Isolamento de fungos cap 2

Prévia do material em texto

<p>DST ALFENAS, A.C., MAFIA, R.6. (eds) METODOS EM FITOPATOLOGIA EDITORA UFU. 2007. CAPÍTULO 2 Isolamento de Fungos Fitopatogênicos Acelino Couto Alfenas Francisco Alves Ferreira Reginaldo Gonçalves Mafia Rivadalve Coelho Gonçalves 1 Introdução isolamento de fungos consiste na sua obtenção em cul- tura pura a partir de tecidos doentes do hospedeiro, solo ou substrato. A obten- ção do patógeno em cultura pura é essencial para se ter o organismo disponível para estudos de morfologia, taxonomia, reprodução e fisiologia, bem como em testes de patogenicidade, resistência genética de plantas e sensibilidade a fungicidas. É importante ressaltar, ainda, que o isolamento é requerido pela se- gunda e quarta regras do postulado de Koch. As operações de isolamento são executadas sob rigorosa assepsia, em ambiente próprio, usando-se ferramentas e material desinfestados ou esterilizados. A obtenção de um organismo em cultura pura não significa que ele seja agente causal da doença. Para provar que dado organismo é o agente causal de uma doença, é essencial seguir rigorosamente as seguintes regras do postula- do de Koch: a) Associação constante do organismo com a doença. b) Isolamento do organismo em cultura pura. c) Inoculação da cultura isolada em plantas sadias, reprodução dos sintomas e sinais típicos da doença. d) Reisolamento do mesmo organismo inoculado.</p><p>54 Alfenas, Ferreira, Mafia e Gonçalves Isolamento de fungos fitopatogênicos 55 Para parasitas biotróficos (obrigatórios), via de regra não-cultiváveis, o esporos são produzidos em cavidades picnidiais ou periteciais, elas serão expos- organismo é inoculado com inóculo obtido do próprio hospedeiro. tas por meio de cortes sob lupa, de onde o fungo é transferido assepticamente Vários meios de cultura podem ser usados, dependendo das exigências para o meio. nutricionais do organismo (Capítulo 1). Os meios Batata-Dextrose-Agar (BDA) e Extrato de (EMA) são rotineiramente utilizados nos laboratórios de Tecido vegetal infectado fitopatologia, por serem relativamente de baixo custo, de fácil preparo e possibi- litarem o crescimento da maioria dos fungos cultiváveis. O organismo é cultivado em placas de Petri contendo o meio de cultura e, após o seu crescimento, repica- do para tubos com meio BDA inclinado, para ser armazenado e utilizado quan- Papel-filtro do necessário. umedecido 2 Métodos Básicos de Isolamento Figura 2.1 Câmara úmida preconizada a partir de A placa de Petri ou B bandeja ou gerbox com tampa translúcida + algodão ou papel- Diferentes técnicas de isolamento são usadas, conforme a natureza do ór- filtro umedecido. gão doente, o substrato e o estádio de desenvolvimento do patógeno (vegetativo ou reprodutivo), bem como a critério do operador. Todavia, os métodos básicos Vantagens do isolamento direto de isolamento são o direto e o indireto. a) Permite obter o organismo puro, isento de contaminações de microrganismos saprófitas associados ao tecido infectado. 2.1 Isolamento direto b) Permite saber exatamente qual organismo está sendo transferido para o meio. isolamento direto consiste na transferência, com o auxílio de um estilete, c) Permite estabelecer comparações entre as estruturas do organismo formadas de estruturas do patógeno (esporos, hifas, rizomorfos, escleródios) diretamente na superfície do hospedeiro e em cultura. do órgão infectado ou outro de substrato para o meio de cultura. Quando a pretensão é trabalhar com esporos, mas estes não estão presentes na amostra, Material necessário pode-se estimular a esporulação do fungo, mantendo o material em câmara úmida (por um a três dias) a 25 A exposição do material à luz contínua, em câmara a) Microscópio estereoscópico (lupa). úmida, é geralmente recomendável para favorecer a esporulação. Essa câmara b) Estilete. úmida pode ser feita de várias maneiras, mas a mais comum é o uso de placas de Petri ou bandejas envoltas por saco plástico transparente, com pelo menos a c) Lamparina com álcool. tampa translúcida, contendo papel-filtro ou algodão embebido em água (Figura d) Placas de Petri com BDA. 2.1). De modo geral, conseguem-se bons resultados com essa prática, expressos e) Tubos de ensaio com BDA inclinado. da seguinte maneira: a) Produção de conidióforos e conídios livres nos Procedimento (ver Figura 2.2) b) Produção de picnídios e acérvulos nos com cirros conidiais nos ápices dessas a) Focalize as estruturas do patógeno em lupa. c) Produção de peritécios nos ascomicetos, havendo, em alguns casos, acúmulo b) Flambe o estilete. de ascósporos exsudados nos ápices dessas estruturas. c) Resfrie a ponta do estilete, tocando-a levemente no meio de cultura. A estrutura fúngica formada na superfície do hospedeiro deve ser visualizada d) Transfira estruturas visualizadas para uma placa com o meio de cultura. Colo- à lupa estereoscópica e, com o auxílio de um estilete flambado, é transferida que uma estrutura no centro e três ao redor dela, aproximadamente assepticamente para placas ou tubos contendo o meio de cultura. Quando os</p><p>56 Alfenas, Ferreira, Mafia e Gonçalves Isolamento de fungos fitopatogênicos 57 e) Incube até o aparecimento da colônia desejada. e) Placas de Petri com BDA. f) Repique essa colônia para tubos com BDA inclinado. f) Tubos de ensaio com BDA inclinado. 2.2 Isolamento indireto Procedimento (ver Figura 2.3) A técnica de isolamento indireto consiste na transferência, para o meio a) Selecione áreas de transição entre o tecido infectado e o sadio e, com o auxí- de cultura, de porções infectadas de tecido do hospedeiro ou amostras de solo e lio de um escalpelo ou lâmina de barbear previamente flambados, remova a sementes infestadas. Os métodos de isolamento indireto variam com o tipo de porção superficial do tecido, expondo as camadas infectadas mais profundas. órgão ou tecido infectado (órgãos lenhosos ou carnosos, não-lenhosos ou não- b) Com o escalpelo ou a lâmina de barbear flambados novamente, corte peque- carnosos) ou substrato de onde organismo é recuperado. Em muitos casos, o nos fragmentos de tecido infectado e, com auxílio de uma patógeno está dentro dos tecidos da planta sem produzir frutificações na superfí- pinça ou estilete, plante-os em placas com o meio de cultura. Posicione um cie do órgão lesionado. A superfície dos tecidos mortos é invadida por outros fragmento no centro e três outros em torno do primeiro, mais ou menos organismos saprófitas (fungos e bactérias), o que dificulta a obtenção do patógeno eqüidistantes. em cultura pura. Para evitar a incidência de contaminantes, o isolamento deve c) Mantenha as placas em incubadora a 25 °C. A temperatura ótima de cresci- ser feito, sempre que possível, a partir de material onde o mento varia com a espécie do patógeno isolada, mas a maioria dos fungos patógeno se encontra em crescimento ativo nos tecidos e há menos saprófitas cresce na faixa de 20 a 30 °C. invasores. Empregam-se, também, métodos especiais de isolamento conforme a natureza do órgão infectado, visando reduzir ou eliminar completamente os d) Repique a cultura do organismo para tubos com BDA inclinado. contaminantes superficiais. 