Aula 5 - Citogenética e alterações cromossômicas numéricas e estruturais

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<p>Citogenética Humana</p><p>Aspectos Técnicos, Biológicos e a</p><p>Aplicabilidade da Análise Cariotípica</p><p>Prof˚ Juliana Menara</p><p>A Citogenética é o estudo dos cromossomos, sua</p><p>estrutura e sua herança, aplicado à prática da genética</p><p>médica.</p><p>Durante anos, tem sido evidente que as anomalias</p><p>cromossômicas poderiam ser responsáveis por uma série</p><p>de condições clínicas denominadas distúrbios</p><p>cromossômicos, que constituem uma categoria de</p><p>doenças genéticas constitucionais ou adquiridas.</p><p>Citogenética</p><p>Cromatina e cromossomo</p><p>• Cromatina: é um filamento de DNA longo e fino enrolado em</p><p>proteínas (histonas) localizado no núcleo da célula interfásica</p><p>(não em divisão)</p><p>• Durante a divisão celular (metáfase), as cromatinas condensam-</p><p>se, tornando-se mais curtos e mais grossos e passam a ser</p><p>chamados de cromossomos.</p><p>• Os estudos envolvendo visualização cromossômica são</p><p>realizados a partir de cromossomos metafásicos, que se</p><p>encontram duplicados e altamente condensados durante a</p><p>metáfase da mitose.</p><p>Ciclo celular e mitose</p><p>• Na interfase, a cromatina tem graus variáveis de</p><p>compactação ao longo de seu filamento.</p><p>• Eucromatina</p><p>• Heterocromatina</p><p>Partes do cromossomo</p><p>• Centrômero: regiões de constrição primária do cromossomo</p><p>que unem as cromátides irmãs.</p><p>• Nesse local, localiza-se o cinetócoro, uma estrutura formada</p><p>por proteínas onde os microtúbulos prendem-se para separar</p><p>as cromátides durante os processos de divisão celular.</p><p>• O centrômero permite dividir o cromossomo em braços, os</p><p>quais podem ter tamanhos diferentes a depender da posição</p><p>do centrômero.</p><p>Partes do cromossomo</p><p>• Braço cromossômico: nome do segmento cromossômico que vai</p><p>do centrômero até à extremidade.</p><p>• Quando os braços têm diferentes tamanhos, o menor é</p><p>representado pela letra p, o maior, pela letra q.</p><p>• Cromossomo Simples</p><p>• 2 braços</p><p>• 1 centrômero</p><p>• Cromossomo Duplo</p><p>• 4 braços</p><p>• 1 centrômero</p><p>Cromossomo</p><p>• Telômeros: regiões encontradas na extremidade dos</p><p>cromossomos. Neles não há genes, sendo encontradas apenas</p><p>pequenas repetições de nucleotídeos.</p><p>• Função: impedir o desgaste do material genético e manter a</p><p>estabilidade estrutural do cromossoma.</p><p>Partes do cromossomo</p><p>Classificação dos cromossomos quanto à posição</p><p>do centrômero</p><p>• Metacêntrico: centrômero na região central do cromossomo;</p><p>• Submetacêntrico: centrômero suavemente afastado do centro;</p><p>• Acrocêntrico: centrômero próximo uma das extremidades;</p><p>• Telocêntrico: centrômero presente em um das extremidades, em</p><p>sua região terminal, tendo apenas um braço.