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<p>Inserir Título Aqui</p><p>Inserir Título Aqui</p><p>Interpretação de</p><p>Exames Laboratoriais</p><p>Interpretação de Exames Imunológicos e Microbiológicos</p><p>Responsável pelo Conteúdo:</p><p>Profa. Dra. Patricia Ucelli Simioni</p><p>Revisão Textual:</p><p>Prof. Esp. Claudio Pereira do Nascimento</p><p>Nesta unidade, trabalharemos os seguintes tópicos:</p><p>• Avaliação dos resultados de métodos imunológicos de ELISA</p><p>e imunoquímicos;</p><p>• Avaliação dos resultados de métodos de precipitação e</p><p>aglutinação (floculação);</p><p>• Avaliação dos resultados de imunofluorescência;</p><p>• Avaliação dos resultados de testes rápidos;</p><p>• Caracterização morfológica e fisiológica das bactérias e</p><p>fungos de interesse clínico;</p><p>• Avaliação da susceptibilidade de microrganismos frente</p><p>aos agentes antimicrobianos, mediante o emprego de</p><p>metodologias específicas para o diagnóstico laboratorial.</p><p>Fonte: iStock/Getty Im</p><p>ages</p><p>Objetivos</p><p>• Apresentar ao farmacêutico clínico o conhecimento necessário para avaliar exames</p><p>imunológicos de ELISA, imunoquímica, testes rápidos, ensaios de precipitação e</p><p>floculação. Apresentar metodologias microbiológicas para avaliação da susceptibilidade</p><p>microbiana frente aos agentes antimicrobianos, bem como avaliação de morfologia e</p><p>fisiologia de bactérias e fungos de interesse clínico.</p><p>Caro Aluno(a)!</p><p>Normalmente, com a correria do dia a dia, não nos organizamos e deixamos para o</p><p>último momento o acesso ao estudo, o que implicará o não aprofundamento no material</p><p>trabalhado ou, ainda, a perda dos prazos para o lançamento das atividades solicitadas.</p><p>Assim, organize seus estudos de maneira que entrem na sua rotina. Por exemplo, você</p><p>poderá escolher um dia ao longo da semana ou um determinado horário todos ou alguns</p><p>dias e determinar como o seu “momento do estudo”.</p><p>No material de cada Unidade, há videoaulas e leituras indicadas, assim como sugestões</p><p>de materiais complementares, elementos didáticos que ampliarão sua interpretação e</p><p>auxiliarão o pleno entendimento dos temas abordados.</p><p>Após o contato com o conteúdo proposto, participe dos debates mediados em fóruns de</p><p>discussão, pois estes ajudarão a verificar o quanto você absorveu do conteúdo, além de</p><p>propiciar o contato com seus colegas e tutores, o que se apresenta como rico espaço de</p><p>troca de ideias e aprendizagem.</p><p>Bons Estudos!</p><p>Interpretação de Exames Imunológicos e</p><p>Microbiológicos</p><p>UNIDADE</p><p>Interpretação de Exames Imunológicos e Microbiológicos</p><p>Contextualização</p><p>Um risco para a vida: Joana, grávida de três meses, teve contato com uma menina</p><p>infectada por rubéola. Joana não referia infecção prévia e não havia realizado exame</p><p>pré-natal para a rubéola. Ela procurou imediatamente um clínico que solicitou um teste</p><p>imunológico de ELISA para diagnóstico de rubéola. O laudo apresentou o seguinte</p><p>resultados: IgM de 1,0 de absorbância e, IgG de 40 IU/mL. Após análise, foi informado</p><p>para a paciente que o resultado era compatível com infecção por rubéola e foi proposto</p><p>que a gravidez fosse interrompida devido aos riscos para o feto. A paciente procurou</p><p>outro centro de atendimento e, após duas semanas, um novo exame foi solicitado. O</p><p>resultado do novo ensaio de ELISA para anticorpos antivírus da rubéola apresentou</p><p>valores de IgM de 0,4 de absorbância e de IgG de 80 IU/ML. Com base nesse exame</p><p>de laboratório, o imunologista tranquilizou a paciente. O especialista informou que a</p><p>mesma teve contato com o vírus no passado, e possivelmente apresentou uma infecção</p><p>assintomática ou que foi confundida com outra doença. Foi informado que ela e seu filho</p><p>não corriam risco. Após uma gestação normal nasceu Elisa.</p><p>Comentário: O primeiro laudo foi interpretado de forma errônea. A primeira</p><p>imunoglobulina que apresenta elevação após um estímulo antigênico é a IgM, fato</p><p>que não ocorreu após o segundo exame. Do ponto de vista sorológico, a variação de</p><p>valores de IgG de 40 para 80 não é considerada relevante. Nos ensaios de ELISA, só</p><p>se considera significativos valores de títulos aumentados em mais de quatro vezes. A</p><p>sugestão de interrupção da gestação é crime e delito ético pelo Código de Ética Médica.