2.2.2 Isolamento de fungos dos tecidos de órgãos não-lenhosos ou não- 2.2.1 Isolamento de fungos dos tecidos de órgãos lenhosos ou carnosos carnosos (folhas, ramos finos, radicelas) (tronco, raízes, galhos grossos e frutos) Os organismos saprófitas na superfície do órgão lesionado são elimina- Quando os tecidos são lenhosos ou carnosos e o patógeno atinge as dos pela desinfestação superficial dos fragmentos de tecido em solução camadas de células mais profundas, a incidência de contaminantes superficiais é desinfestante, geralmente hipoclorito de sódio ou de cálcio a 1.000 ppm (0,1%) evitada pela remoção dos tecidos expostos e transferência de apenas fragmentos de ou água oxigenada 5%. patógeno, que se encontra no interior dos tissulares mais internos, retirados das margens da lesão, para o meio de cultura. tecidos, não é afetado pelo desinfestante, a menos que o tempo de desinfestação A exposição dos tecidos dos quais o patógeno é isolado é feita com o auxílio de seja excessivamente longo. um escalpelo ou lâmina de barbear previamente flambados, tendo-se o cuidado de não tocar com a ferramenta cortante na região do tecido recém-exposto. Pe- Material necessário quenos fragmentos do tecido recém-descoberto são cortados nas margens da lesão e assepticamente plantados em meio de cultura, com o uso de uma pinça a) Placas de Petri estéreis. ou b) Lamparina com álcool. c) Pinça. Material necessário d) Papel-filtro ou papel "Yes". a) Copo com álcool e) Detergente b) Lamparina com f) Solução aquosa de álcool c) Escalpelo ou lâmina de barbear. g) Solução desinfestante (hipoclorito de sódio ou de cálcio a 1.000 ppm (0,1%) d) Estilete ou pinça. de Cl, substituído por solução de água sanitária Qboa ou Super Globo, ou</p><p>58 Alfenas, Ferreira, Mafia e Gonçalves Isolamento de fungos fitopatogênicos 59 água oxigenada 5%). No caso de usar água sanitária, fazer sua diluição para a concentração desejada de cloro ativo h) Placas de Petri com BDA. Flambagem i) Tubos de ensaio com BDA inclinado. B Procedimento (ver Figura 2.4) Estrutura focalizada a) Lave o material infectado cuidadosamente com água e detergente. b) Enxugue-o com papel-filtro ou papel "Yes". A Resfriamento do estilete no meio de cultura c) Com o auxílio de escalpelo ou lâmina de barbear previamente flambados, C retire fragmentos tissulares das margens da lesão e os transfira para uma solu- ção aquosa de álcool 70%, onde permanecerão por cerca de 30 a 60 S. O álcool, além de funcionar como desinfestante, tem a propriedade de reduzir a tensão superficial do tecido, facilitando a ação da solução desinfestante pro- priamente dita. D d) Transfira os fragmentos de tecido para a solução desinfestante (hipoclorito de sódio ou de cálcio a 1.000 ppm (0,1%) de Cl2 ou água oxigenada 5%), man- tendo-os imersos na solução. Vários deles devem ser desinfestados simultane- Transferência da estrutura amente, de tal modo que a sua permanência na solução possa variar num focalizada para o período de tempo suficiente para eliminar os contaminantes. Em geral, 1 min meio de cultura é o bastante para eliminar os contaminantes superficiais sem afetar o patógeno no interior dos tecidos. Visualização da estrutura e) Com o auxílio de uma pinça flambada, remova os fragmentos da solução fúngica sob lupa desinfestante e elimine o excesso de desinfestante, tocando os fragmentos ligeiramente no papel-filtro ou papel "Yes". f) Plante, eqüidistantemente, três ou quatro fragmentos por placa contendo o Repicagem para tubo meio de cultura - geralmente, um no centro e três na periferia da placa. g) Mantenha as placas em incubadora a 25 °C até o crescimento do organismo. Colônia do patógeno h) Repique a colônia desejada para tubos com BDA inclinado. F E Incubação a 25 °C Figura 2.2 - Representação esquemática do isolamento de um fungo a partir de suas estruturas produzidas sobre a lesão.</p><p>60 Alfenas, Ferreira, Mafia e Gonçalves Isolamento de fungos fitopatogênicos 61 Lesão em caule Flambagem Exposição da área de tecido para o isolamento Folha infectada Flambagem Corte dos fragmentos Flambagem de tecido às margens da lesão Tecido exposto e corte de Flambagem Remoção dos fragmentos fragmentos tissulares Álcool 70% Solução de Remoção do excesso Plantio dos fragmentos hipoclorito 0,1% Cl2 de desinfetante em no meio de cultura papel-filtro Plantio dos fragmentos no meio de cultura Repicagem para tubo Repicagem para tubo Colônia de patógeno Colônia do patógeno Incubação a 25 °C Figura 2.4 - Representação esquemática do isolamento de um fungo de tecido Incubação a 25 °C de folha. Figura 2.3 Representação esquemática do isolamento de um fungo de tecido lenhoso. 3 Métodos Especiais de Isolamento 3.1 Isolamento de fungos de crescimento lento Um dos grandes problemas no isolamento de fungos de crescimento len- to é a competição que ocorre por contaminantes, cujo crescimento mais rápido suprime o do organismo que se quer isolar. Uma das estratégias usadas é fazer o</p><p>62 Alfenas, Ferreira, Mafia e Gonçalves Isolamento de fungos fitopatogênicos 63 isolamento monospórico, qual pode ser realizado a partir de cirros conidiais, f) Espalhe, uniformemente, a suspensão de esporos em meio ágar-água. ou de ascósporos ejetados e, ou, em meio seletivo a partir de tecidos infectados. g) Mantenha as placas em incubadora a °C e visualize os esporos germina- dos ao microscópio, em intervalos de 6, 12 ou 24 h. 3.1.1 Isolamento a partir de cirros h) Corte, com o auxílio de um estilete de ponta bem fina, uma porção do meio contendo o esporo e o transfira, assepticamente, para placas ou tubos de Os fungos anamórficos, como Phaeophleospora epicoccoides ensaio com meio de cultura (BDA ou MEA). (= Phaeoseptoria eucalypti = Kirramyces epicoccoides) de eucalipto, P. eugeniae de pitangueira e Septoria spp. hospedeiros, exsudam massa de esporos i) Deixe incubar à temperatura ótima de crescimento. na forma de cirros ou cordões, a partir de seus conidiomas. Em espécies de crescimento lento, bons resultados podem ser obtidos mediante o isolamento 3.1.2 Isolamento a partir de ascósporos e basidiósporos ejetados monospórico a partir de conídios pré-germinados em meio ágar-água e posterior repicagem para um meio rico ou seletivo, que contenha os nutrientes e fatores