc</p><p>ar</p><p>(g</p><p>/L</p><p>)</p><p>rboidratos97 (2013) 253–261</p><p>(provavelmente em poucos segundos). Nossas observações são</p><p>consistentes com as deItagaki (1994)que relataram que a absorção de</p><p>UV do furfural não muda com o tempo, permanecendo estável por até</p><p>cinco dias.</p><p>3.3. Medição das concentrações de carboidratos</p><p>Figura 2mostra a relação entre a absorbância (x-eixos) e a</p><p>concentração de diferentes carboidratos em g/L (e-eixo) para o método</p><p>Fenol-Ácido Sulfúrico (Figura 2a) e o método do ácido sulfúrico-UV (</p><p>Figura 2b) EmTabela 1mostramos os coeficientes das linhas de</p><p>regressão linear ajustadas individualmente a todos os dados de</p><p>carboidratos plotados emFigura 2para ambos os métodos.</p><p>Antes de discutir mais os méritos do método proposto, é importante</p><p>verificar se a absorbância medida é de fato dependente apenas da</p><p>concentração da solução. Este conceito é matematicamente resumido</p><p>na Lei de Beer-Lambert que relaciona a absorbância medida às</p><p>propriedades da solução e à geometria da amostra.</p><p>Um = -[C]l (6)</p><p>ondeUMé a absorbância, - [L2/M] é a absortividade de massa,C [M/G]3] é a</p><p>concentração eeu [L] é o comprimento do caminho da amostra. Escolhemos</p><p>usar a absortividade de massa (em vez da absortividade molar) porque a</p><p>massa molar de alguns dos carboidratos usados neste estudo (incluindo</p><p>actigum,</p><p>dextrano, PGA, amido e xantana) é conhecida apenas como uma</p><p>faixa de valores. Eq.(6)foi ajustado a todas as amostras individuais que foram</p><p>analisadas. A média e o coeficiente de variação dos valores de absortividade</p><p>de massa calculados são relatados em Tabela 1para cada carboidrato, bem</p><p>como para os carboidratos neutros e aniônicos coletivamente. O coeficiente</p><p>de variação é geralmente baixo, indicando que a lei de Beer-Lambert é</p><p>obedecida.</p><p>Os resultados emFigura 2e emTabela 1mostram claramente que há</p><p>uma forte correlação linear entre as concentrações de carboidratos e a</p><p>absorbância da luz, medida usando ambos os métodos. Além disso,</p><p>esses resultados indicam que há uma diferença distinta nas relações</p><p>concentração-absorvência entre os carboidratos neutros e os</p><p>carboidratos aniônicos, conforme indicado pelas inclinações dos ajustes</p><p>de regressão para os carboidratos neutros e aniônicos (relatados como</p><p>linhas emFigura 2). Diferença semelhante nos coeficientes de absorção</p><p>entre carboidratos neutros e aniônicos para o método fenol-ácido</p><p>Essas observações sugerem que a taxa de conversão de carboidrato</p><p>para derivados de furfural, após desidratação por ácido sulfúrico, não é</p><p>a mesma para carboidratos neutros e aniônicos. Assim,</p><p>(b)</p><p>0 0,2 0,4 0,6 0,8 1</p><p>vância</p><p>l–Ácido Sulfúrico e (b) Ácido Sulfúrico–UV. As linhas sólidas representam o ajuste de regressão</p><p>o. Observe que os símbolos preenchidos representam os açúcares aniônicos, enquanto os</p><p>AA Albalasmeh et al. / Polímeros de carboidratos97 (2013) 253–261 257</p><p>Tabela 1</p><p>Coeficientes das curvas padrão obtidas para os carboidratos (Figura 2) (correspondendo à absorbância versus as concentrações de carboidratos).