</p><p>Análise de resultados:</p><p>ELISA Rubéola IgM: Resultados inferiores a 0,5 de absorbância são considerados</p><p>negativos e aqueles superiores a 1,5, considerados como resultados positivos. Esses</p><p>resultados entre 0,51 e 1,49 são considerados suspeitos e devem ser reavaliados.</p><p>ELISA Rubéola IgG: Resultados inferiores a 13,5 IU/ml são considerados negativos e</p><p>aqueles superiores a 15 UI/ml, considerados como resultados positivos. Esses resultados</p><p>entre 13,6 e 14,9 IU/ml são considerados suspeitos e devem ser reavaliados.</p><p>ELISA para IgM (Rubéola)</p><p>Absorbâncias</p><p>Negativo < 0,5</p><p>Positivo > 1,5</p><p>ELISA para IgG (Rubéola)</p><p>Concentração em UI/mL</p><p>Negativo ≤ 13,5</p><p>Positivo ≥ 15</p><p>Indeterminado 13,6 - 14,9</p><p>6</p><p>7</p><p>Exames Imunológicos e Microbiológicos</p><p>A interpretação de exames de Imunologia é de grande relevância para a área clínica e</p><p>possibilita ao farmacêutico um conhecimento diferenciado na área de avaliação de sorologias.</p><p>As análises imunológicas permitem a avaliação de resultados de ensaios de ensaio</p><p>de ELISA, testes de imunofluorescência e testes rápidos bem como de ensaios de</p><p>precipitação, que podem auxiliar no diagnóstico de doenças infecciosas, autoimunidades,</p><p>tumores, hipersensibilidades e imunodeficiências, entre outros. (CRIVELARO;</p><p>RICARDO; VICENTE, 2012; KHAN; SADRODDINY, 2016; LESSA et al., 2007;</p><p>LOOR; DUMITRAŞCU, 2016; SILVA, 2015).</p><p>Conceitos importantes: sensibilidade e especificidade em</p><p>imunologia</p><p>A alta sensibilidade e a alta especificidade em um ensaio são de extrema relevância para</p><p>a imunologia. A sensibilidade de um método define a capacidade de detectar baixas</p><p>quantidades de antígeno ou de anticorpo. Quanto mais sensível, maior a capacidade de</p><p>detectar menores concentrações de antígeno ou do anticorpo. Uma alta sensibilidade</p><p>permite uma redução de resultados falso-negativos. Já a especificidade diz respeito à</p><p>capacidade do método de localizar especificamente o antígeno ou o anticorpo. Uma alta</p><p>especificidade reduz o número de resultados falso-positivos. Quanto mais específico um</p><p>método, menor a chance de reações cruzadas, ou seja, de um anticorpo anti-A se ligar com</p><p>o determinante antigênico (ou epitopo) B ao invés de se ligar ao determinante antigênico</p><p>A (DAY, 2015).</p><p>ELISA e ensaios imunoquímicos</p><p>O ensaio de ELISA, descrito como “Enzyme-linked immunosorbant assay”, ou,</p><p>em português, ensaio do imunoabsorvente ligado à enzima, é um teste imunológico</p><p>que permite a detecção das reações antígeno-anticorpo. Para tanto, devemos buscar a</p><p>presença do antígeno ou do anticorpo em fluidos biológicos (DAY, 2015).</p><p>Esse ensaio ainda é um dos principais métodos de diagnóstico sorológico aplicados</p><p>na clínica, por possuir alta sensibilidade e especificidade. O ensaio de ELISA pode ser</p><p>aplicado para diversas áreas da sorologia, para detecção de antígenos ou anticorpos.</p><p>Dentre essas áreas, podemos citar:</p><p>· Diagnóstico de hipersensibilidades e alergias (HAMILTON, 2004; PINTO et</p><p>al., 2015; TURNBULL; ADAMS; GORARD, 2014) .</p><p>· Diagnóstico de infecções virais como vírus da herpes, HIV, vírus da febre</p><p>amarela, dengue vírus, vírus Epstein-Barr, rotavírus, vírus da hepatite e</p><p>citomegalovírus, entre outros (FLETCHER et al., 2016; PRIYANKA; PATIL;</p><p>DWARAKANATH, 2016; VICTER et al., 2016)</p><p>7</p><p>UNIDADE</p><p>Interpretação de Exames Imunológicos e Microbiológicos</p><p>· Diagnóstico de infecções parasitárias, como toxoplasmose, malária,</p><p>leishmaniose (KOBETS; GREKOV; LIPOLDOVA, 2012; MODOLELL et al.,</p><p>2009).</p><p>· Diagnóstico de infecções bacteriana, como salmonelose, tuberculose</p><p>botulismo, enterites, sífilis e outras (CRIVELARO; RICARDO; VICENTE,</p><p>2012; SILVA, 2000).</p><p>· Diagnóstico de infecções sexualmente transmissíveis como sífilis, tricomoníase,</p><p>infecções por clamídia (YUAN et al., 2015) (KARABAEV et al., 2017).</p><p>· Diagnóstico de portadores de imunodeficiências congênitas ou adquiridas</p><p>(COSTA, 2015).</p><p>· Diagnóstico de antígenos e marcadores tumorais (KHAN; SADRODDINY,</p><p>2016; KIM et al., 2012).</p><p>· Determinação de níveis de hormônios.