de Alguns ascomicetos, como Mycosphaerella musicola (sigatoca-amarela crescimento essenciais ao seu desenvolvimento. cultivo monospórico é funda- da bananeira), Mycosphaerella figiensis (sigatoca-negra da bananeira) e mental em estudos de genética clássica e genética molecular. Mycosphaerella spp. (mancha de Mycosphaerella em eucalipto), possuem ejeção ativa de ascósporos a partir de seus ascomas; basidiomicetos, como Thanathephorus cucumeris, entre outros, ejetam basidiósporos. Culturas Material necessário monospóricas desses fungos podem ser obtidas como descrito a seguir. a) Folhas de eucalipto com lesões de epicoccoides. Material necessário b) Gerbox ou placas de Petri para fazer câmara úmida. c) Papel-filtro, algodão ou similar. a) Folhas lesionadas de bananeira com sigatoca-amarela ou sigatoca-negra (Fi- d) Detergente. gura 2.5 A) ou folhas de eucalipto contendo ascomas e ascósporos de Mycosphaerella spp. (Figura 2.5 B-D) ou himênio de T cucumeris. e) Hipoclorito (HCIO) de sódio ou de cálcio a 1.000 ppm (0,1%). b) Gerbox ou placas de Petri para fazer câmara úmida. f) Água destilada e esterilizada. c) Papel-filtro, papel "germ test", algodão ou similar. g) Placas de Petri com meio ágar-água. d) Água destilada e esterilizada. h) Placas de Petri com meio rico ou meio seletivo. e) Placas de Petri com meio ágar-água. Procedimento f) Placas de Petri com BDA. a) Lave as folhas lesionadas com detergente em água de torneira. Procedimento b) Desinfeste as folhas lavadas com hipoclorito (HCIO) de sódio ou de cálcio a a) Colete, no campo, folhas lesionadas e deixe-as secar ao ar. 1.000 ppm (0,1%), por 30 S. b) Corte pedaços de lesões de aproximadamente 2 contendo peritécios c) Remova o excesso de desinfestante, mediante lavagem das folhas em água maduros. Deposite esses pedaços sobre um disco de papel-filtro de 9 cm de destilada e esterilizada, e mantenha as folhas desinfestadas em câmara úmida diâmetro, mantido em uma placa de Petri, e os umedeça com água destilada sobre balcão do laboratório ou em incubadora a 25 °C, sob fotoperíodo de 12 e esterilizada, mantendo-os umedecidos por cerca de 15 min. umedecimento das lesões contendo ascoma estimula a ejeção de ascósporos. d) Observe, diariamente, as folhas até que ocorra a exsudação dos cirros. c) Remova o excesso de água e coloque o disco de papel-filtro em uma tampa e) Prepare uma suspensão de esporos bem diluída em água esterilizada (aproxi- de placa de Petri invertida contendo ágar-água, a cerca de 0,5 cm da superfí- madamente 1 X esporos/mL). cie das lesões (Figura 2.6 A). É importante a inversão da placa para evitar</p><p>64 Alfenas, Ferreira, Mafia e Gonçalves Isolamento de fungos fitopatogênicos 65 contaminantes, pois apenas ascósporos ou basidiósporos com ejeção ativa atingirão a superfície do meio (Figura d) Após o conjunto permanecer por algumas horas (1 a 12 h) sobre o balcão do laboratório ou em incubadora a os ascósporos ou basidiósporos serão ejetados sobre a superfície do ágar. e) Remova os pedaços de folhas lesionadas e mantenha as placas a por cerca de 12 h, até que os ascósporos ou basidiósporos germinem. f) Para M. musicola e M. figiensis, há produção de um tubo germinativo de cada lado do ascósporo que, inicialmente, cresce sem se ramificar (Figura 2.6 B). Essa característica permite separar os esporos de Mycosphaerella dos de ou- tros fungos. g) Observe, ao microscópio, os ascósporos ou basidiósporos germinados pelo fundo da placa e, com uma caneta própria, circule a área que contenha o esporo germinado (Figuras 2.6 e 2.7). h) Corte, sob a lupa (80 a pedaços do meio contendo ascósporos germi- nados individualizados e transfira-os, assepticamente, para tubos ou placas A com BDA. i) Incube a por cerca de 10 dias até surgirem colônias acinzentadas. Even- tuais colônias de rápido crescimento (contaminantes) devem ser descartadas. 3.1.3 Isolamento em meio seletivo a partir de tecidos infectados Alguns patógenos, como Phytophthora infestans ou P. capsici, podem ser isolados em meio seletivo ("corn meal-ágar") a partir de tecidos infectados, como pimentão (P. capsici) e tomate ou batata (P. infestans). isolamento é feito indi- retamente, como descrito no item 2.2, exceto o fato de que os pedaços de teci- dos retirados das margens da lesão são plantados em meio seletivo de "corn meal-ágar", cuja composição se encontra descrita na Tabela 2.2. B 3.1.4 Sanduíche de cenoura para isolamento de Ceratocystis fimbriata Ceratocystis fimbriata é um importante patógeno que infecta vários hos- Figura 2.5 Sintomas típicos de mal-de-sigatoca em folhas de bananeira (A) e pedeiros, como espécies de Coffea, Collocassia, Crotalaria, Eucalyptus, Gmelina, manchas foliares em Eucalyptus, causadas por Mycosphaerella Hevea, Ipomoea, Mangifera, Platanus, Populus e Prunus, entre outras, causando suberosa, (B) contendo ascoma (C) e ascósporos (D) do fungo. murcha, descoloração dos tecidos internos do caule e morte da planta. Seu iso- lamento é mais facilmente conseguido pelo método de isca de cenoura. méto- do se aplica também para C. cacaofunesta (= C. fimbriata), que causa o mal-do- em cacaueiro.</p><p>66 Alfenas, Ferreira, Mafia e Gonçalves Isolamento de fungos fitopatogênicos 67 Ejeção de Pedaço Papel-filtro folha com himênio ascósporo de folha presa à tampa do gerbox A Placa de Petri Invertida placa com ágar 2% papel umedecido A 2 B 20um Figura 2.6 Esquema de descarga ativa de ascósporos de Mycosphaerella spp. a partir de ascomas em folhas lesionadas (A) e ascósporos germi- nados (B). B Fonte: Johanson, 1997. Figura 2.7 Obtenção de culturas monobasidiospóricas de Thanathephorus cucumeris (teleoformo de Rhizoctonia solani): A Esquema para Material necessário a ejeção de basidiósporos; B Germinação de basidiósporos em meio ágar 2% (isolado RH-3). Notar esporídio originado de germi- a) Amostras do caule infectado. nação repetitiva (seta 1) e fusão de esporos (seta 2); e C- Culturas b) monobasidiospóricas. c) Gerbox. d) Fita crepe ou similar. Procedimento e) Papel-filtro ou "germ test" para confecção de câmara úmida. a) Prepare cavacos finos 1 a 2 mm de espessura) de caule infectado. f) Água destilada e esterilizada. b) Prepare discos de cenoura previamente lavada e enxuta. g) Placas ou tubos com BDA. c) Faça "sanduíche" de tecidos infectados com discos de cenoura e envolva-os com fita crepe ou similar, ou una-os por meio de um alfinete. d) Incube as amostras em gerbox ou saco plástico a 25 °C, ou à temperatura ambiente de laboratório, por cerca de uma semana</p><p>68 Alfenas, Ferreira, Mafia e Gonçalves Isolamento de fungos fitopatogênicos 69 e) Observe, diariamente, as amostras a partir do quinto dia de incubação. Quan- te, em água corrente. A seguir, elas deverão ser desinfestadas superficialmente do a cenoura se ligeiramente apodrecida e de cor cinza, visualize, à com hipoclorito de sódio ou de cálcio a 1.000 ppm (0,1%) de Cl2 ou água oxige- lupa, peritécios (ascomas ou picnídios) de C. fimbriata, os quais são negros, nada 5%, durante certo tempo, previamente determinado por experimentação longos e contêm, no ápice, uma massa de esporos. (testes de vários tempos, como 1, 2, 4, 6, 12 e 30 min). f) Repique, com auxílio de um estilete de ponta fina, a massa de esporos para placas ou tubos com BDA. Material necessário g) Incube a até a formação de colônias. odor de banana que emana das a) Amostras de sementes. culturas é uma das características marcantes do fungo. b) Gerbox ou placas de Petri. 