Extração líquido-líquido para macromoléculas

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<p>EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO EM SISTEMAS DE DUAS FASES AQUOSAS</p><p>INTRODUÇÃO</p><p>A extração de biomoléculas em sistemas de duas fases líquidas imiscíveis é</p><p>utilizada há cerca de setenta anos na purificação de antibióticos e ácidos orgânicos.</p><p>Esses sistemas são constituídos por uma fase aquosa e uma fase em solvente orgânico,</p><p>o que, entretanto, não é adequado para proteínas devido à sua sensibilidade à</p><p>desnaturação promovida por esses tipos de solventes. Alternativamente à extração em</p><p>solventes orgânicos, as proteínas podem ser extraídas em sistemas constituídos por</p><p>duas fases aquosas imiscíveis (SDFA). A purificação é resultado de uma partição</p><p>diferenciada da molécula-alvo e impurezas entre as duas fases líquidas. O elevado teor</p><p>de água, 75% a 80% em massa, garante a manutenção das propriedades biológicas das</p><p>proteínas.</p><p>Em 1956, foi feita a primeira menção ao uso do SDFA para a purificação de</p><p>proteínas e partículas de células, sobretudo, fragmentos de parede celular. Desde</p><p>então, a extração em SDFA tem sido estudada para a purificação de produtos obtidos em</p><p>células de animais, de vegetais e microbianas, extração de vírus, organelas e ácidos</p><p>nucleicos, com destaque para a aplicação na purificação de enzimas. Para produtos</p><p>cuja aplicação exige elevado grau de pureza, a extração em SDFA não é suficiente, e,</p><p>nesses casos, ela será sucedida por uma ou mais etapas cromatográficas. Assim, a</p><p>extração em SDFA foi considerada uma etapa de purificação de baixa resolução. Neste</p><p>capítulo, serão apresentados os seguintes aspectos: fundamentos da extração em</p><p>sistemas formados por duas fases aquosas; sistemas nos quais a extração das</p><p>biomoléculas em uma determinada fase é potencializada pela modificação dos</p><p>componentes de modo a se agregar caráter de afinidade entre moléculas do meio em</p><p>purificação e meio extrativo; e finalmente, os equipamentos empregados.</p><p>FUNDAMENTOS</p><p>A separação entre a molécula-alvo e as demais moléculas, os contaminantes,</p><p>decorre das diferentes solubilidades apresentadas por esses solutos, em cada uma das</p><p>fases aquosas. A Figura 1 ilustra a ocorrência das duas soluções aquosas imiscíveis e a</p><p>presença de uma molécula-alvo, P, cuja solubilidade é maior na fase de topo ou fase</p><p>superior em relação à fase de fundo ou fase inferior. Nessa situação, haverá aumento do</p><p>grau de pureza da molécula-alvo, caso os contaminantes apresentem solubilidade maior</p><p>na fase de fundo.</p><p>Figura 1: Sistema de duas fases aquosas imiscíveis: T, fase de topo (leve); B, fase do</p><p>fundo (pesada); P, produto ou molécula-alvo.</p><p>TIPOS DE SISTEMAS DE DUAS FASES AQUOSAS</p><p>Quatro grupos de sistemas de duas fases aquosas imiscíveis são possíveis,</p><p>formados pela reunião de determinados polímeros ou polieletrólitos, ou, ainda,</p><p>polímeros em combinação com solutos de baixa massa molar, em uma mesma solução:</p><p>• Sistema formados por dois polímeros não iônicos: polietilenoglicol</p><p>(PEG)/Ficoll; PEG/Dextrana (Dx); PEG/polivinil álcool; polipropilenoglicol</p><p>(PPG)/dextrana; metil celulose/hidroxipropildextrana; Ficoll/dextrana.</p><p>• Sistema formados por polieletrólito e um polímero não iônico: sulfato</p><p>dextrana de sódio/polipropileno glicol; carboximetilcelulose de</p><p>sódio/metil celulose.</p><p>• Sistemas constituídos por duas fases aquosas imiscíveis (SDFA) formados</p><p>por dois polieletrólitos: sulfato dextrana de sódio/carboximetildextrana de</p><p>sódio; carboximetildextrana de sódio/carboximetilcelulose de sódio.</p><p>• Sistemas constituídos por um polímero não iônico e um composto de</p><p>baixa massa molar: PPG/fosfato de potássio; PEG/fosfato de potássio;</p><p>metoxipolietilenoglicol/fosfato de potássio; PPG/ glicose; PEG/glicose;</p><p>PEG/sulfato de magnésio; PEG/citrato de sódio.