</p><p>· Avaliação e acompanhamento da eficácia terapêutica de tratamentos.</p><p>Trata-se de um método eficiente, pois permite detectar quantidades de antígeno</p><p>da ordem de picogramas (10-12 g). No método de ELISA, o antígeno é adsorvido a</p><p>uma placa de poliestireno (Figura 1). Em seguida, tem prosseguimento as etapas de</p><p>incubação e lavagem, para remoção de excesso de antígeno não ligado na placa. A</p><p>adição de anticorpos que reconhecem um antígeno alvo e estão ligados com uma enzima</p><p>permitirá a formação de complexos antígenos-anticorpos nos poços. Se o material for</p><p>positivo, o complexo antígeno-anticorpo-enzima irá se formar e a enzima catalisará a</p><p>reação. A enzima reage com um substrato incolor para produzir um produto colorido.</p><p>A presença de produto colorido indica a presença de antígeno ou anticorpo ligado na</p><p>placa (MURPHY, 2014).</p><p>Figura 1: Placa de ELISA com resultado positivo.</p><p>Fonte: iStock/Getty Images</p><p>O ELISA pode ser revelado pelo método direto ou indireto (Figura 2). No primeiro,</p><p>a enzima encontra-se ligada diretamente ao anticorpo, enquanto no indireto, a enzima</p><p>apresenta-se ligada a um anti-anticorpo. Usualmente, utiliza-se o método indireto, pela</p><p>8</p><p>9</p><p>facilidade de aquisição de kits de detecção por ELISA indireto no mercado. Ainda, o</p><p>método de ELISA apresenta variações em sua aplicação e desenvolvimento, podendo ser</p><p>empregado para a detecção de antígenos ou anticorpos no soro de pacientes (ABBAS et</p><p>al., 2015; MURPHY, 2014; YOKOMIZO; YUGI; MERKAL, 1985).</p><p>ELISA indireta ELISA direta</p><p>Figura 2: Descrição do método de ELISA indireto e direto</p><p>Interpretação de resultados de ELISA</p><p>Em geral, os ensaios de ELISA para avaliação de anticorpos específicos nas amostras</p><p>determinam o seguinte padrão de resposta:</p><p>· Resultados de IgM, IgA, IgG negativo indicam a ausência de imunidade, ou</p><p>seja, a ausência de resposta imune específica do paciente para o antígeno.</p><p>Nesse caso, pode-se inferir que o material é negativo, ou seja, a amostra não</p><p>apresenta os anticorpos pesquisados.</p><p>· Quando o resultado apresenta IgG negativo e IgM (ou IgA) positivo, indica</p><p>a presença de resposta recente para o antígeno pesquisado. Em caso de</p><p>infecção, indica infecção aguda, ou seja, a amostra apresenta os anticorpos</p><p>pesquisados.</p><p>· A presença de IgG com resultado positivo e de IgA e IgM com resultado</p><p>negativo indica memória imunológica ou imunidade pós-infecciosa.</p><p>· A presença de IgG, IgM, IgA pode ser indicativo de infecção recente,</p><p>exacerbação de doenças crônicas ou a reativação de doenças infecciosas</p><p>(ABBAS et al., 2015; MURPHY, 2014; PATEL et al., 2016).</p><p>Exemplo de interpretação de resultado de exame de toxoplasmose:</p><p>IgM negativo (não reagente) com IgG positivo (reagente): infecção passada, com</p><p>há mais de 1 ano, podendo ter ocorrido de forma assintomática.</p><p>IgM negativo (não reagente) com IgG negativo (não reagente): ausência de</p><p>contato prévio com o T. gondii ou infecção muito recente, com poucos dias, quando a</p><p>resposta imunológica ainda não está detectável.</p><p>9</p><p>UNIDADE</p><p>Interpretação de Exames Imunológicos e Microbiológicos</p><p>IgM positivo (ou reagente) com IgG negativo (não reagente): possibilidade de</p><p>infecção aguda em fase inicial. Nesse caso, a IgG ainda não está positiva, por ser início</p><p>da resposta imune. Este resultado deve ser analisado com cautela devido ao risco de falso</p><p>positivo. É indicado realizar um novo exame após 2 semanas do primeiro. A repetição</p><p>do resultado confirma um resultado falso positivo para IgM. Em caso de conversão de</p><p>positividade de IgG, confirma-se infecção aguda e recente.</p><p>IgM positivo (reagente) e IgG positivo (reagente): indicativo de infecção recente</p><p>ou reativação de infecção, cujo resultado deve ser confirmado com ensaio para avaliação</p><p>de avidez de IgG(CARDOSO FONSECA et al., 2016; ELIZABETH; JORGE ENRIQUE,</p><p>2016; NEONATAL, 2015).