3.2 Isolamento de fungos de sementes c) Papel de germinação ("germ test"). d) Pisseta com água esterilizada. As perdas de produtividade em muitas culturas agronômicas pela inci- e) Placas de Petri com BDA. dência de patógenos, que matam as sementes após o plantio no campo podem ser muito significativas. Ademais, as sementes são fontes importantes de inóculo f) Tubos de ensaio com BDA inclinado. primário de muitos patógenos, o que torna o tratamento delas com fungicidas antes do plantio uma recomendação técnica rotineira. No campo florestal, a perda Procedimento de sementes de essências nativas por fungos saprófitas e apodrecedores, em con- dições de armazenamento inadequadas, parece ser muito comum, por dois fatores 3.2.1 Fungos externos e internos às sementes básicos: muitas vezes, os frutos se abrem, parcial ou totalmente, no campo antes de serem colhidos, deixando as sementes expostas a contaminações; e, em vista a) Prepare a câmara úmida (gerbox contendo no fundo papel-filtro "germ test" das grandes alturas, nas quais os frutos se formam nas árvores, muitas vezes eles umedecido com água esterilizada). são coletados no chão, onde, pelas rachaduras na casca ou por suas deiscências, b) Disponha, eqüidistantemente, as sementes sobre o papel-filtro em fileiras, cujo são colonizados por vários fungos, que chegam até as sementes. Quaisquer se- número dependerá do tamanho das sementes. mentes infectadas, com esporulação no tegumento, servirão de fonte de inóculo c) Incube a 25-28 durante 5-7 para as demais quando forem manipuladas no beneficiamento e armazenamento. d) Observe, ao microscópio estereoscópico, estruturas do fungo e as transfira, Estudos ou ensaios com sementes são normalmente conduzidos num am- assepticamente, para o meio, conforme mostrado na Figura 2.2. biente de temperatura e umidade altamente favoráveis aos fungos saprófitas. A incidência desses microrganismos nas sementes mascaram os resultados dos en- saios, uma vez que não se sabe se a causa da não-germinação da(s) semente(s) 3.2.2 Fungos internos às sementes foi algum impedimento fisiológico ou a incidência do(s) fungo(s). a) Lave as sementes com água e sabão. Se o fungo a ser isolado estiver simplesmente aderido à superfície das sementes, basta executar o isolamento direto, ou seja, observa-se a semente afe- b) Proceda à desinfestação, imergindo as sementes em solução desinfestante tada sob a binocular estereoscópica, transferindo-se quaisquer estruturas fúngicas (hipoclorito de sódio ou de cálcio a 1.000 ppm (0,1%) de Cl, ou água oxige- nada 5%) por um tempo mínimo necessário para eliminação dos para meio de cultura, com o auxílio de estilete, cuja ponta tenha sido previa- mente flambada e resfriada no meio de cultura, conforme visto no item 2.1. contaminantes. Esse tempo pode variar de acordo com o tipo de tegumento da semente, mas, em geral, um minuto é suficiente para matar os contaminantes Outra alternativa consiste no preparo de uma suspensão de esporos, pela agita- superficiais. ção das sementes em pequena quantidade de água destilada e esterilizada. A seguir, faz-se o plaqueamento dessa suspensão em meio de cultura. Quando se c) as sementes em água esterilizada e seque-as em papel-toalha ou objetivar o isolamento de patógenos no interior das sementes, deve-se lavá-las, papel-filtro esterilizado. esfregando-as manualmente com água e sabão, e enxaguá-las, prolongadamen- d) Proceda como descrito em 3.2.1 (itens a-d).</p><p>70 Alfenas, Ferreira, Mafia e Gonçalves Isolamento de fungos fitopatogênicos 71 3.3 Isolamento de fungos do solo colônias de bactérias e fungos que vivem saprofiticamente no solo. Para evitar a ocorrência de tais organismos, ao meio de cultura são incorpo- isolamento de fungos do solo pode ser feito pelo método de isca ou rados antibióticos e fungicidas seletivos, que inibem, respectivamente, cresci- plaqueamento de amostras de solo em meio seletivo. mento de bactérias e fungos indesejáveis. Dependendo do organismo, o solo método de isca consiste na inserção de porções vegetais isentas de pode ser submetido a um tratamento prévio (aquecimento, peneiramento etc.) contaminantes no solo infestado. Vários tipos de iscas podem ser empregados, para garantir o isolamento do organismo desejado. que vai depender do organismo que se deseja isolar. É fundamental que a isca Nos tópicos subseqüentes são descritos os métodos de isolamento de seja isenta do patógeno-alvo. Por isso, recomenda-se empregar o devido contro- alguns dos principais patógenos do solo, causadores de várias doenças em cultu- le (solo autoclavado + isca), a fim de se certificar da ausência do fungo na isca ras agronômicas, hortícolas e florestais. antes do contato desta com a amostra de solo infestada. A eficiência do método depende da capacidade de competição saprofítica do patógeno. 3.3.1 Método de isca qualitativo para Cylindrocladium spp. Há vários exemplos de iscas: Espécies de Cylindrocladium causam várias doenças em espécies agronô- Para Cylindrocladium spp.: folhas de mamoneira, de azaléia, de gerânio e de micas e florestais, como tombamento de mudas, podridão de estacas a enraizar eucalipto, sementes de alfafa-do-nordeste e segmentos (20 5 mm) de ramos e manchas foliares. Sua detecção no solo ou substrato infestado pode ser feita de eucalipto são recomendados. pelo uso de iscas vegetais, como sementes de alfafa, folhas de mamoneira ou de Para Rhizoctonia solani: segmentos (20 X 5 mm) de ramos de eucalipto, de folhas ou segmentos de ramos de eucalipto. Em vista da sua simplicida- haste de feijoeiro e de pínus e tubérculos de batata e beterraba podem ser de, esse método de isca é o mais usado em trabalhos de rotina, objetivando-se a empregados. Todavia, tubérculos de batata e beterraba estão, detecção de Cylindrocladium spp. no solo. Geralmente, este método não permi- te quantificar a população do patógeno no solo. Todavia, trabalhos desenvolvi- sujeitos à contaminação por bactérias. dos