</p><p>São sistemas dos mais empregados e estudados aqueles constituídos por</p><p>PEG/Dx, PPG/Dx, sulfato dextrana de sódio/PPG, PEG/fosfato de potássio, PEG/sulfato</p><p>de magnésio e PEG/citrato de sódio. Nos sistemas com dextrana, essa concentra-se na</p><p>fase de fundo, enquanto o outro polímero se concentra na fase topo. Nos casos de</p><p>emprego de sais, estes se concentram na fase de fundo, enquanto o polímero apresenta</p><p>maior concentração na fase superior. Ambas as fases, no entanto, sempre apresentam</p><p>os dois componentes, dado que se estabelece o equilíbrio entre elas. Sistemas</p><p>formados por PEG e um sal são intensamente empregados por apresentarem rápida</p><p>separação das fases, baixo custo e, principalmente, elevada seletividade na separação</p><p>de moléculas com base na solubilidade.</p><p>CURVA DE EQUILÍBRIO</p><p>O sistema com duas fases aquosas que não se misturam (SDFA) é mostrado em</p><p>um gráfico (Figura 2). No gráfico, o eixo vertical indica a concentração da molécula que</p><p>é mais comum na fase de cima (como o Polietilenoglicol), e o eixo horizontal mostra a</p><p>concentração da molécula que é mais comum na fase de baixo (como sal ou dextrana).</p><p>Se o ponto no gráfico está acima da curva de equilíbrio (também chamada de curva</p><p>binodal), duas fases se formam; se está abaixo, apenas uma fase se forma. Assim, a</p><p>formação de um sistema de duas fases aquosas (SDFA) depende das concentrações dos</p><p>componentes no sistema.</p><p>Figura 2: Curva de equilíbrio de um sistema PEG/fosfato. T, fase de topo (leve); B, fase do fundo</p><p>(pesada); M, ponto de mistura.</p><p>A composição do sistema é representada pelo ponto M, portanto, na região de</p><p>ocorrência de sistema bifásico cuja composição das fases de topo e fundo no equilíbrio</p><p>é indicada pelos pontos T e B, respectivamente, unidos entre si por meio da linha de</p><p>amarração, tie-line. Em qualquer ponto da linha de amarração haverá duas fases</p><p>imiscíveis, quanto mais perto de T for o ponto, maior será a fase leve. Quanto mais</p><p>próxima de B, maior será a fase pesada. Entretanto se forem usadas misturas de acordo</p><p>com a curva binodal (a curva do gráfico) há maior probabilidade das fases se misturarem.</p><p>Os pontos que se encontram abaixo desta curva gerarão fase punica, acima, duas fases.</p><p>Por isso, ela é chamada de pronto crítico ou curva de equilíbrio, onde haverá mais</p><p>instabilidade entre as fases.</p><p>A Figura 3 apresenta as curvas de equilíbrio para o sistema formado por PEG/</p><p>fosfato de potássio, tendo por parâmetros a massa molar do PEG (300 e 6.000 Da) e o pH</p><p>do meio (4 a 9). Verifica-se que quanto maior a massa molar do polímero, menor a</p><p>concentração necessária para a formação de duas fases líquidas aquosas em equilíbrio.</p><p>A redução do valor do pH do meio desloca a curva de equilíbrio significativamente para</p><p>o lado direito, de tal forma que as concentrações necessárias à formação das duas fases</p><p>líquidas, em um sistema polímero e sal, como PEG/sal, aumentam.</p><p>Figura 3: Curvas de equilíbrio do sistema PEG/fosfato de potássio em função dos parâmetros</p><p>massa molar do PEG e pH do meio. % p/p: abreviação de "peso por peso", indica que a</p><p>porcentagem está sendo calculada com base no peso, ou seja, a quantidade de uma substância</p><p>(neste caso, fosfato ou PEG) em relação ao peso total da mistura. Por exemplo, uma mistura de</p><p>100 mL de 10% p/p PEG e 10% p/p fosfato vai ter 10 g de PEG, 10 g de fosfato e 80 g de água.</p><p>Valores de temperatura do meio líquido abaixo da temperatura ambiente</p><p>provocam enriquecimento das fases superior e inferior nos SDFA constituídos por dois</p><p>polímeros. Já para SDFA do tipo PEG/sal, a elevação da temperatura favorece o sistema,</p><p>isto é, aumenta a concentração de polímero na fase superior e a do sal na fase inferior.