</p><p>Testes de Aglutinação e Hemaglutinação</p><p>Alguns antígenos particulados podem reagir com anticorpos formando uma reação</p><p>de aglutinação, ou agrupamento de partículas. Nesse contexto, o termo aglutinina é</p><p>utilizado para descrever a imunoglobulina, enquanto os antígenos são denominados</p><p>aglutinogênios. Se o antígeno particulado for um eritrócito, a reação é denominada</p><p>hemaglutinação. Os anticorpos da classe ou isotipo IgM são melhores aglutininas, por</p><p>possuírem 10 valências, ou seja, por serem formados por 5 moléculas de anticorpos</p><p>associadas, cada qual com dois sítios de ligação com o antígeno. Entre os testes de</p><p>aglutinação usuais estão tipagem sanguínea, Fator reumatoide (FR), proteína C reativa,</p><p>(PCR), teste de Coombs, toxoplasmose e teste de VDRL (Venereal Disease Research</p><p>Laboratory) (ABBAS et al., 2015; ALMEIDA NETO, 2008; BHATTACHARYA et al.,</p><p>2015; BIBBINS-DOMINGO et al., 2016; JANEWAY et al., 2008).</p><p>Interpretação de resultados de ensaios de aglutinação</p><p>O ensaio de aglutinação resulta na formação de uma rede de moléculas de anticorpos</p><p>ligados com antígenos partículas, ou partículas de látex ou eritrócitos recobertos com</p><p>antígenos. Existem variações de ensaios de aglutinação, denominada aglutinação passiva.</p><p>Nesses ensaios eritrócitos ou partículas de látex são recobertos com antígeno solúvel de</p><p>interesse, como uma proteína de um parasita ou vírus (ex. antígeno viral, polissacarídeo</p><p>ou hapteno) para posterior desenvolvimento da reação de detecção de anticorpos na</p><p>amostra (ABBAS et al., 2015; ALMEIDA NETO, 2008; BIBBINS-DOMINGO et al.,</p><p>2016; KUMAR; ABBAS; ASTER, 2015; MURPHY; WEAVER, 2016).</p><p>Os ensaios de aglutinação produzem resultados que são qualitativos ou semi-</p><p>quantitativos. Os ensaios qualitativos geram resultados que qualificam a presença ou</p><p>a ausência de um antígeno ou anticorpos. O teste de hemaglutinação, em geral é</p><p>um ensaio semi-quantitativos, que gera resultados baseados em títulos de anticorpos.</p><p>Esse tipo de ensaios é aplicado para quantificar anticorpos específicos em amostras</p><p>biológicas. Neste teste, é realizada uma diluição seriada da amostra testada. Em seguida,</p><p>adiciona-se um número fixo de eritrócitos, bactérias, partículas de látex recobertas</p><p>com antígeno de interesse ou outro antígeno particulado. A visualização da reação de</p><p>aglutinação permite determinar a diluição máxima que ainda permite aglutinação visível,</p><p>10</p><p>11</p><p>que é denominada título. O titulo é descrito como o inverso da diluição máxima que</p><p>gera aglutinação visível (FIGURA 3) (ABBAS et al., 2015; KUMAR; ABBAS; ASTER,</p><p>2015; MURPHY et al., 2009).</p><p>Interpretação de resultados</p><p>Nos ensaios de aglutinação, pode-se ter um resultado falso negativo, denominado</p><p>efeito prozona. O efeito prozona é observado quando a concentração dos anticorpos na</p><p>amostra está muito elevada. Isso impede a formação de rede de coagulação e, embora</p><p>ocorra a ligação do antígeno com o anticorpo, não é possível visualizar a reação. Isso</p><p>ocorre devido ao excesso de imunoglobulinas, resultando em complexos antígeno-</p><p>anticorpo muito pequenos, os quais se aglomeram para formar uma reação visível.</p><p>(CLEINMAN, ISABELA B; MARY, 2014; FERREIRA, 2013; MURPHY, 2014)</p><p>Figura 3 - Ensaios de aglutinação - Placa de aglutinação</p><p>Fonte: iStock/Getty Images</p><p>No teste de Coombs é possível detectar a presença de anticorpos não aglutinadores</p><p>nos eritrócitos. Para isso, utiliza-se um segundo anticorpo específico para os anticorpos,</p><p>que está ligado a hemácias, o qual irá realizar uma reação antígeno-anticorpo e gerar</p><p>aglutinação (ABBAS et al., 2015; KUMAR; ABBAS; ASTER, 2015; VIZZONI;</p><p>MEDEIROS DA SILVA, 2015).</p><p>O teste de Coombs Indireto também é utilizado para detectar anticorpos não</p><p>aglutinadores. Esse ensaio é aplicado para detectar anticorpos anti-fator Rhesus(Rh).</p><p>Nesse ensaio, as hemácias são incubadas com a amostra e lavadas para remoção de</p><p>anticorpos não ligados. A reação cruzada decorre da ligação de um segundo anticorpo</p><p>anti-imunoglobulina. O teste de Coombs Indireto é utilizado para determinar se a mãe</p><p>possui anticorpos anti-Rh. (ABBAS et al., 2015; KUMAR; ABBAS; ASTER, 2015;</p><p>VIZZONI; MEDEIROS DA SILVA, 2015)..