no Laboratório de Patologia Florestal da UFV/MG por Gonçalves et al. (2001) Para Ceratocystis fimbriata: segmentos de cenoura constituem a melhor isca e Sanfuentes et al. (2002) demonstraram a possibilidade de estimar o nível para recuperar patógeno do solo. populacional de C. candelabrum e R. solani no solo e em substratos de Para Botrytis cinerea: folhas tenras e brotações de eucalipto e pétalas de flores enraizamento com iscas de segmentos de ramos de eucalipto (item 3.3.3). sadias, como rosa e espirradeira, são colocadas sobre solo. Para Pythium sp. e Phytophthora sp.: pode-se empregar maçã como isca. Material necessário Para isso, uma porção de solo é colocada no orifício de uma maçã e, após a colonização, porções de tecido colonizado são transferidas para o meio de a) Solo infestado. cultura (BDA, MEA ou meal-ágar). b) Placas de Petri esterilizadas ou gerbox desinfestados. O patógeno passa do solo para a isca, de onde é isolado pelo método c) Sementes de alfafa-do-nordeste (Stylosanthes guianensis), isentas de direto (item 2.1), quando há esporulação, ou pelo método indireto (item 2.2), contaminantes, ou folhas de mamoneira, folhas ou segmentos de ramos de quando não há esporulação, conforme previamente descrito. eucalipto (3 0,5 cm). O método de isca pode ser qualitativo ou qualiquantitativo. No primeiro d) Água destilada esterilizada. caso, só é possível detectar patógeno, enquanto no segundo há a possibilidade de detectar e estimar a densidade de inóculo no solo, conforme descrito nos itens Procedimento subseqüentes (3.3.1 e 3.3.2), para Cylindrocladium spp. e Rhizoctonia spp., respectivamente. a) Coloque amostras de solo em placas de Petri ou gerbox pela metade) esterilizadas. plaqueamento do solo em meio seletivo pode ser feito por plaqueamento direto de uma amostra de solo por diluição em série (10-1 a ou peneiramento b) Umedeça solo com água destilada esterilizada suficiente para efetuar a e plaqueamento. Esses métodos têm inconveniente de resultar em numerosas semeadura (80% da capacidade de campo).</p><p>72 Alfenas, Ferreira, Mafia e Gonçalves Isolamento de fungos fitopatogênicos 73 c) Semeie alfafa-do-nordeste ou coloque sobre o solo folhas de mamoneira ou de eucalipto com pequenos orifícios, obtidos com um fura-rolhas de 4 mm de diâmetro, ou segmentos de ramos de eucalipto. d) Mantenha as placas em incubadora a 25 °C ou no balcão do laboratório até o aparecimento de frutificações de Cylindrocladium spp. (+ 5-8 dias) nas has- tes das plântulas ou nas folhas de mamoneira ou nas folhas ou segmentos de ramos de eucalipto (Figura 2.8). e) Proceda ao isolamento direto do patógeno, como no item 2.1. Figura 2.9 Ramificação típica de hifas de Rhizoctonia sp., em ângulo reto, e constrição (seta) da hifa próxima do primeiro septo. Material necessário a) Solo b) Placas de Petri esterilizadas ou gerbox desinfestado. Figura 2.8 Métodos de isca para detecção e isolamento de Cylindrocladium c) Segmentos de ramos ou caule cm) de espécies hospedeiras (eucalipto, spp. do solo ou substrato: A Folhas de mamoneira; B Segmentos batata etc.) ou cubos (1 X 1 cm) de tubérculos de batata ou de beterraba. de haste de eucalipto; e C Colônias puras do fungo. d) Água destilada e esterilizada. e) Hipoclorito de sódio ou de cálcio a 1.000 ppm (0,1%) de 3.3.2 Método de isca qualitativo para Rhizoctonia spp. Procedimento Espécies de Rhizoctonia causam doenças em plantas de interesses agro- nômico ou florestal, como tombamento de mudas e queimas foliares, bem como a) Coloque amostras de solo em placas de Petri ou gerbox. mela e podridão de estacas de eucalipto na fase de enraizamento. Normalmente, b) Umedeça com água destilada esterilizada até 80% da capacidade de campo, espécies de Rhizoctonia não produzem esporos e se multiplicam, tipicamente, aproximadamente. por fragmentação de hifas. A ramificação de hifas em ângulo reto e a sua constrição na altura do septo, visualizada ao microscópio (Figura 2.9), constituem caracte- c) No solo, contido em gerbox ou placa de Petri, insira 30 segmentos de ramos rísticas marcantes desses fungos. Seu isolamento a partir do solo ou substrato de eucalipto desinfestados com hipoclorito de sódio ou de cálcio (água sani- pode ser feito por meio de iscas vegetais, como segmento de ramos de eucalipto, tária) a 1.000 ppm (0,1%) de ou pedaços de tubérculos de batata ou pedaços de batata, beterraba etc. beterraba. Tendo em vista que tubérculos de batata ou beterraba são mais</p><p>74 Alfenas, Ferreira, Mafia e Gonçalves Isolamento de fungos fitopatogênicos 75 sujeitos à contaminação bacteriana, segmentos de ramos de eucalipto são Material necessário preferidos. a) Cinco amostras de solo infestadas com quantidades conhecidas e crescentes d) Incube a 25 °C durante 48 de propágulos de Cylindrocladium candelabrum e Rhizoctonia solani. e) Lave os segmentos de eucalipto com água destilada, desinfeste-os em b) Segmentos de ramos de eucalipto como isca e sementes ou estacas/miniestacas hipoclorito de sódio ou de cálcio (água sanitária) 1.000 ppm (0,1%) de Cl2 e de semeie-os em meio ágar-água ou BDA. c) Pisseta com água destilada esterilizada, gerbox, pinça e lamparina com álcool. f) Incube a 25 °C por 12-24 h. d) Placas com ágar-água e rolopac. g) Observe o crescimento e repique a cultura pura para tubos com meio inclina- do e deixe em incubação (Figura 2.10). e) Hipocloreto de sódio ou de cálcio a 1.000 ppm (0,1%) de cloro ativo. f) Papel adsorvente. Procedimento a) Umedeça o solo até 80% de sua capacidade de campo e distribua 100 g de solo em cada gerbox. b) Para cada concentração de inóculo, separe três gerboxes para iscas e três para C mudinhas de eucalipto. Na metade das amostras, avalie a atividade saprofítica do fungo, colocando 30 iscas por gerbox, e na outra metade avalie a quanti- dade de enfermidade (tombamento), colocando 30 mudinhas por caixa. Figura 2.10 Métodos de isca para detecção e isolamento de Rhizoctonia sp. do c) Coloque as caixas a 25 °C com 12 h de fotoperíodo. solo ou substrato em segmentos de tubérculos de batata, raiz de beterraba e de haste de eucalipto: A Diferentes tipos de isca; B d) Após 48 h de incubação, recolha as iscas, lave-as em água de torneira, Colônias em que se originam da isca; e C Colônia desinfeste-as com hipocloreto de sódio ou de cálcio a 1.000 ppm (0,1%) de pura em BDA. cloro ativo/3 min, passe em água destilada esterilizada, seque com papel ab- sorvente e coloque-as em placas de Petri com ágar-água. 3.3.3 Método de isca qualiquantitativo para Cylindrocladium spp. e d) Coloque as placas em incubadora a 25 °C por 48 h e fotoperíodo de 12 h, a 6 Rhizoctonia spp. mmol de aproximadamente. e) Conte o número de iscas colonizadas pelo patógeno e o número de plantas uso de iscas vegetais para estimar a população de fungos no solo mortas por ele. possibilita estabelecer a correlação entre nível de inóculo e atividade saprofítica do patógeno, o que, por sua vez, pode-se correlacionar mais apropriadamen- f) Analise, estatisticamente, os dados e construa um gráfico para cada patógeno, te com a intensidade de doença. Os métodos clássicos de quantificação de como exemplificado nas Figuras 2.11 e 2.12. inóculo no solo, por intermédio de meio seletivo, favorecem a germinação de qualquer propágulo do patógeno presente no solo (esporos, hifas, clamidósporos, escleródios), pois os livra da competição. método de isca não distingue qual propágulo está presente no solo, mas indica a quantidade de propágulos com capacidade de germinar e infectar o hospedeiro, sendo portanto, de grande importância prática. Neste item descreve-se a quantificação de inóculo de Cylindrocladium spp. e Rhizoctonia spp., dois importantes patógenos de solo.