</p><p>Açúcar Método Declive Interceptar Regressão</p><p>coeficiente (R2)</p><p>Absorvência de massa</p><p>(cm2g-1)**</p><p>Glicose Ácido Fenol-Sulfúrico</p><p>Ácido Sulfúrico–UV</p><p>Ácido Fenol-Sulfúrico</p><p>Ácido Sulfúrico–UV</p><p>Ácido Fenol-Sulfúrico</p><p>Ácido Sulfúrico–UV</p><p>Ácido Fenol-Sulfúrico</p><p>Ácido Sulfúrico–UV</p><p>Ácido Fenol-Sulfúrico</p><p>Ácido Sulfúrico–UV</p><p>Ácido Fenol-Sulfúrico</p><p>Ácido Sulfúrico–UV</p><p>Ácido Fenol-Sulfúrico</p><p>Ácido Sulfúrico–UV</p><p>Ácido Fenol-Sulfúrico</p><p>Ácido Sulfúrico–UV</p><p>Ácido Fenol-Sulfúrico</p><p>Ácido Sulfúrico–UV</p><p>Ácido Fenol-Sulfúrico</p><p>Ácido Sulfúrico–UV</p><p>0,1009Sobre</p><p>0,0762um</p><p>0,0903UM</p><p>0,0833um</p><p>0,0939Sobre</p><p>0,0802um</p><p>0,1028Sobre</p><p>0,0786um</p><p>0,1098Sobre</p><p>0,0836um</p><p>0,1158B</p><p>0,0851um</p><p>0,1933C</p><p>0,108b</p><p>0,2888C</p><p>0,1232b</p><p>0,2172</p><p>0,0807</p><p>0,2172</p><p>0,1135</p><p>− 0,0024</p><p>− 0,0017</p><p>− 0,0034</p><p>− 0,0017</p><p>− 0,0033</p><p>− 0,0018</p><p>- 0,0025</p><p>− 0,0018</p><p>− 0,0028</p><p>− 0,0026</p><p>- 0,0025</p><p>− 0,001</p><p>0,0015</p><p>0,0014</p><p>− 0,0032</p><p>0,0026</p><p>− 0,0021</p><p>− 0,0016</p><p>0,0016</p><p>0,0024</p><p>0,992</p><p>0,992</p><p>0,947</p><p>0,992</p><p>0,988</p><p>0,998</p><p>0,992</p><p>0,996</p><p>0,993</p><p>0,994</p><p>0,981</p><p>0,998</p><p>0,998</p><p>0,995</p><p>0,994</p><p>0,999</p><p>0,959</p><p>0,990</p><p>0,935</p><p>0,983</p><p>11,34 (0,13)</p><p>14,25 (0,07)</p><p>13,07 (0,18)</p><p>13,11 (0,08)</p><p>12,57 (0,14)</p><p>13,58 (0,07)</p><p>11,17 (0,13)</p><p>13,98 (0,08)</p><p>10,51 (0,13)</p><p>13,66 (0,12)</p><p>9,73 (0,11)</p><p>12,43 (0,05)</p><p>4,88 (0,09)</p><p>8,46 (0,10)</p><p>4,20 (0,24)</p><p>7,28 (0,12)</p><p>11,40 (0,16)</p><p>13,50 (0,09)</p><p>4,54 (0,18)</p><p>7,78 (0,13)</p><p>Frutose</p><p>Sacarose</p><p>Amido</p><p>Dextrano</p><p>Actigum</p><p>Xantana*</p><p>PGA*</p><p>Neutro</p><p>Aniônico</p><p>Os valores dentro de cada método seguidos pela mesma letra não são significativamente diferentes no nível de probabilidade = 0,05 de acordo com o teste de diferença honestamente significativa (HSD)</p><p>d</p><p>o</p><p>u</p><p>d</p><p>a</p><p>d</p><p>e</p><p>p</p><p>e</p><p>c</p><p>2</p><p>2</p><p>e</p><p>o</p><p>d</p><p>d</p><p>S</p><p>c</p><p>s</p><p>s</p><p>m</p><p>i</p><p>A</p><p>S</p><p>p</p><p>n</p><p>r</p><p>á</p><p>a</p><p>6</p><p>r</p><p>p</p><p>o</p><p>3</p><p>c</p><p>e Tukey.</p><p>* Carboidrato aniônico.</p><p>* * Média (coeficiente de variação (CV)).</p><p>método original do fenol-ácido sulfúrico (DuBois e outros, 1956), que</p><p>sa soluções de glicose como padrões de calibração, pode não ser</p><p>iretamente aplicável para carboidratos aniônicos sem o ajuste</p><p>propriado para as curvas de calibração (Mecozzi, 2005).