</p><p>No teste de Coombs direto, é possível determinar se um recém-nascido possui</p><p>anticorpos anti-Rh. Imunoglobulinas anti–Rh em geral não são boas aglutininas. Nesse</p><p>ensaio, as hemácias da criança são recobertas com anticorpos anti-Rh. Já o ensaio de</p><p>inibição de hemaglutinação permite avaliar a habilidade de um antígeno solúvel de inibir</p><p>11</p><p>UNIDADE</p><p>Interpretação de Exames Imunológicos e Microbiológicos</p><p>a aglutinação, por meio da competição com hemácias recobertas por antígenos, pela</p><p>ligação a moléculas de anticorpos. O antígeno solúvel irá competir com o antígeno que</p><p>recobre o eritrócito pela ligação com os anticorpos, inibindo dessa forma a aglutinação</p><p>(ABBAS et al., 2015; KUMAR; ABBAS; ASTER, 2015; VIZZONI; MEDEIROS DA</p><p>SILVA, 2015).</p><p>Testes de precipitação</p><p>Embora pouco aplicado na área de diagnóstico na atualidade, o teste de precipitação é ainda</p><p>utilizado na prática clínica como é o caso do ensaio de imune eletroforese, descrita abaixo.</p><p>Esses testes são aplicados em laboratórios clínicos para a determinação dos níveis</p><p>de anticorpos em amostras de pacientes. No ensaio de precipitação denominado</p><p>imunodifusão radial (Mancini), o anticorpo é incorporado no gel de Agar. Em seguida,</p><p>diluições do antígeno são aplicadas em orifícios no agar. A zona de equivalência é a</p><p>região do gel onde quantidade equimolares do antígeno e anticorpo se encontram e</p><p>formam um halo de precipitação. Pelo diâmetro do anel é possível avaliar a concentração</p><p>de antígeno É possível quantificar o antígeno pela comparação com uma curva padrão</p><p>(AZEVEDO, 2015; ELIAS; MISSO; YAMAGATA, 2014)</p><p>Interpretação de resultados</p><p>Na imunoeletroforese, ocorre a adição de soro ou amostras complexas ao gel de Agar.</p><p>Em seguida, o gel é submetido a uma corrente elétrica, para corrida eletroforética e as</p><p>proteínas são separadas de acordo com a carga elétrica. O gel é cortado para formação</p><p>de um sulco e adiciona-se o antissoro. Com a reação de antígeno e anticorpo ocorre</p><p>formação de linhas de precipitação, a região ou zona de equivalência, cujo resultado é</p><p>positivo (ABBAS et al., 2015; ANDRADE, 2014; AZEVEDO, 2015; MURPHY, 2014).</p><p>Ensaios de imunofluorescência</p><p>Os ensaios de imunofluorescência são aplicados em laboratórios clínicos para avaliação de</p><p>antígenos de interesse em populações celulares específicas. Esse ensaio se baseia no método</p><p>de imunofluorescência direta ou indireta. Nesses ensaios, as células de amostras biológicas</p><p>são marcadas com um anticorpo acoplado a um marcador fluorescente e em seguida são</p><p>analisadas por citometria de fluxo. No citômetro de fluxo, o laser possibilita a medição</p><p>de tamanho e granulosidade das células, bem como a luz fluorescente emitida pode ser</p><p>medida por um ou mais detectores (LUOPAJÄRVI et al., 2012; ZAYNAGETDINOV et al., 2013).</p><p>Interpretação de resultados</p><p>Os resultados são avaliados por meio de histograma ou dot plot, onde se tem eixos</p><p>indicativos do aumento da fluorescência e do número de células. Para avaliação do</p><p>12</p><p>13</p><p>resultado, a proporção de células fluorescentes é determinada pela integração da área</p><p>sob a curva. Ainda, é possível a avaliação de mais de um parâmetro, com o uso de mais</p><p>de um marcador fluorescente. (BACALL, 2009; CARVALHO; GIRALDO; AMARAL,</p><p>2012; TAVARES; TAVARES, 2009).</p><p>Confira os gráficos de resultados de ensaios de citometria: histograma (https://goo.gl/</p><p>RRNtay) e dotplot (https://goo.gl/eNmehy)</p><p>Testes rápidos</p><p>Testes rápidos são ensaios de fácil execução, sem necessidade de estrutura</p><p>laboratorial, e cuja execução e interpretação dos resultados tomam um máximo de 30</p><p>minutos. Esses são uma ferramenta de grande aplicação para diagnóstico de doenças</p><p>infectocontagiosas, devido aos agravos relevantes à saúde publica. Esses permitem um</p><p>resultado rápido para início de tratamento, com relevante sensibilidade e especificidade.</p><p>Em geral, testes rápidos podem ser realizados com amostra de soro, plasma, sangue</p><p>total por punção venosa ou digital, ou com amostras de fluido oral (TELELAB, 2017).</p><p>Os tipos mais frequentes de testes rápidos são por imunocromatografia de fluxo lateral,</p><p>imunocromatografia de dupla migração, dispositivos de imunoconcentração ou por meio</p><p>de fase sólida (Figura 4) (GILKS CF, CROWLEY S, EKPINI R, GOVE S, PERRIENS J, SOUTEYRAND</p><p>Y, 2006; HÄNSCHEID; REBELO; GROBUSCH, 2014; RAO et al., 2012)</p><p>Figura 4 - Testes rápidos. 