</p><p>Classificação de acordo com o tamanho e a posição do</p><p>centrômero</p><p>Grupo Tamanho Relativo Posição do Centrômero</p><p>A (1-3) Grandes Metacêntrico</p><p>B (4-5) Grandes Submetacêntrico</p><p>C (6-12) Médios Submetacêntrico</p><p>D (13-15) Médios Acrocêntrico</p><p>E (16-18) Pequenos Submetacêntrico</p><p>F (19-20) Pequenos Metacêntrico</p><p>G (21-22) Muito Pequenos Acrocêntrico</p><p>X Médio Submetacêntrico</p><p>Y Muito Pequeno Acrocêntrico</p><p>Métodos citogenéticos clássicos</p><p>• Métodos de estudo cromossômico</p><p>• Procedimentos laboratoriais que preparam as células e</p><p>seus cromossomos para visualização.</p><p>• Como o melhor momento para se observar</p><p>cromossomos é a metáfase, é necessário colher células</p><p>do organismo e estimulá-las a se dividirem em meio de</p><p>cultura.</p><p>linfócito</p><p>fibroblastos</p><p>Biópsia de pele</p><p>Sangue periférico</p><p>M</p><p>e</p><p>d</p><p>u</p><p>la</p><p>Ó</p><p>ss</p><p>e</p><p>a</p><p>Tipos de amostra</p><p>Líquido Amniótico</p><p>Vilosidades Coriônicas</p><p>Células Tumorais</p><p>Tipos de amostra</p><p>▪ Protocolos otimizados</p><p>▪Cultura a curto prazo: 48 a 72h</p><p>▪ Cultura a longo prazo: 92h</p><p>▪ Pouco invasivo</p><p>linfócito</p><p>Sangue periférico</p><p>Cultura celular para análise cromossômica</p><p>▪ RPMI 1640 - meio de crescimento usado na cultura de célula</p><p>▪ Soro fetal bovino - nutrientes</p><p>▪ Penicilina e Estreptomicina – antibióticos para manter o meio</p><p>asséptico</p><p>▪ Fitohemaglutinina - estimula a divisão dos linfócitos</p><p>▪ a suspensão celular é depois incubada a 37ºC durante 48 a 72 horas</p><p>Bloqueio da divisão celular</p><p>• Ao fim da incubação adiciona-se colchicina ao meio de cultura</p><p>• É um alcalóide extraído de uma planta (colchicum autumnale)</p><p>que impede a formação do fuso mitótico, por dissolução da</p><p>tubulina, e consequentemente a paragem do ciclo celular em</p><p>metáfase</p><p>• O tempo de atuação da colchicina (1 a 2 horas)</p><p>Tratamento das células com solução hipotônica</p><p>• Após centrifugação, a suspensão celular é sujeita a um tratamento</p><p>com uma solução hipotônica de cloreto de potássio para</p><p>intumescer as células - permitindo um maior espalhamento dos</p><p>cromossomas</p><p>• Esta etapa é crítica para obtenção de células adequadas para</p><p>análise sem sobreposição dos cromossomos</p><p>Fixação em lâmina</p><p>• A hipotonização é interrompida adicionando-se fixador</p><p>solução de metanol e ácido acético (na proporção de</p><p>3:1)</p><p>• Preserva a estrutura dos cromossomos.</p><p>• Após a fixação as amostras podem ser conservadas por</p><p>tempo indeterminado à temperatura de -20°C</p><p>Preparo das lâminas</p><p>• A suspensão celular obtida é gotejada em lâminas de</p><p>microscopia, secando - se ao ar e destinadas a diferentes</p><p>técnicas de coloração e de marcação cromossômica.</p><p>✓Incorporação de corante DNA-específico</p><p>(Giemsa)</p><p>✓Rápida, fácil e baixo custo;</p><p>✓Coloração uniforme dos cromossomos</p><p>✓Técnica utilizada para visualizar a forma</p><p>e o número dos cromossomos</p><p>Coloração convencional</p><p>• O bandeamento dos cromossomos corresponde a uma</p><p>técnica que permite fixar o corante de modo mais acentuado</p><p>em certas regiões e menos intenso em outras.</p><p>✓Produzem bandas ou faixas ao longo dos cromossomos:</p><p>• Bandas G, R e Q.