</p><p>Um olhar mais atento aFigura 2a e as inclinações das retas de regressão</p><p>o método do fenol-ácido sulfúrico (Tabela 1) revela que houve diferenças</p><p>statisticamente significativas, embora pequenas, entre algumas das curvas</p><p>adrão dos carboidratos neutros. Em contraste, não houve diferença</p><p>statisticamente significativa entre as inclinações de regressão dos</p><p>arboidratos neutros medidos usando o método Ácido Sulfúrico–UV (Figura</p><p>b). Essas diferenças também se refletem no coeficiente de determinação (R</p><p>) valores das linhas de regressão ajustadas a todos os carboidratos neutros</p><p>aniônicos separadamente (relatados como linhas emFigura 2). Para ambos</p><p>s métodos, não houve diferenças nas inclinações de regressão entre o par</p><p>e açúcares aniônicos. Além disso, observe que a separação entre as linhas</p><p>e regressão neutra e aniônica é menor no método proposto Ácido</p><p>ulfúrico–UV.</p><p>As observações acima são consistentes com o fato de que todos os</p><p>arboidratos neutros são quebrados em moléculas de açúcar base</p><p>emelhantes quando hidrolisados. A variabilidade estatisticamente</p><p>ignificativa entre os carboidratos neutros, quando medida usando o</p><p>étodo Fenol-Ácido Sulfúrico, é provavelmente um resultado de leves</p><p>nconsistências na coloração dos derivados de furfural pelo Fenol.</p><p>ssim, a consistência significativamente melhor do método Ácido</p><p>ulfúrico-UV proposto pode ser explicada por (a) dependência direta do</p><p>otencial de absorção de UV dos derivados de furfural e (b) evitar a</p><p>ecessidade de um processo de desenvolvimento de cor separado.</p><p>Finalmente, os intervalos de confiança de 95% dos ajustes de</p><p>egressão agrupados indicam que os erros máximos do método do</p><p>cido fenol-sulfúrico (calculados no ponto médio da faixa de</p><p>bsorbância medida para cada grupo de carboidratos e método) são±</p><p>,5% e ±14,4% para os carboidratos neutros e aniônicos,</p><p>espectivamente. Os níveis de erro correspondentes do método</p><p>roposto Ácido Sulfúrico–UV são±2,8% e±7,5%, respectivamente. Assim,</p><p>método proposto corta o erro de medição em até metade.</p><p>.4. Medição do teor total de carbono</p><p>Em muitas aplicações, o conteúdo total de carbono, em vez da</p><p>oncentração de carboidratos em massa, é a medida mais desejável.</p><p>Para este fim, testamos se as absorbâncias medidas de acordo com o</p><p>método do ácido sulfúrico-fenol e o método proposto do ácido sulfúrico-UV</p><p>estão fortemente correlacionadas com o teor total de carbono das soluções.</p><p>As concentrações de carboidratos relatadas em Figura 2foram convertidos</p><p>em conteúdo total de carbono usando duas abordagens: (a) aproximados da</p><p>composição de carboidratos e concentração da solução de acordo com a Eq.</p><p>(1)e (b) medição direta do conteúdo de carbono de todas as soluções usando</p><p>o analisador TOC. Os valores calculados e medidos do conteúdo total de</p><p>carbono de todas as soluções de carboidratos, exceto aquelas de actigum e</p><p>xantana, estavam em forte concordância, conforme indicado pela</p><p>distribuição estreita dos pontos de dados em torno da linha 1:1 emFigura 3a.