</p><p>76 Alfenas, Ferreira, Mafia e Gonçalves Isolamento de fungos fitopatogênicos 77 100 3.3.4 Peneiramento e plaqueamento de solo ou substrato para isolamento de Cylindrocladium spp. e 80 método descrito a seguir foi preconizado para o isolamento direto e a 60 quantificação de microescleródios de Cylindrocladium scoparium no solo (Thies e Patton, 1970), mas pode ser empregado em outras espécies de Cylindrocladium e Cylindrocladiella. A técnica de isolamento consiste na sepa- 40 ração por peneiramento e decantação dos microescleródios, baseando-se em suas dimensões, sua densidade, sua germinação e seu crescimento em meio de 20 Equação: y = 4,7253.x cultura seletivo. Esse método é de grande utilidade para estimar a população de Cylindrocladium spp. no solo, principalmente quando se visa avaliar sua 0 taxa de sobrevivência, em estudos a respeito da aplicação de fungicidas, 0 5 10 15 20 fumigantes ou agentes de biocontrole com vistas à erradicação ou supressão Microescleródios/g de substrato desse patógeno. Figura 2.11 Porcentagem de iscas de eucalipto colonizadas por Cylindrocladium Material necessário candelabrum aos cinco dias, a partir de substrato de enraizamento infestado com diferentes níveis de inóculo (microescleródios/g de a) Amostras de solo infestadas. substrato). b) Placas de Petri. Fonte: Gonçalves et al. (2001). c) Liquidificador ou homogeneizador. d) Peneiras de 100 e 200 mesh (diâmetro do poro 149 e 74 um, respectiva- mente). 100 e) Béquer de 400 mL. f) Ágar-água 0,3%. 80 g) Meio de cultura seletivo. 60 h) Frascos de vidro esterilizados de 200 mL. i) Placas de Petri esterilizadas. 40 de Procedimento (Figura 2.13) % 20 a) Adicione 400 g de solo em um copo de liquidificador e complete com água destilada e esterilizada. 0 b) Homogeneize a suspensão em baixa rotação durante 2 min. 0 10 20 30 c) Deixe o sobrenadante em peneiras de 100 e 200 mesh. Propágulos/100 g de solo d) Adicione água ao resíduo no liquidificador e misture manualmente. Figura 2.12 - Colonização de iscas de eucalipto em amostras de solos artificial- mente infestadas com Rhizoctonia solani. e) Deixe a suspensão em repouso por 15 S e decante-a sobre as peneiras. f) Repita os itens d e e, usualmente 6 9 vezes, até obter um sobrenadante claro. Fonte: Sanfuentes et al. (2002).</p><p>78 Alfenas, Ferreira, Mafia e Gonçalves Isolamento de fungos fitopatogênicos 79 g) Lave o material coletado na peneira de 100 mesh, descarte o resíduo e colete o filtrado na peneira de 200 mesh. Deixar em repouso por sobrenadante h) Lave o material coletado na peneira de 200 mesh e colete o resíduo em um Amostra de para exame béquer de 400 mL. Essa fração é denominada "inóculo concentrado". Repetr até obter um sobrenadante i) Complete o volume do béquer com uma suspensão de ágar-água 0,3% e misture-a, durante 10 min, com o auxílio de uma "batedeira de bolo" ou Amostra de solo Completar volume similar. Amostra de solo para trazida do campo determinação umidade minutos ou viveiro j) Retire 15 mL da suspensão anterior e adicione-os a 200 mL de meio NPX fundido e parcialmente resfriado à temperatura de 45 °C; o meio NPX é cons- Sobrenadante tituído de ácido lático (suficiente para ajustar o pH = 3,5), 1.000 ppm (0,1%) de Tergitol NPX com 10,5 moles 400 de óxido de etileno) e meio Czapek contendo 2,5% de ágar fundido e parcial- Coletar fração Completar volume retida peneire de 400 mente frio 45° C). 200 de 200 mesh 0.3% de k) Examine as placas com 10 dias de incubação, conte as colônias de Agitar por 10 200 concentrado Cylindrocladium sp. e calcule a concentração de propágulos na amostra origi- nal (peso de matéria seca). As colônias de Cylindrocladium sp. são facilmente Descarter identificadas pela produção de microescleródios e esporulação típica do gê- nero. Lembre-se de que os microescleródios são estruturas de repouso ou de Incubar durante e 10 dias 28°C de sobrevivência do patógeno no solo. contar número cultura para placas de de placas de Petri de A população do patógeno no solo é estimada pela equação: + 1 Figura 2.13 Esquema de isolamento direto de espécies de Cylindrocladium do solo. 2 D (g) 3.3.5 Oomicetos (Phytophthora sp. e Pythium sp.) em que: p/g = número de propágulos de Cylindrocladium sp. por grama de solo Espécies de Phytophthora e Pythium são importantes patógenos de cultu- ras agronômicas e florestais. isolamento desses fitopatógenos pode ser a partir seco; de tecidos doentes da planta, do solo ou substrato usados para crescimento de V = volume inicial (mL) de suspensão do inóculo concentrado (letra h); plantas. São descritos, nos tópicos alguns métodos usados para = número de colônias de Cylindrocladium sp. obtidas em placas detecção e isolamento desses organismos do solo. Alguns métodos podem ser de Petri a partir de dois frascos de 200 mL contendo o meio adaptados para o isolamento de outros fungos do solo, como Rhizoctonia. NPX (letra j); e D = peso (g) da amostra de solo seco. I) Métodos de isca 1) Maçã como isca Material necessário a) Amostras de solo infestadas. b) Duas maçãs c) Água destilada esterilizada.</p><p>80 Alfenas, Ferreira, Mafia e Gonçalves Isolamento de fungos fitopatogênicos 81 d) Fura-rolhas ou escalpelo. c) Água destilada esterilizada. e) Placas de Petri estéreis. d) Placas de Petri estéreis. f) Meio corn meal-ágar ou BDA. e) BDA ou V-8. meio corn meal-ágar (Riker e Riker, 1936) pode ser adquirido pronto. Procedimento Nesse caso, basta diluir 17 g em um litro de água destilada e autoclavar ou prepará- lo conforme a receita da Tabela 2.1. a) Coloque cubos ou cilindros de batata de 0,5 cm de espessura em câmara úmida, assim como usado para Pythium spp. (Hine e Luna, 1963), trate os pedaços da batata com sulfato de estreptomicina e pimaricina a 0,01% du- Tabela 2.1 Meio corn meal-ágar rante 1 h, para inibir a contaminação de bactérias. Componente Quantidade b) Espalhe uniformemente 0,5 mL de suspensão de solo sobre cada pedaço de Ágar batata. 