</p><p>• Tratamento cromossômico de desnaturação ou digestão</p><p>enzimática seguida da incorporação de corante DNA-</p><p>específico.</p><p>Técnicas de bandeamento e coloração</p><p>Os cromossomos são tratados com tripsina (desnaturação de</p><p>proteínas) e corados com Giemsa.</p><p>• Cada par de cromossomos cora-se num padrão típico de bandas claras e escuras.</p><p>• Bandas G escuras – DNA rico em AT – genes pouco ativos - heterocromatina</p><p>• Bandas G claras – DNA rico em CG – genes muito ativos - eucromatina</p><p>Bandeamento G</p><p>Padronização internacional da nomenclatura - ISCN (Sistema</p><p>Internacional para Nomenclatura em Citogenética</p><p>Humana)</p><p>• São organizados em pares (homólogos) - Grupos A a G</p><p>(Tamanho, posição do centrômero e padrão de Bandas)</p><p>• 22 autossomos + 1 sexual = 46,XX e 46,XY</p><p>• p e q → regiões → bandas → sub-bandas</p><p>Nomenclatura</p><p>p e q → regiões → bandas → sub-bandas</p><p>• Cromossomo 7</p><p>• Braço longo</p><p>• Região 3</p><p>• Banda 1</p><p>• Sub-banda 2</p><p>Bandeamento Q: Coloração feita com o corante quinacrina-</p><p>mostarda, observada em microscopia de fluorescência.</p><p>✓As bandas são brilhantes e</p><p>opacas (bandas Q).</p><p>✓As bandas Q brilhantes</p><p>correspondem às bandas G</p><p>escuras – ricas em AT.</p><p>Bandeamento Q</p><p>Bandeamento R: Também conhecido como banda reversa</p><p>• Os cromossomos recebem pré-tratamento com calor e salina e</p><p>coloração Giemsa.</p><p>• As bandas claras e escuras resultantes (bandas R) são o inverso das</p><p>produzidas por bandeamento G e Q.</p><p>– Banda R escura - à Banda G clara, Banda Q opaca</p><p>– Banda R clara - à Banda G escura, Banda Q brilhante</p><p>Bandeamento R</p><p>• Bandeamento C: os cromossomos são tratados com ácido (HCl) ou</p><p>base forte (normalmente Ba(OH)2) e são expostos a uma solução</p><p>salina aquecida. Depois, são corados com Giemsa</p><p>Coloração da</p><p>região</p><p>centromérica</p><p>Bandeamento C</p><p>Ferramentas de Análise</p><p>• A lâmina é levada ao microscópio e fotografada.</p><p>• Com base nessa imagem, os cromossomos são</p><p>recortados e colados em uma folha de papel aos pares</p><p>(pares de homólogos).</p><p>• Essa montagem cromossômica pela qual é possível</p><p>analisar a forma e o número cromossômico de uma</p><p>dada espécie denomina-se cariótipo.</p><p>• Alguns laboratórios dispõem do recurso de se fazer a</p><p>montagem do cariótipo humano no computador, com o</p><p>uso de programas desenvolvidos para essa finalidade</p><p>Axioplan-Imaging®</p><p>Carl Zeiss</p><p>Cariótipo</p><p>Técnica de citogenética molecular</p><p>• A Hibridação in situ por Fluorescência (FISH) é uma</p><p>técnica de citogenética molecular que utiliza sondas</p><p>de DNA marcadas com fluorescência para detectar</p><p>anomalias cromossômicas como microdeleções e</p><p>rearranjos complexos, que estão além do poder de</p><p>resolução da citogenética clássica.