</p><p>No entanto, as concentrações de carbono medidas nas suspensões de</p><p>actigum e xantana foram significativamente menores do que os valores</p><p>calculados. Observações semelhantes também foram notadas por outros</p><p>pesquisadores (Fontes, Queiroz, Longo e Antunes, 2005) que analisou o</p><p>conteúdo total de carbono das suspensões. Causas prováveis para essa</p><p>subestimação do conteúdo de carbono medido incluem (a) os carboidratos</p><p>suspensos sedimentam antes da extração pelo amostrador automático do</p><p>analisador de TOC e/ou (b) a agulha de amostragem é muito fina para</p><p>extrair uma amostra representativa da suspensão. Portanto, os valores</p><p>calculados do conteúdo total de carbono de actigum e xantana são usados</p><p>no restante das discussões.</p><p>EmFigura 3b, o conteúdo de carbono (mg/L) das soluções de</p><p>carboidratos é comparado com as concentrações totais de carboidratos</p><p>correspondentes. Os coeficientes das equações de regressão linear</p><p>ajustadas individualmente a todos os carboidratos emFigura 3b são</p><p>fornecidos em Tabela 2. Os coeficientes de determinação muito elevados (R2</p><p>≥0,998) dos ajustes de regressão são indicativos da precisão com que as</p><p>amostras usadas neste estudo foram preparadas e as análises foram</p><p>realizadas. Também é importante notar que houve diferenças pequenas,</p><p>mas estatisticamente significativas, entre as inclinações das equações de</p><p>regressão fornecidas</p><p>emTabela 2. Portanto, não existe uma regra universal</p><p>para conversão da concentração total de carboidratos em teor de carbono (e</p><p>vice-versa).</p><p>Ao combinar os dados relatados emFiguras 2e3b, derivamos</p><p>relações entre o conteúdo total de carbono das soluções de</p><p>carboidratos e os valores de absorbância medidos usando os métodos</p><p>Fenol-Ácido Sulfúrico e Ácido Sulfúrico-UV (Figura 4). Os coeficientes</p><p>das equações de regressão linear ajustadas individualmente a todos os</p><p>carboidratos são relatados emTabela 3. Comparação do</p><p>258 AA Albalasmeh et al. / Polímeros de ca</p><p>Tabela 2</p><p>Coeficientes das medições do teor total de carbono obtidas para diferentes</p><p>concentrações de carboidratos (Figura 3B) (correspondente ao teor total de carbono em</p><p>mg/L versus a concentração de carboidratos).</p><p>Açúcar Declive Interceptar Regressão</p><p>coeficiente (R2)</p><p>Glicose</p><p>Frutose</p><p>Sacarose</p><p>Amido</p><p>Dextrano</p><p>Actigum*</p><p>Xantana*</p><p>PGA</p><p>400,05cd</p><p>381,39cd</p><p>395,95c</p><p>414,89c</p><p>362,83sobre</p><p>410.1bd</p><p>421,83cd</p><p>354,95um</p><p>0,7065</p><p>1.4205</p><p>1.2516</p><p>0,6514</p><p>0,9359</p><p>0</p><p>0</p><p>0,8412</p><p>1</p><p>0,999</p><p>0,998</p><p>1</p><p>1</p><p>1</p><p>1</p><p>1</p><p>Valores seguidos pela mesma letra não são significativamente diferentes no nível de</p><p>p</p><p>= 0,05</p><p>prontamente aparente que os valores de LOD são uma ordem de magnitude</p><p>c</p><p>T</p><p>p</p><p>n</p><p>Á</p><p>m</p><p>F</p><p>c</p><p>e</p><p>F</p><p>r</p><p>e</p><p>robabilidade de acordo com o teste de diferença honestamente significativa (HSD) de Tukey.