1a - imunocromatografia de fluxo lateral, 1b - imunocromatografia de dupla migração,</p><p>1c - dispositivos de imunoconcentração, 1d - fase sólida</p><p>Fonte: telelab.aids.gov.br</p><p>Interpretação de resultados</p><p>Resultado reagente ou positivo é quando ocorre formação de duas linhas coloridas,</p><p>uma linha na área de teste (T) e outra linha na área de controle (C).</p><p>13</p><p>UNIDADE</p><p>Interpretação de Exames Imunológicos e Microbiológicos</p><p>O ensaio não reagente ou negativo é indicado pela ausência de linha na faixa do teste (T)</p><p>O resultado será inválido quando não ocorrer formação de linha na área de controle</p><p>(C). (HÄNSCHEID; REBELO; GROBUSCH, 2014; LAGO, 2016; TELELAB, 2017)</p><p>Exemplo de resultado de teste rápido para HIV-1 e HIV-2</p><p>Reagente para HIV-1: Formação de linha na área indicada para HIV-1 e na área de</p><p>controle (C).</p><p>Reagente para HIV-2: Formação de linha na área indicada para HIV-2 e na área de</p><p>controle (C).</p><p>Não reagente: Formação de linha na área de controle (C).</p><p>Inválido: Não ocorre formação de linha na área de controle (C).(TELELAB, 2017).</p><p>Considerações finais sobre métodos</p><p>imunológicos</p><p>O conhecimento aprofundado do princípio dos métodos imunológicos permite ao</p><p>farmacêutico clínico a avaliação correta dos resultados dos ensaios. Como a reação</p><p>antígeno-anticorpo, em geral, não é visível, é necessário detectar direta ou indiretamente</p><p>os complexos formados entre o antígeno e o anticorpo ou revelar essas reações</p><p>(MAHLER et al., 2016; MAYORGA et al., 2013; MURO; SUGIURA; AKIYAMA, 2013)</p><p>Caracterização morfológica e fisiológica</p><p>das bactérias e fungos de interesse clínico</p><p>Para uma análise adequada, as amostras devem ser obtidas antes do início da terapia com</p><p>antibióticos. O local de coleta de amostra para busca dos microrganismos deve ser limpo</p><p>com soro fisiológico e a coleta deve ser realizada de acordo com especificações adequadas</p><p>para cada sítio. As amostras devem ser colocadas em frascos estéreis com registro de dados</p><p>clínicos da coleta, como sítio, data e hora(ANDRIOLO et al., 2014).</p><p>Métodos de Coloração para identificação de bactérias e fungos</p><p>Corantes básicos derivados de anilina como azul de metileno, cristal vileta, fucsina básica</p><p>são aplicados em coloração bacteriana, como coloração de Gram e de Ziehl-Neelsen. Já o</p><p>hidróxido de potássio (KOH) é um método de clareamento aplicado para pesquisa de fungos</p><p>filamentosos ou leveduriformes (BRASIL, 2004; GASPAR et al., 2004; TRUANT, 2016).</p><p>14</p><p>15</p><p>Identificação de bactérias</p><p>Método de Gram</p><p>Essa coloração diferencial, considerada rápida e de baixo custo, permite determinar</p><p>bactérias com base em seu tamanho, morfologia e afinidade por coloração. A</p><p>diferenciação de bactérias Gram Positivas (G+) e Gram Negativas (G-) se deve as diferenças</p><p>no conteúdo lipídico da parede celular dessas bactérias. A parede de bactérias Gram</p><p>negativas apresenta membrana externa com elevado teor lipídico na sua membrana</p><p>externa, enquanto a membrana plasmática possui uma fina camada de peptidoglicano</p><p>(BRASIL, 2004; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2015a).</p><p>Na coloração de Gram, parte dos lipídios é removida em álcool (ou álcool-acetona)</p><p>e os poros formados na parede permitem a saída do corante Cristal Violeta (violeta</p><p>de metila) e do lugol (mordente), utilizados inicialmente. As bactérias Gram negativas</p><p>perdem esse corante e se tornam transparentes após a incubação com álcool. A lavagem</p><p>com álcool remove o complexo corante-iodo do mordente. A parede celular permeável</p><p>permite a saída deste corante da célula. Isso permite a coloração com safranina (ou</p><p>fucsina), o corante vermelho claro. Já as paredes de bactérias Gram positivas</p><p>possuem</p><p>uma espessa camada de peptidoglicano com baixo teor de lipídeos. Essa parede atua</p><p>como uma barreira para a entrada do álcool e saída do primeiro corante sendo coradas</p><p>em tons de violeta escuro (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2015b; TILLE, 2014).</p><p>Figura 5 - Coloração de Gram</p><p>Fonte: Wikimedia Commons</p><p>Método De Ziehl-Neelsen</p><p>O método de Ziehl-Neelsen se baseia na resistência álcool-ácido de microrganismo</p><p>com Mycobacterium tuberculosis (Bacilos Álcool-Ácido Resistentes ou BAAR).