17 g c) Examine, após cinco dias de incubação a 20-22 as iscas quanto à presen- Corn meal 20 g ça de esporângios. Uma vez detectado o fungo-alvo, transfira-o para o meio Peptona 20 g BDA ou V-8. Dextrose (= D-glicose) 20 g Água (q.s.p.) 1.000 mL 3) Batata como isca para Pythium sp. (Hine e Luna, 1963) Fonte: Riker e Riker (1936). Pythium aphanidermatum é facilmente isolado por esta técnica. Material necessário Procedimento a) Amostras de solo infestadas. a) Faça orifícios numa maçã com auxílio de um fura-rolhas ou escalpelo b) Batata (Solanum tuberosum). flambado. c) Água destilada esterilizada. b) Preencha o orifício com solo ou substrato supostamente contaminado até d) Sulfato de estreptomicina e pimaricina. 1 cm abaixo da superfície do fruto. e) Placas de Petri estéreis. c) Umedeça o solo com água destilada. f) Ágar-água 15%. d) Sele a abertura com parafilme ou similar. e) Incube as maçãs a 25 °C por cinco dias. Procedimento f) Transfira fragmentos de tecido necrosado para o meio corn meal-ágar ou BDA. a) Utilize, nesta técnica, antibióticos para inibir bactérias. Imerja cubos de 3 mm de batata em solução aquosa de sulfato de estreptomicina a 100 ppm (0,01%) 2) Batata como isca para Phytophthora spp. (Zan, 1962) e pimaricina a 100 ppm (0,01%) por 1 h. Este método foi primeiramente desenvolvido para isolar Phytophthora b) Coloque a amostra de solo infestado em placas de Petri e umedeça o solo até infestans do solo. a capacidade de campo, aproximadamente. c) Coloque os cubos de batata sobre o solo e incube-os a 30 °C, por 12 h. Material necessário d) Retire os cubos, lave-os com água limpa de torneira e plante-os em ágar-água a) Amostras de solo infestadas. 1,5%, suplementado com 100 ppm (0,01%) de sulfato de estreptomicina e b) Batata (Solanum tuberosum). 100 ppm (0,01%) de pimaricina.</p><p>82 Alfenas, Ferreira, Mafia e Gonçalves Isolamento de fungos fitopatogênicos 83 e) Transfira a cultura para tubos com meio BDA. c) Transfira cinco pedaços de raízes finas para cada placa de Petri contendo água esterilizada. 4) Grama em água como isca para oomicetos a partir de raízes d) Ferva quatro pedaços de grama no microondas por 6 min e coloque-os na infectadas placa contendo a amostra. Esta técnica pode ser utilizada para isolar oomicetos (Phytophthora spp. e) Incube a amostra a 25 sob fotoperíodo de 12 h e intensidade luminosa e Pythium spp.) a partir de raízes infectadas, amostras de solo ou substrato de de 20 a 40 mmoles de enraizamento infestado. Para isolamento de Pythium sp., meio de cultura (Ta- f) Observe, diariamente, a presença do organismo-alvo (oomicetos ou bela 2.2) não pode conter hymexazolol, qual inibe o seu crescimento. Aplica-se Rhizoctonia). No caso de oomicetos, estes frutificarão até o terceiro dia e, no também para Rhizoctonia spp. e, nesse caso emprega-se o meio ágar-água 2%. de Rhizoctonia sp., a colônia se desenvolverá sobre a água em 12-24 h. g) Troque a água diariamente, caso haja muitos organismos Material necessário h) Observe, diariamente, as iscas ao microscópio com aumento de 10 e 20 Ao constatar organismo-alvo, repique-o para o meio seletivo corn meal- a) Raízes e amostras de solo infestadas. ágar (Tabela 2.2), no caso de oomicetos; ou de BDA ou no caso b) Grama-batatais ou similar. de Rhizoctonia sp. meio seletivo permite separar Pythium spp. de c) Água destilada esterilizada. Phytophthora spp., pois o hymexazol inibe o crescimento de Pythium spp. d) Placas de Petri estéreis. 5) Grama para Pythium sp. e Phytophthora sp., a partir de solo ou substrato e) Meio seletivo corn meal-ágar (Tabela 2.2). Este método é utilizado na detecção de espécies de Pythium e Phytophthora Tabela 2.2 Meio seletivo corn meal-ágar em solo ou substrato de enraizamento com ou sem raízes. Componente Quantidade Procedimento (Figura 2.14) Corn meal-ágar 17 g a) Coloque, em gerbox, uma amostra de substrato com raízes apodrecidas sus- Ampicilina 0,5 g peito de conter Pythium sp. ou Phytophthora sp. Pimaricina 0,01 g b) Umedeça a amostra e cubra-a com tela de náilon. PCNB 0,1 g c) Deposite amostras de grama fervida ou mudinhas de eucalipto sobre a tela. Vancomicina 0,2 g d) Tampe o gerbox e incube o material a 25 °C, sob fotoperíodo de 12 h a 6 mmol de fótons. Hymexazol) 50 mg/mL e) Após 48 h de incubação, retire a grama e observe ao microscópio Água (q.s.p.) 1.000 mL estereoscópico. Caso haja crescimento, transfira a porção de grama coloniza- Fonte: Tsao e Gui (1977). da para o meio seletivo corn meal-ágar (Tabela 2.2). f) Observe novamente ao microscópio estereoscópico as amostras de grama ou Procedimento mudinhas de eucalipto após 24 h adicionais. Caso haja micélio e frutificações típicas de Pythium sp. ou Phytophthora sp., realize o isolamento para a) Lave as raízes de uma planta supostamente infectada em água corrente de outra placa ou tubo de ensaio contendo meio corn meal-ágar ou BDA, sem torneira, procurando-se retirar o máximo de resíduos. antibióticos. Para isso, observe a amostra sob lupa e, com um estilete de pon- b) Recolha as raízes finas necrosadas em um béquer e lave-as duas vezes em ta fina e reta, flambado e frio, corte a ponta da hifa e transfira-a para o meio. água esterilizada.</p><p>84 Alfenas, Ferreira, Mafia e Gonçalves Isolamento de fungos fitopatogênicos 85 II) Plaqueamento de suspensão de solo c) Incube as amostras a 20 °C por 72-96 h. Consiste em semear uma suspensão de solo em meio seletivo (Tabela d) Após incubação, remova o solo na superfície do ágar, lavando-se, cuidado- 2.3) que permita o crescimento de Pythium spp. e Phytophthora spp. samente, a superfície do meio em água corrente de torneira. e) Incube, novamente, à mesma temperatura. Colônias típicas de Phytophthora Material necessário sp. ou Pythium sp. devem ser transferidas para o meio Kerr (Tabela 2.3). a) Amostras de solo infestadas. b) Placas de Petri c) 0,5%. d) Meio Kerr. Iscas vegetais (fragmento de grama) Tabela - Composição do meio Kerr modificado Tela de Lâmina de água Componente Quantidade Solo ou substrato Ágar 40 g Sacarose 30 g NaNO3 2 g Diagnose Isolamento Extrato de levedura 0,5 g MgSO4.7H2O 0,5 g FeSO4 0,01 g microscópica + folha de grama KH2PO4 1 g Sulfato de estreptomicina 50 mg Rosa-bengala 60 mg Meio + fragmento de folha de grama Água destilada 1.000 mL PCNB* 100 mg Mycostatin* 100 un. Água (q.s.p.) 1.000 mL Fonte: Hendrix e Kuhlman (1965). * Após a autoclavagem, adicione fungicidas mycostatin e PCNB em meio fundente (aproxima- damente a 45 imediatamente antes do uso. Antes da autoclavagem, ajuste o pH para 4,8. Procedimento Exame microscópico a) Colete amostras de solo infestadas e dilua-as a 1:10 (v/v) em ágar-água 0,5%. Figura 2.14 - Etapas da diagnose e do isolamento de oomicetos (Pythium spp. e b) Pipete 1 mL da suspensão de solo-ágar sobre a superfície do meio Kerr. Phytophthora spp.) em solo ou substrato.