</p><p>* Carbono total calculado.</p><p>oeficientes de determinação de carboidratos individuais relatados em</p><p>abela 1com aqueles emTabela 3revela que não houve ganho ou perda de</p><p>recisão de medição para nenhum dos métodos.</p><p>Além disso, linhas de regressão linear foram ajustadas aos grupos</p><p>eutro e aniônico de carboidratos. Os erros máximos do método Fenol-</p><p>cido Sulfúrico em nível de confiança de 95% (calculado no ponto</p><p>édio da faixa de absorbância medida para cada</p><p>35 Glicose</p><p>Frutose</p><p>Sacarose</p><p>Amido</p><p>Dextrano</p><p>Actigum</p><p>Xantana</p><p>PGA</p><p>1:1</p><p>30</p><p>25</p><p>20</p><p>15</p><p>10</p><p>5</p><p>(um</p><p>0</p><p>0 5 10 15 20 25 30</p><p>Carbono Total Calculado (mg/L)</p><p>igura 3.Relação entre o carbono total calculado e medido para os diferentes carboidratos usad</p><p>arboidratos (b). Observe que o conteúdo de carbono calculado é usado para actigum e xantana</p><p>xplicação).</p><p>40 (um)</p><p>35</p><p>30</p><p>25</p><p>20</p><p>Glicose</p><p>Frutose</p><p>Sacarose</p><p>Amido</p><p>Dextrano</p><p>Actigum</p><p>Xantana</p><p>PGA</p><p>15</p><p>10</p><p>5</p><p>0</p><p>0 0,2 0,4 0,6 0,8 1</p><p>Absor</p><p>igura 4.Resposta de absorbância ao conteúdo total de carbono para diferentes concentrações de carboidratos usa</p><p>epresentam o ajuste de regressão linear aos dados e as linhas tracejadas representam o intervalo de confiança de</p><p>nquanto os símbolos abertos representam os açúcares neutros. Para os dados estatísticos, consulteTabela 3.</p><p>Ca</p><p>rb</p><p>on</p><p>o</p><p>to</p><p>ta</p><p>l (</p><p>m</p><p>g/</p><p>L)</p><p>Ca</p><p>rb</p><p>on</p><p>o</p><p>To</p><p>ta</p><p>l M</p><p>ed</p><p>id</p><p>o</p><p>(m</p><p>g/</p><p>L)</p><p>rboidratos97 (2013) 253–261</p><p>grupo de carboidratos e método) são±6,1% e±8,4% para os</p><p>carboidratos neutros e aniônicos, respectivamente. Os níveis de erro</p><p>correspondentes do método proposto Ácido Sulfúrico–UV são±2,9% e±</p><p>4,2%, respectivamente. É importante destacar o fato de que o nível de</p><p>erro do método proposto Ácido Sulfúrico–UV é metade do método</p><p>Fenol–Ácido Sulfúrico. Além disso, observe que o erro em ambos os</p><p>métodos é significativamente diminuído quando usado para medir o</p><p>conteúdo de carbono em oposição à concentração de carboidratos (</p><p>Figura 2) das soluções aniônicas.</p><p>3.5. Validação do método</p><p>As características analíticas do método Ácido Sulfúrico–UV foram</p><p>avaliadas em termos de LOD, LOQ, linearidade, exatidão e precisão. Esses</p><p>testes de validação foram realizados usando as equações de calibração</p><p>combinadas que foram ajustadas aos dados de absorbância vs.</p><p>concentração de açúcar e absorbância vs. teor de carbono dos açúcares</p><p>neutros e aniônicos coletivamente. O LOD e LOQ para as equações de</p><p>calibração de concentração de açúcar foram calculados usando as Eqs.