</p><p>• FISH: Técnica de marcação de regiões cromossômicas específicas. Tal</p><p>procedimento é realizado com o uso de sonda de DNA, a qual contém</p><p>corante fluorescente que se liga ao DNA cromossômico da região de</p><p>interesse. Corantes de diversas cores podem ser adicionados às sondas</p><p>HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE</p><p>FISH</p><p>Cariótipo masculino montado a partir de cromossomos corados pela técnica de Fish</p><p>• Diagnóstico clínico</p><p>• Malformação / retardo mental</p><p>• Atraso da puberdade</p><p>• Baixa estatura</p><p>• Problemas reprodutivos</p><p>• Infertilidade</p><p>• Abortamento de repetição</p><p>• Diagnóstico pré-natal</p><p>• Idade materna avançada</p><p>• Alteração ao ultrassom/exames laboratoriais</p><p>Indicação do estudo cromossômico</p><p>Aberrações Cromossômicas</p><p>numéricas e estruturais</p><p>Profa˚ Juliana Menara</p><p>• Responsáveis por uma série de condições clínicas →</p><p>distúrbios cromossômicos:</p><p>✓Perdas fetais (Abortos espontâneos → 42%);</p><p>✓Malformações congênitas;</p><p>✓Retardo mental;</p><p>✓Distúrbios do desenvolvimento sexual e infertilidade;</p><p>✓Patogenia do câncer.</p><p>• 1 em cada 160 nativivos;</p><p>• 2% de todas as gestações (mulheres > 35 anos).</p><p>Alterações cromossômicas</p><p>Tipos de aberrações cromossômicas</p><p>• Numéricas</p><p>• Estruturais</p><p>Aberrações cromossômicas numéricas</p><p>• Tipos</p><p>Aberrações cromossômicas numéricas</p><p>• Aumento ou diminuição do número de</p><p>cromossomos</p><p>Não-disjunção</p><p>Causas</p><p>Perda anafásica</p><p>Não disjunção</p><p>Perda</p><p>Anafásica</p><p>X</p><p>XX</p><p>X</p><p>I I</p><p>Perda Anafásica</p><p>n n n -1 n -1</p><p>Exemplos</p><p>• Síndrome de Down (Trissomia do 21)</p><p>• Síndrome de Patau (Trissomia do 13)</p><p>• Síndrome de Edwards (Trissomia do 18)</p><p>• Síndrome de Turner (monossomia do X)</p><p>• Síndrome de Klinefelter (X extranumerário)</p><p>Alterações cromossômicas numéricas</p><p>Aneuploidias</p><p>autossômicas</p><p>Síndrome de Down - Trissomia 21</p><p>(47,XX + 21 ou 47,XY + 21)</p><p>Baixa estatura, boca semi-aberta, face achatada, olhos oblíquos,</p><p>língua grande, malformações cardíacas, retardo mental.</p><p>Alterações cromossómicas numéricas</p><p>Aneuploidias autossômicas</p><p>Síndrome de Edwards - Trissomia 18</p><p>(47,XX + 18 ou 47,XY + 18)</p><p>Deformações dos ouvidos, pescoço curto, malformações cardíacas,</p><p>atraso mental acentuado. A maioria morre antes do 1º ano de vida.</p><p>Hipertonia</p><p>Punhos Cerrados (2 e 5 sobrepõe o 3 e 4), Unhas Hipoplásicas</p><p>Pés ArqueadosExterno Curto</p><p>Fenda</p><p>Lateral</p><p>Face</p><p>Pequena,</p><p>Micrognatia</p><p>Síndrome de Edward</p><p>Alterações cromossómicas numéricas</p><p>Aneuploidias autossômicas</p><p>Síndrome de Patau - Trissomia 13</p><p>(47,XX + 13 ou 47,XY + 13)</p><p>Alterações do lábio, malformações cardíacas, polidactilia e</p><p>deficiência mental severa. A maioria morre antes do 1º ano de vida.</p><p>Alterações cromossômicas numéricas</p><p>Síndrome de Klinefelter (47,XXY)</p><p>• Acomete indivíduos do sexo masculino;</p><p>• Presença de um cromossomo X adicional;</p><p>Estatura grande, testículos pequenos, que não produzem espermatozoides,</p><p>estéreis, seios salientes e quadris largos, ligeiros atrasos mentais.