</p><p>86 Alfenas, Ferreira, Mafia e Gonçalves Isolamento de fungos fitopatogênicos 87 III) Peneiramento e plaqueamento Clamidósporos de Phytophthora variam em diâmetro e podem ser con- centrados em peneiras, para facilitar o isolamento em meio seletivo. Procedimento a) Passe uma amostra de 50 g de solo numa peneira de 4 mm. A b) Transfira a amostra peneirada para um liquidificador, adicione 500 mL de B C água destilada esterilizada, homogeneize por 1 min em baixa velocidade e deixe alguns minutos para decantar. Figura 2.15 Detecção e isolamento de Ceratocystis fimbriata a partir de solo ou substrato pelo método de iscas de cenoura: A Discos de cenoura colonizados com o c) Passe o sobrenadante em peneiras de 149, 61, 44 e 38 mm fungo sobre a amostra de solo; B Detalhe de peritécios com exsudação de e recolha a amostra peneirada. Os resíduos na peneira de 149 mm devem ser ascósporos; e C Colônia típica do fungo em cultura. lavados e recolhidos num béquer. d) Adicione a amostra coletada em um copo de liquidificador contendo 200 mL 4 Exercícios de água esterilizada e agite por 20 S na mesma velocidade. e) Recolha, separadamente, os resíduos de cada peneira em um béquer. Os exercícios aqui propostos visam oferecer ao estudante a oportunidade f) Plaqueie 10 mL de cada suspensão em meio seletivo contendo: de manusear e aprender a isolar fungos com características bem variadas quanto às facilidades e dificuldades de cultivo in vitro. Outras opções podem ser incluí- 4% de das, dependendo da disponibilidade de material. Alternaria solani 50 ppm (0,005%) de Nystatin. 1) Isolamento direto (item 1) de Alternaria solani de tecidos infectados de couve. 100 ppm (0,01%) de 10 ppm (0,001%) de PCNB Botrytis cinerea g) Incube as amostras a 20 por 12 h. 2) Isolamento direto (item 1) de Botrytis cinerea de frutos infectados de moran- go, flores de rosa, mudas de eucalipto e folhas de tomateiro, bagas de uva etc. h) Lave a superfície do meio em água limpa de torneira. As placas devem ser novamente mantidas a °C e avaliadas após 24 h. Ceratocysits fimbriata 3) Isolamento de Ceratocysits fimbriata pelo método de iscas (sanduíche de ce- 3.4 Isolamento de Ceratocystis fimbriata do solo noura) de tecidos infectados de eucalipto, cacaueiro, mangueira, figo, crotalária, inhame etc. Proceda como descrito no item 1.4. patógeno pode ser isolado do solo, usando-se cenoura como isca. Proceda como descrito no item 3.1.4 para isolamento do patógeno a partir de tecidos infectados, Cercospora spp. à exceção do fato de que pequena porção de amostras de solo substituirá os tecidos 4) Isolamento direto (item 1) de Cercospora spp. de folhas infectadas de beterra- da planta. Pode-se ainda inserir discos ou cilindros de cenoura no solo ou substrato. ba, cafeeiro e, ou, pimentão. Após 5 7 dias de incubação no escuro, fungo é isolado diretamente para os meios BDA ou MEA, entre outros. Para isso, a amostra é visualizada sob lupa e, quando Colletotrichum colonizada pelo fungo, adquire acinzentada (Figura 2.15). Com auxílio de um 5) Isolamentos direto (item 1) e indireto (item 2.2) de Colletotrichum estilete de ponta fina previamente flambado, transfere-se a massa de ascósporos que de folhas infectadas de oiti ou mangueira, frutos infectados exsudam no ápice peritecial (Figura 2.15 B). de jiló, berinjela, mamão, pimentão ou abacate, entre</p><p>88 Alfenas, Ferreira, Mafia e Gonçalves Isolamento de fungos fitopatogênicos 89 6) Isolamento indireto (item 2.2) de Colletotrichum lindemuthianum de folhas Pestalotiopsis sp. ou vagens infectadas de feijoeiro. 19) Isolamento indireto (item 2.2) de Pestalotiopsis de folhas infectadas de nêspera. 7) Isolamentos direto (item 1) e indireto (item 2.2) de Colletotrichum sublineolum de folhas infectadas de soja. Phaeophleospora epicoccoides 8) Isolamentos direto (item 1) e indireto (item 2.2) de Colletotrichum orbiculare 20) Isolamento monospórico de Phaeophleospora epicoccoides de folhas de folhas infectadas de chuchu. infectadas de eucalipto. Pilidiella eucalyptorum (= Coniella fragariae) Phytophthora spp. 9) Isolamentos direto (item 1) e indireto (item 2.2) de P. eucalyptorum de folhas infectadas de eucalipto. 21) Isolamento indireto (item 2.2) de Phytophthora capcici de pimentão, abobri- nha ou pepino e de P. infestans de tomate em meio seletivo corn meal-ágar Crysoporthe cubensis (= Cryphonectria cubensis) (Tabela 2.2). 10) Isolamento direto (item 1) de C. cubensis de frutificações em casca infectada de Eucalyptus. Pseudocercospora sp. 22) Isolamento direto (item 1) de Pseudocercospora de folhas infectadas de ba- Cylindrocladium sp. naneira. 11) Isolamento indireto (item 2.2) de Cylindrocladium sp. de folhas infectadas de eucalipto. Pyrenochaeta terrestris 12) Isolamentos direto (item 1) e indireto (item 2.2) de Cylindrocladium sp. de 23) Isolamento de Pyrenochaeta terrestris de tecidos infectados de cebola. estacas infectadas de eucalipto. Didymella sp. Pyricularia grisea 24) Isolamento de Pyricularia grisea de tecidos infectados de trigo e arroz. 13) Isolamento de Didymella sp. de tecidos infectados de abóbora, pepino ou melancia. Pythium sp. e Phytophthora sp. Exserohilum sp. (= Helminthosporium) 25) Isolamento de oomicetos (Pythium sp. ou Phytophthora sp.) do solo pelo 14) Isolamento direto (item 1) de Exserohilum turcicum de folhas infectadas de método de isca (grama fervida em água esterilizada) (Figura 2.13). cana ou milho. Rhizoctonia solant Fusarium spp. e Phomopsis sp. 26) Isolamentos direto (item 1) e indireto (item 2.2) de Rhizoctonia solani de 15) Isolamentos direto (item 1) e indireto (item 2.2) de Fusarium oxysporum de estacas infectadas de eucalipto. tecidos infectados de tomateiro, algodoeiro ou bananeira. 16) Isolamento direto (item 1) ou indireto (item 2.2) de Fusarium moniliforme de 27) Isolamentos direto (item 1) e indireto (item 2.2) de Rhizoctonia solani de frutos infectados de abacaxi. mudas infectadas de cafeeiro, algodoeiro, feijoeiro etc. 17) Isolamentos direto (item 1) e indireto (item 2.2) de Fusarium sp. e Phomopsis Rhizopus sp. sp. de sementes infectadas de soja. 28) Isolamento direto (item 1) de Rhizopus sp. de fruto de jaca (cuidados especi- Penicillium sp. ais devem ser tomados, pois este fungo pode contaminar outras culturas). 18) Isolamento direto (item 1) de Penicillium sp. de frutos infectados de laranja.</p>