(2)e</p><p>(3)são 0,002 e 0,01 g/L, respectivamente. A partir desses resultados, é</p><p>menor do que a menor concentração usada para as calibrações. O LOQ, por</p><p>outro lado, é igual à menor concentração usada nas calibrações. Portanto, o</p><p>novo método e as calibrações fornecidas</p><p>) (b)</p><p>0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07</p><p>Concentração de açúcar (g/L)</p><p>os (a) e a correlação entre o conteúdo total de carbono medido e as concentrações de</p><p>na parte (b) porque o conteúdo de carbono medido não era confiável (veja o texto para</p><p>(b)</p><p>0 0,2 0,4 0,6 0,8 1</p><p>vância</p><p>ndo o método de fenol-ácido sulfúrico (a) e o método de ácido sulfúrico-UV (b). As linhas sólidas</p><p>95% da linha de regressão. Observe que os símbolos preenchidos representam os açúcares aniônicos,</p><p>AA Albalasmeh et al. / Polímeros de carboidratos97 (2013) 253–261 259</p><p>Tabela 3</p><p>Coeficientes das curvas padrão obtidas para os carboidratos (Figura 4) (correspondente à absorbância versus carbono total).</p><p>Açúcar Método Declive Interceptar Regressão</p><p>coeficiente (R2)</p><p>Glicose Ácido Fenol-Sulfúrico</p><p>Ácido Sulfúrico–UV</p><p>Ácido Fenol-Sulfúrico</p><p>Ácido Sulfúrico–UV</p><p>Ácido Fenol-Sulfúrico</p><p>Ácido Sulfúrico–UV</p><p>Ácido Fenol-Sulfúrico</p><p>Ácido Sulfúrico–UV</p><p>Ácido Fenol-Sulfúrico</p><p>Ácido Sulfúrico–UV</p><p>Ácido Fenol-Sulfúrico</p><p>Ácido Sulfúrico–UV</p><p>Ácido Fenol-Sulfúrico</p><p>Ácido Sulfúrico–UV</p><p>Ácido Fenol-Sulfúrico</p><p>Ácido Sulfúrico–UV</p><p>Ácido Fenol-Sulfúrico</p><p>Ácido Sulfúrico–UV</p><p>Ácido Fenol-Sulfúrico</p><p>Ácido Sulfúrico–UV</p><p>40.377Sobre</p><p>30.464um</p><p>34.423UM</p><p>31.810um</p><p>37.155Sobre</p><p>31.749um</p><p>42.587Sobre</p><p>32.565um</p><p>39.776Sobre</p><p>30.286um</p><p>47.499B</p><p>34.913um</p><p>81.536C</p><p>45.574b</p><p>102.590C</p><p>43.714b</p><p>39.231</p><p>31.848</p><p>− 0,2551</p><p>0,0330</p><p>0,1426</p><p>0,7525</p><p>− 0,0582</p><p>0,5364</p><p>− 0,3816</p><p>0,0622</p><p>− 0,0550</p><p>0,0024</p><p>- 1,0154</p><p>0,4228</p><p>0,6349</p><p>0,6042</p><p>− 0,2869</p><p>1.7694</p><p>- 0,0225</p><p>0,1701</p><p>0,991</p><p>0,991</p><p>0,945</p><p>0,993</p><p>0,985</p><p>0,995</p><p>0,988</p><p>0,992</p><p>0,991</p><p>0,993</p><p>0,981</p><p>0,998</p><p>0,998</p><p>0,995</p><p>0,995</p><p>0,998</p><p>0,960</p><p>0,988</p><p>0,976</p><p>0,994</p><p>Frutose</p><p>Sacarose</p><p>Amido</p><p>Dextrano</p><p>Actigum</p><p>Xantana*</p><p>PGA*</p><p>Neutro</p><p>Aniônico 86.733</p><p>44.612</p><p>0,7281</p><p>1.2159</p><p>Os valores dentro de cada método seguidos pela mesma letra não são significativamente diferentes no nível de probabilidade = 0,05 de acordo com o teste de diferença honestamente significativa (HSD)</p><p>de Tukey.</p><p>* Carbono total calculado.</p><p>Tabela 4</p><p>Exatidão e precisão do método Ácido Sulfúrico-UV.</p><p>Açúcar Preparado Medido % Recuperação % Erro relativo</p><p>Concentrado de açúcar.