5_Imunoensaios utilizando conjugados-compactado

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<p>Imunoensaios utilizando</p><p>conjugados</p><p>Imunologia Clínica</p><p>Profa Elisa Flávia Bailão</p><p>Universidade Estadual de Goiás</p><p>UnUCET</p><p>IMUNOENSAIOS UTILIZANDO CONJUGADOS</p><p>¢ A interação Ag-Ac nem sempre é evidenciada por um</p><p>fenômeno visível;</p><p>¢ Conjugados: moléculas ligadas covalentemente aos</p><p>compostos ligantes;</p><p>¢ As moléculas conjugadas mantêm as propriedades</p><p>funcionais de ambas;</p><p>¢ As técnicas podem diferir quanto:</p><p>¢ Ligante ou marcador;</p><p>¢ Sistema de revelação do ligante;</p><p>¢ Molécula conjugada ao ligante;</p><p>¢ Meio onde ocorre o ensaio imunológico.</p><p>IMUNOENSAIOS UTILIZANDO CONJUGADOS</p><p>¢ A molécula conjugada pode ser uma proteína,</p><p>antígenos, imunoglobulinas ou haptenos;</p><p>¢ Os testes podem ser realizados em fase sólida</p><p>(sistema heterogêneo) ou em meio líquido</p><p>(sistema homogêneo).</p><p>IMUNOENSAIOS UTILIZANDO CONJUGADOS</p><p>¢ Ligantes e sistemas de revelação ou medida:</p><p>¢ Radioisótopos;</p><p>¢ Fluorocromos;</p><p>¢ Substâncias luminescentes biológicas ou químicas;</p><p>¢ Enzimas com substratos cromogênicos;</p><p>¢ Enzimas com substratos fluorigênicos;</p><p>¢ Enzimas com substratos luminescentes.</p><p>IMUNOFLUORESCÊNCIA</p><p>¢ São empregados conjugados constituídos de</p><p>anticorpos ou antígenos ligados covalentemente a</p><p>moléculas reveladoras denominadas fluorocromos;</p><p>¢ Equipamentos com detector de fluorescência podem</p><p>medir a emissão de luz em variados comprimentos</p><p>de onda.</p><p>IMUNOFLUORESCÊNCIA</p><p>¢ Fluoroimunoensaio : ant ígeno ou ant i -</p><p>imunoglobulina marcados para a pesquisa de</p><p>anticorpos na amostra;</p><p>¢ Imunofluorimetria: anticorpo marcado para a</p><p>pesquisa e dosagem de moléculas antigênicas na</p><p>amostra;</p><p>¢ Testes de imunofluorescência: antígenos</p><p>particulados que devem ser visualizados por</p><p>microscopia.</p><p>IMUNOFLUORESCÊNCIA</p><p>¢ Direta: detecção do antígeno diretamente em</p><p>células ou tecidos, utilizando um anticorpo específico</p><p>marcado com fluorocromo;</p><p>¢ Limitação: necessidade de um conjugado para cada</p><p>antígeno;</p><p>IMUNOFLUORESCÊNCIA</p><p>¢  Indireta: utiliza um</p><p>anti-anticorpo marcado</p><p>para a detecção de um</p><p>anticorpo que se fixou a</p><p>antígenos;</p><p>¢ Vantagem?</p><p>RADIOIMUNOENSAIO (RIA)</p><p>¢ É capaz de detectar e quantificar substâncias</p><p>presentes em amostras com limite de detecção da</p><p>ordem de picogramas;</p><p>¢ Ensaio com antígeno marcado do tipo competitivo;</p><p>¢ O 125I é comumente empregado à liga-se facilmente</p><p>a resíduos de tirosina das proteínas;</p><p>¢ A quantificação do componente pesquisado é</p><p>determinada pela contagem do material radioativo</p><p>presente na reação.</p><p>RADIOIMUNOENSAIO (RIA)</p><p>ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS</p><p>¢ Permitem medidas quantitativas diretas da</p><p>interação antígeno-anticorpo por medida de</p><p>atividade enzimática sobre um substrato;</p><p>¢ Comparável sensibilidade ao RIA;</p><p>¢ A enzima utilizada neste ensaio deve apresentar:</p><p>¢ Elevada atividade específica;</p><p>¢ Facilidade de obtenção na forma purificada;</p><p>¢ Conjugação fácil a Ag, Ac ou haptenos;</p><p>¢ Produto da reação de fácil quantificação;</p><p>¢ Estabilidade e custo acessível.