</p><p>Essas amostras são coradas com solução de fucsina fenicada quente e em seguida</p><p>com solução de clorídrico a 3% em etanol (álcool- ácido), não perdendo a coloração</p><p>vermelha inicial. Os microrganismos não resistentes perdem o corante e são corados</p><p>com azul de metileno (Figura 6).</p><p>15</p><p>UNIDADE</p><p>Interpretação de Exames Imunológicos e Microbiológicos</p><p>Pode-se ainda adaptar o método para pesquisa por fluorescência, sendo esse mais</p><p>sensível. Nesse método o fluorocromo utilizado é a auramina que se liga ao ácido micólico</p><p>da parede celular da micobactéria, resistindo à descoloração e emitindo fluorescência</p><p>(FERREIRA, 2015; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2015b; PEREIRA, 2014; SARUBI, 2008).</p><p>Figura 6 - Coloração de De Ziehl-Neelsen. Coloração avermelhada da fucsina.</p><p>Fonte: Wikimedia Commons</p><p>Microscopia de Campo Escuro</p><p>A microscopia de Campo Escuro é aplicada para avaliação direta de espiroquetas,</p><p>como Treponema pallidum, bactéria causadora da sífilis. A neurossífilis assintomática</p><p>não apresenta sinais clínicos. Achados de alterações no LCR (pela pesquisa direta do</p><p>treponema), e positividade em ensaio VDLR (pesquisa de anticorpos) são marcadores</p><p>laboratoriais iniciais dessa infecção (Figura 7). Entretanto, a microscopia de campo</p><p>escuro para detecção direta na fase primária no cancro duro do órgão genital tem</p><p>indicação limitada (DEGAUT, 2013; GASPAR et al., 2004; MURRAY; ROSENTHAL;</p><p>PFALLER, 2015b; SONDA et al., 2013).</p><p>Figura 7 - Identifi cação de leptospira por microscopia de campo escuro</p><p>Fonte: Wikimedia Commons</p><p>16</p><p>17</p><p>Identificação de fungos</p><p>A prova diagnóstica de infecções fúngicas se dá por isolamento e identificação de fungos</p><p>em cultura.</p><p>Amostras assépticas em frasco estéril, podem ser oriundas de pele, unhas, pelos,</p><p>aspirados de secreções, lesões, biópsias, de origem sanguínea ou de lavado ou aspirado</p><p>brônquico, escovado brônquico, escarro, secreções, urina, LCR ou líquidos orgânicos.</p><p>A interpretação do resultado deve ser associada ao tipo de amostra, local da lesão e a</p><p>indicação clínica. Fungos oportunistas podem estar presentes como contaminantes ou</p><p>patógenos (GASPAR et al., 2004).</p><p>Clareamento com KOH</p><p>Nesse método, também chamado micológico direto a amostra é colocada em uma</p><p>lâmina e clareada com uma ou duas gotas de KOH a 20% e coberta com lamínula. Após</p><p>meia hora a amostra é aquecida para aceleração do clareamento e avaliada por microscopia</p><p>(GASPAR et al., 2004; SOMENZI; RIBEIRO; DE MENEZES, [s.d.]).</p><p>Veja o exemplo desse método através do link: https://goo.gl/JkK9MC</p><p>Tinta da China</p><p>A tinta da China ou tinta nanquim é capaz de realçar a cápsula fúngica e pode ser</p><p>aplicada para busca de criptococos em LCR ou outros materiais. Em lâmina, prepara-se</p><p>um filme delgado do sedimento de LCR com uma gota de tinta da China, com a lamínula.</p><p>Para não confundir o núcleo de linfócitos deve-se buscar pelo núcleo refringente e a</p><p>gemulação do criptococos (Figura 8) (KON et al., 2008)</p><p>Figura 8 - Coloração de fungos com tinta Nanquim</p><p>Fonte: unicamp.br</p><p>17</p><p>UNIDADE</p><p>Interpretação de Exames Imunológicos e Microbiológicos</p><p>Avaliação da susceptibilidade de</p><p>microrganismos frente aos agentes</p><p>antimicrobianos mediante o emprego</p><p>de metodologias específicas para o</p><p>diagnóstico laboratorial</p><p>Antibiograma ou Teste de Sensibilidade a Antibióticos (TSA)</p><p>O antibiograma é um exame microbiológico de grande relevância por indicar os</p><p>quimioterápicos mais adequados para cada microrganismo. O Teste de Sensibilidade com</p><p>difusão em discos é utilizado pelos laboratórios há mais de 70 anos e avalia o padrão</p><p>de crescimento ou inibição de crescimento (sensibilidade) de microrganismos frente</p><p>a concentrações estipuladas de determinado antibiótico. Esse ensaio, denominado</p><p>antibiograma, pode ser quantitativo ou qualitativo (MACHADO, 2016; MORREIRA et al.,</p><p>2009; MOTA et al., 2010; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2015b; SILVA et al., 2008)</p><p>Interpretação de resultados</p><p>O Teste de disco-difusão adiciona uma