</p><p>(g/L)</p><p>Conteúdo de carbono</p><p>(mg/L)</p><p>Concentrado de açúcar.</p><p>(g/L)</p><p>DP* Conteúdo de carbono</p><p>(mg/L)</p><p>DP* Concentrado de açúcar. Carbono</p><p>contente</p><p>Concentrado de açúcar. Carbono</p><p>contente</p><p>Glicose 0,010</p><p>0,030</p><p>0,070</p><p>0,010</p><p>0,030</p><p>0,070</p><p>0,010</p><p>4.667</p><p>12.717</p><p>28.723</p><p>4.560</p><p>12.850</p><p>29.867</p><p>4.595</p><p>0,010</p><p>0,031</p><p>0,070</p><p>0,010</p><p>0,031</p><p>0,071</p><p>0,010</p><p>0,0024</p><p>0,0023</p><p>0,0010</p><p>0,0055</p><p>0,0091</p><p>0,0064</p><p>0,0035</p><p>4.788</p><p>12.941</p><p>0,0035</p><p>0,0095</p><p>0,0042</p><p>0,0021</p><p>0,0089</p><p>0,0015</p><p>0,0018</p><p>100,00</p><p>103,33</p><p>100,00</p><p>100,00</p><p>103,33</p><p>102,59</p><p>101,76</p><p>98,39</p><p>102,19</p><p>100,71</p><p>0,00</p><p>3.33</p><p>0,00</p><p>0,00</p><p>3.33</p><p>2,59</p><p>1,76</p><p>1,61</p><p>2.19</p><p>0,71</p><p>2,93</p><p>3,63</p><p>28.260</p><p>4.661Amido</p><p>12.941</p><p>28.993</p><p>4.428</p><p>0</p><p>3</p><p>101,43</p><p>100,00</p><p>97,07</p><p>96,37</p><p>1,43</p><p>0,00PGA</p><p>s</p><p>d</p><p>a</p><p>c</p><p>e</p><p>r</p><p>d</p><p>T</p><p>p</p><p>u</p><p>c</p><p>a</p><p>g</p><p>q</p><p>á</p><p>h</p><p>c</p><p>a</p><p>r</p><p>U</p><p>p</p><p>a</p><p>d</p><p>0,030</p><p>0,070</p><p>11.330</p><p>25.923</p><p>0,029</p><p>0,068</p><p>0,0055</p><p>0,0064</p><p>11.70</p><p>26.82</p><p>* Desvio padrão.</p><p>ão considerados aplicáveis para medição quantitativa dentro da faixa</p><p>e concentrações usadas neste estudo; ou seja, concentrações de</p><p>çúcar de 0,01–0,7 g/L. A linearidade das equações de calibração de</p><p>oncentração de açúcar e teor de carbono são fornecidas em Tabelas 1</p><p>3, respectivamente. O observadoR2valores (R2≥0,983 eR2≥0,988,</p><p>espectivamente) são considerados altos para o propósito pretendido</p><p>o método. A exatidão e a precisão do novo método são relatadas em</p><p>abela 4. A precisão do método foi testada em termos de erro relativo</p><p>ercentual (eu)e recuperação percentual (r),que foram calculados</p><p>sando Eqs.(4)e(5), respectivamente. Em geral, o novo método pode ser</p><p>onsiderado preciso em até 3,6%. O desvio padrão (precisão) das</p><p>mostras de validação replicadas é relatado emTabela 4, que</p><p>eralmente é baixo, indicando medição de alta precisão. Note que</p><p>uanto menor o DP, melhor a precisão.</p><p>O teste de interferência mostrou que a absorbância UV de BSA e</p><p>cido cinâmico é reduzida, mas não completamente eliminada após</p><p>idrólise por reação com ácido sulfúrico concentrado.</p><p>Portanto,</p><p>onclui-se que o método proposto não é apropriado para amostras que</p><p>bsorvem na faixa UV sem qualquer pré-tratamento. Como precaução,</p><p>ecomenda-se que antes de usar o método proposto Ácido Sulfúrico-</p><p>V, as amostras sejam pré-triadas para testar se têm absorbância UV.