</p><p>ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS</p><p>¢ Os substratos cromogênicos devem ser estáveis,</p><p>atóxicos, de baixo custo e produzir uma substância</p><p>solúvel de cor mensurável;</p><p>¢ Ensaios homogêneos: não apresenta etapas de</p><p>lavagem;</p><p>¢ Ensaios heterogêneos: são necessárias etapas de</p><p>lavagem que retiram os componentes não-ligados e</p><p>uma fase sólida na qual vão sendo fixados os</p><p>componentes que participam da interação.</p><p>ELISA</p><p>¢ Imobilização de um dos componentes, antígeno ou</p><p>anticorpo, em fase sólida, e na utilização de um</p><p>conjugado, que também pode ser antígeno ou</p><p>imunoglobulina, ligado a uma enzima;</p><p>¢ O substrato da enzima forma um produto colorido à</p><p>a a l t e r a ç ã o d e c o r é m o n i t o r a d a p o r</p><p>espectrofotometria;</p><p>¢ Apresenta elevada sensibilidade e especificidade;</p><p>¢ Rapidez e baixo custo;</p><p>¢ Objetividade de leitura;</p><p>¢ Pode ser automatizada.</p><p>ELISA</p><p>¢ Fase sólida ou suporte: poliestireno.</p><p>ELISA</p><p>¢ Leitora de microplacas do tipo ELISA:</p><p>ELISA</p><p>¢ Amostra: soro ou plasma;</p><p>¢ Deve ser límpida, sem hemólise e não-lipêmica;</p><p>¢ Pode ser conservada até sete dias entre 2 e 8 oC;</p><p>¢ Bloqueio: utilização de proteína para bloquear os</p><p>sítios reativos remanescentes na fase sólida após a</p><p>adsorção da molécula (Ag ou Ac);</p><p>¢ Diluente da amostra: deve conter componentes</p><p>que reduzam a adsorção inespecífica de componentes</p><p>da amostra ao suporte sólido;</p><p>¢ Solução de lavagem: isotônica, pH ~ 7,0, contendo</p><p>pequena concentração de detergente não iônico.</p><p>ELISA</p><p>¢ Conjugado: duas moléculas covalentemente ligadas</p><p>que preservam suas funções originais;</p><p>¢ Proteína A conjugada com peroxidase: liga-se à</p><p>região Fc da IgG humana à produto colorido;</p><p>¢ Streptavidina-peroxidase: liga-se à biotina;</p><p>¢ Anti-IgG conjugada a corante coloidal: formação de</p><p>manchas coloridas na fase sólida.</p><p>ELISA</p><p>¢ Substrato cromogênico: são moléculas que sob</p><p>ação enzimática originam produtos coloridos,</p><p>s o l ú v e i s o u n ã o à q u a n t i f i c a ç ã o p o r</p><p>espectrofotometria ou pela intensidade de cor visual;</p><p>ELISA - RESULTADO</p><p>¢ Cut off: limite de reatividade da amostra que</p><p>permite diferenciar amostras positivas daquelas</p><p>negativas;</p><p>¢ Método proporcional: Razão entre os valores da</p><p>amostra e um valor médio de um grupo de amostras</p><p>de indivíduos não-doentes (grupo controle);</p><p>¢ Curva de unidade padrão: os valores obtidos são</p><p>transformados em unidades que fornecem uma</p><p>escala contínua proporcional à quantidade de</p><p>anticorpo presente na amostra.</p><p>ELISA</p><p>Amostra</p><p>ELISA</p><p>¢ Sistema avidina-biotina: amplificação do sinal;</p><p>IMMUNOBLOT OU WESTERN BLOTTING</p><p>¢ Eletroforese: aplicação de um campo elétrico;</p><p>IMMUNOBLOT OU WESTERN BLOTTING</p><p>¢ Eletrotransferência: proteínas migram para uma</p><p>membrana;</p><p>IMMUNOBLOT OU WESTERN BLOTTING</p><p>¢ Immunoblot: ensaio imunoenzimático realizado na</p><p>superfície da membrana;</p><p>IMMUNOBLOT OU WESTERN BLOTTING</p><p>¢ Immunoblot: ensaio imunoenzimático realizado na</p><p>superfície da membrana;</p><p>TESTES RÁPIDOS (REMOTOS)</p><p>Ac anti-Ag pesquisado conjugado à</p><p>corante</p><p>Ac anti-Ag pesquisado imobilizado</p><p>Ac anti-Ig humana</p><p>TESTES RÁPIDOS (REMOTOS)</p><p>TESTES RÁPIDOS (REMOTOS)</p><p>Reagente Não Reagente</p><p>Inválido</p><p>TESTES RÁPIDOS (REMOTOS)</p><p>DÚVIDAS???</p>