</p><p>Alterações cromossômicas numéricas</p><p>Síndrome de Turner - Monossomia do X</p><p>(45,X0)</p><p>Baixa estatura, pescoço curto, caracteres sexuais pouco</p><p>desenvolvidos, normalmente estéreis.</p><p>Alterações cromossômicas estruturais</p><p>Síndrome Cri-du-Chat: Deleção parcial do braço curto</p><p>do cromossomo 5 (5p15.3)</p><p>• Choro característico,</p><p>• Microcefalia,</p><p>• Face arredondada,</p><p>• Mandíbula pequena,</p><p>• Aumento da distância entre os olhos,</p><p>• Atrasos mentais e Neuromotores graves.</p><p>Alterações cromossômicas estruturais</p><p>46,XX,5p-</p><p>Síndrome de Prader-Willi</p><p>• 70% dos casos de Prader Willi apresentam a deleção no 15q do pai.</p><p>Caracteriza-se por hipotonia severa</p><p>(baixo tônus muscular), choro fraco e</p><p>dificuldade para alimentar-se.</p><p>Após o período neonatal:</p><p>hiperfagia, obesidade, baixa estatura,</p><p>mãos e pés pequenos e atraso geral</p><p>do desenvolvimento.</p><p>FISH → del 15q</p><p>Alterações cromossômicas estruturais</p><p>• Leucemia mielóide crônica</p><p>• Translocação entre os braços Longos do cromossomo</p><p>22 e 9</p><p>Alterações cromossômicas estruturais</p><p>Obrigado...</p><p>Slide 1: Citogenética Humana</p><p>Slide 2: Citogenética</p><p>Slide 3: Cromatina e cromossomo</p><p>Slide 4: Ciclo celular e mitose</p><p>Slide 5</p><p>Slide 6</p><p>Slide 7: Partes do cromossomo</p><p>Slide 8</p><p>Slide 9: Partes do cromossomo</p><p>Slide 10</p><p>Slide 11: Partes do cromossomo</p><p>Slide 12</p><p>Slide 13: Classificação dos cromossomos quanto à posição do centrômero</p><p>Slide 14: Classificação de acordo com o tamanho e a posição do centrômero</p><p>Slide 15</p><p>Slide 16</p><p>Slide 17: Métodos citogenéticos clássicos</p><p>Slide 18: Tipos de amostra</p><p>Slide 19</p><p>Slide 20: Sangue periférico</p><p>Slide 21: Cultura celular para análise cromossômica</p><p>Slide 22: Bloqueio da divisão celular</p><p>Slide 23: Tratamento das células com solução hipotônica</p><p>Slide 24: Fixação em lâmina</p><p>Slide 25: Preparo das lâminas</p><p>Slide 26</p><p>Slide 27: Coloração convencional</p><p>Slide 28: Técnicas de bandeamento e coloração</p><p>Slide 29: Bandeamento G</p><p>Slide 30: Nomenclatura</p><p>Slide 31: p e q → regiões → bandas → sub-bandas</p><p>Slide 32: Bandeamento Q</p><p>Slide 33: Bandeamento R</p><p>Slide 34: Bandeamento C</p><p>Slide 35</p><p>Slide 36</p><p>Slide 37: Cariótipo</p><p>Slide 38: Técnica de citogenética molecular</p><p>Slide 39: HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE</p><p>Slide 40: FISH</p><p>Slide 41: Indicação do estudo cromossômico</p><p>Slide 42: Aberrações Cromossômicas numéricas e estruturais</p><p>Slide 43: Alterações cromossômicas</p><p>Slide 44: Tipos de aberrações cromossômicas</p><p>Slide 45: Aberrações cromossômicas numéricas</p><p>Slide 46: Aberrações cromossômicas numéricas</p><p>Slide 47</p><p>Slide 48</p><p>Slide 49: Exemplos</p><p>Slide 50</p><p>Slide 51</p><p>Slide 52: Síndrome de Edward</p><p>Slide 53</p><p>Slide 54</p><p>Slide 55</p><p>Slide 56: Alterações cromossômicas estruturais</p><p>Slide 57: Síndrome Cri-du-Chat: Deleção parcial do braço curto do cromossomo 5 (5p15.3)</p><p>Slide 58: Síndrome de Prader-Willi</p><p>Slide 59</p><p>Slide 60</p>