</p><p>A redução da absorbância UV após a hidrólise sugere que é possível que</p><p>equenas quantidades de impurezas de proteína/flavonoides possam ser</p><p>dmissíveis, se sua absorbância UV for reduzida abaixo do limite de</p><p>etecção. O nível admissível de absorbância UV de não tratado</p><p>0,0102</p><p>0,0110</p><p>3.27</p><p>3,47</p><p>96,67</p><p>97,14</p><p>103,27</p><p>103,47</p><p>3.33</p><p>2,86</p><p>as amostras devem ser estabelecidas por meio de análise sistemática de uma</p><p>ampla gama de proteínas e flavonoides misturados com carboidratos em</p><p>concentrações e proporções variadas.</p><p>4. Conclusão</p><p>O método proposto Ácido Sulfúrico–UV representa uma grande</p><p>melhoria na caracterização de carboidratos amplamente utilizada pelo</p><p>método Fenol–Ácido Sulfúrico. As vantagens do método proposto estão</p><p>ligadas à eliminação do fenol para coloração visível dos derivados de</p><p>furfural e, em vez disso, à capitalização do potencial de absorção de UV</p><p>do furfural. Essa modificação não apenas evita os riscos à saúde e ao</p><p>meio ambiente do uso de fenol, mas também reduz o erro de medição</p><p>em até metade, reduzindo significativamente o tempo de medição.</p><p>Portanto, podemos concluir que o método proposto Ácido Sulfúrico–UV</p><p>é adequado para análises mais seguras e de alto rendimento de</p><p>diversos carboidratos em aplicações industriais e de pesquisa. No</p><p>entanto, o método Ácido Sulfúrico–UV não deve ser usado para</p><p>amostras que tenham absorbância de UV antes do tratamento, pois</p><p>isso pode indicar possível interferência por impurezas de proteína e/ou</p><p>flavonoides.</p><p>Agradecimentos</p><p>Os autores agradecem a revisão útil do manuscrito por Matthew</p><p>Meyer. Este trabalho foi apoiado por</p><p>2 s de ca</p><p>U</p><p>r</p><p>M</p><p>A</p><p>e</p><p>j</p><p>R</p><p>A</p><p>A</p><p>P</p><p>P</p><p>B</p><p>C</p><p>C</p><p>C</p><p>C</p><p>C</p><p>P</p><p>P</p><p>P</p><p>D</p><p>P</p><p>I</p><p>F</p><p>F</p><p>F</p><p>G</p><p>G</p><p>P</p><p>P</p><p>60 AA Albalasmeh et al. / Polímero</p><p>SDA-NIFA-AFRI, número do prêmio: 2010-65107-20484. A AAB</p><p>econhece o apoio do fundo de startups para novos professores da UC</p><p>erced.</p><p>pêndice A. Dados suplementares</p><p>Dados complementares associados a este artigo podem ser</p><p>ncontrados, na versão online, emPortuguês http://dx.doi.org/10.1016/</p><p>.carbpol.2013.04.072.</p><p>eferências</p><p>l-Sheraji, SH, Ismail, A., Manap, MY, Mustafa, S., Yusof, RM, & Hassan, F.</p><p>A. 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	A new method for rapid determination of carbohydrate and total carbon concentrations using UV spectrophotometry
	1 Introduction
	2 Materials and methods
	2.1 Reagents and apparatus
	2.2 Analytical methods
	2.2.1 Phenol–Sulfuric Acid method
	2.2.2 Sulfuric Acid–UV method
	2.2.3 Total carbon analysis
	2.3 Interaction time
	2.4 Method validation
	2.5 Statistical analysis
	3 Results and discussion
	3.1 Absorption spectra
	3.2 Effects of reaction time
	3.3 Measurement of carbohydrate concentrations
	3.4 Measurement of total carbon content
	3.5 Method validation
	4 Conclusion
	Acknowledgements
	Appendix A Supplementary data
	Appendix B Supplementary Data