quantidade determinada do microrganismo,</p><p>definida pela determinação do índice de turbidez da bactéria em meio de cultura</p><p>Agar Mueller Hinton. Após a adição do meio a placa de cultura, os discos, com os</p><p>antibióticos previamente definidos, são adicionados em pontos distantes. No ensaio de</p><p>difusão, os antimicrobianos podem inibir ou não o crescimento bacteriano. A formação</p><p>de halos indica que o microrganismo é sensível ao antibiótico. Halos intermediários,</p><p>ou a ausência de halos de inibição definem os resultados indeterminado ou resistente,</p><p>respectivamente (MACHADO, 2016; MORREIRA et al., 2009; MOTA et al., 2010;</p><p>MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2015b; SILVA et al., 2008).</p><p>Os resultados (Figura 9) são definidos como:</p><p>Sensível: O agente antimicrobiano é indicado para o tratamento, visto que ele inibiu</p><p>o crescimento bacteriano.</p><p>Intermediário: O antibiótico está próximo a Concentração Mínima Inibitória (MIC),</p><p>ou seja, o crescimento do agente microbiano atinge ou se aproxima desse nível. Nesses</p><p>casos, o antibiótico deve ser indicado com cautela, em casos de alta dosagem.</p><p>Resistente: O microrganismo é resistente ao antimicrobiano e o medicamento não</p><p>pode ser utilizado.(BRASIL, 2004; MORREIRA et al., 2009; MURRAY; ROSENTHAL;</p><p>PFALLER, 2015b; SOUZA et al., 2008).</p><p>18</p><p>19</p><p>Figura 9 - Antibiograma de Difusão em Disco</p><p>Fonte: anvisa.gov.br</p><p>Ensaio quantitativo ou determinação da</p><p>Concentração Inibitória Mínima (MIC -</p><p>Minimum Inhibitory Concentration)</p><p>Esse ensaio determina a menor concentração do antimicrobiano que é capaz de</p><p>inibir o crescimento do microrganismo, e o resultado é expresso em mg/L. O método</p><p>pode ser de macrodiluição, microdiluição ou por gradiente de difusão. No método de</p><p>macrodiluição em caldo, o microrganismo é isolado por meio de diferentes caldos que</p><p>apresentam concentrações crescentes (de 7 a 8 diluições) de antibióticos. O método de</p><p>microdiluição é realizado em placas de ELISA e as quantidades utilizadas são menores</p><p>(figura 12). O Gradiente de Difusão é semelhante ao método de difusão em disco,</p><p>mas utiliza fitas com concentrações variáveis de antimicrobianos para definição da</p><p>CIM (CAMPANA et al., 2011; PAIVA, 2010; PRABUSEENIVASAN; JAYAKUMAR;</p><p>IGNACIMUTHU, 2006; SOUZA et al., 2008; XU et al., 2016).</p><p>Figura 10 - Microdiluição em caldo</p><p>Fonte: anvisa.gov.br</p><p>Considerações finais sobre métodos microbiológicos</p><p>Cada laboratório deve determinar seus painéis de antibióticos adequados para diferentes</p><p>microrganismos, sendo essa padronização informada no laudo. No Brasil, os laboratórios</p><p>se adequaram à padronização sugerida pelo CLSI, disponível gratuitamente no site da</p><p>ANVISA (CAMPANA et al., 2011).</p><p>19</p><p>UNIDADE</p><p>Interpretação de Exames Imunológicos e Microbiológicos</p><p>Material Complementar</p><p>Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade:</p><p>Vídeos</p><p>Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)</p><p>Para entender mais sobre o método de ELISA, assista o vídeo.</p><p>https://goo.gl/vxC3av</p><p>Aglutinação Sanguínea</p><p>Para saber sobre aglutinação sanguínea assista o vídeo.</p><p>https://goo.gl/3gDDS3</p><p>Teste HIV Exame Rápido AIDS</p><p>Entenda mais sobre o teste rápido HIV com o vídeo.</p><p>https://goo.gl/C9aVye</p><p>Imunologia - Reações Antígeno-Anticorpo</p><p>Assista o vídeo sobre precipitação para entender esses método.</p><p>https://goo.gl/aY7wVA</p><p>Electrophoresis proteins cellulose acetate</p><p>Assista o vídeo sobre imunoeletroforese para entender esses método.</p><p>https://goo.gl/tKhEv6</p><p>Tips and tricks: Phospho Flow Cytometry</p><p>Visualize a técnica de citometria de fluxo com o vídeo abaixo.</p><p>https://goo.gl/Lq1KU8</p><p>Como realizar a Técnica</p><p>de Coloração de GRAM</p><p>Entenda o método de Gram com o vídeo abaixo.</p><p>https://goo.gl/fmLDRn</p><p>Técnica de Coloração de Ziehl-Neelsen (BAAR)</p><p>Você pode entender mais sobre a coloração BAAR com o vídeo.</p><p>https://goo.gl/o8Nbf2</p><p>Antibiograma</p><p>O antibiograma pode ser melhor compreendido com o vídeo abaixo.</p><p>https://goo.gl/wyfbsP</p><p>20</p><p>21</p><p>Referências</p><p>ABBAS, A. 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