</p><p>A temperatura, portanto, influi na posição da curva de equilíbrio e, por consequência, na</p><p>composição das fases e na partição das moléculas entre as fases. Quando se utiliza</p><p>sulfato de amônio, o aumento de temperatura pode fazer com que a fase PEG vá para o</p><p>fundo e a do sulfato suba. A diferença de viscosidade e de força iônica das fases pode</p><p>auxiliar na manutenção da segregação das fases. Os principais fatores que influenciam</p><p>a posição do equilíbrio em um SDFA são a massa molar do polímero, o tipo de sal e a</p><p>concentração dos componentes.</p><p>Algumas fases se mantêm separadas por fundamentos</p><p>simples, por exemplo, a</p><p>imiscibilidade dos sistemas PEG/Dextrana se deve à impossibilidade de duas</p><p>macromoléculas compartilharem a mesma fase líquida por causa da conformação dos</p><p>polímeros. Ou seja, quando se trata de sistemas com duas macromoléculas, a</p><p>segregação entre as fases é atribuída à impossibilidade física de mistura dos</p><p>componentes. Essa teoria encontra respaldo no fato de que o aumento da massa molar</p><p>do PEG aumenta a região de duas fases, como ilustram as curvas da Figura 3.</p><p>A adição de um determinado meio contendo biomolécula alvo e impurezas a um</p><p>SDFA provoca modificação da posição da curva de equilíbrio, pois altera as</p><p>características do meio, e um diagrama pode ser construído para determinar a</p><p>composição das fases em equilíbrio. Isto envolve o uso de HPLC, liofilização, titulação</p><p>ou turbidez.</p><p>COEFICIENTE DE PARTIÇÃO</p><p>O coeficiente de partição (K) é uma grandeza adimensional que representa a</p><p>relação entre as concentrações da molécula de interesse na fase de topo e na fase de</p><p>fundo no equilíbrio, conforme apresenta a Equação 1 , na qual CTi , é a concentração do</p><p>soluto “i” na fase de topo e CFi, a concentração do soluto “i” na fase de fundo:</p><p>𝐾 =</p><p>𝐶𝑇𝑖</p><p>𝐶𝐹𝑖</p><p>O valor de K (coeficiente de partição) é usado para avaliar a eficácia da separação</p><p>de uma molécula-alvo de outras moléculas em sistemas de duas fases aquosas. Se a</p><p>molécula de interesse tem um valor de K muito diferente das outras moléculas, isso</p><p>indica que ocorreu purificação. A partição de proteínas entre as duas fases depende de</p><p>onde elas são mais solúveis, o que é influenciado por suas características físico-</p><p>químicas (como hidrofobicidade, carga superficial e massa molar) e pelas condições da</p><p>solução (como pH e força iônica).</p><p>A solubilidade das proteínas é principalmente determinada pelas interações de</p><p>suas cargas superficiais com íons na solução, por isso, o pH e a força iônica são cruciais</p><p>para o processo de separação. Em sistemas com altas concentrações de sais, como</p><p>sulfatos ou fosfatos, a força iônica pode reduzir a solubilidade das moléculas na fase</p><p>salina, empurrando-as para a fase menos polar. Isso aumenta o efeito de salting-out,</p><p>reduzindo a solubilidade na fase de fundo e afetando o valor de K.</p><p>Além disso, o tipo e a massa molar do polímero influenciam o valor de K. Em</p><p>sistemas com PEG (polietilenoglicol) de alta massa molar, proteínas podem preferir a</p><p>fase salina devido à exclusão molecular, especialmente quando há uma grande</p><p>diferença de massa molar entre as moléculas. Em geral, o valor de K diminui com o</p><p>aumento da massa molar da proteína.</p><p>A tensão interfacial entre as fases também afeta a partição de moléculas</p><p>pequenas, e a hidrofobicidade das proteínas influencia sua afinidade com a fase de topo.</p><p>Proteínas com mais aminoácidos hidrofóbicos (glicina, alanina, valina, leucina,</p><p>isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptofano e prolina) tendem a preferir a fase</p><p>de topo. Em concentrações baixas de proteína ( 1000 Da. A dextrana, poli(α-1,6-glicose), é encontrada na forma de pó</p><p>facilmente dissolvido em água, em massas molares de 10.000 a 2.000.000 Da.</p><p>Os experimentos são preparados a partir de soluções estoque, normalmente 40%</p><p>(em massa) para os sais, 50% para a solução de PEG e 20% a 30% para a dextrana,</p><p>pesadas na quantidade necessária à obtenção da concentração desejada no sistema,</p><p>pois a alta viscosidade das soluções de polímeros não permite a dosagem volumétrica.</p><p>A ordem de adição dos componentes, devido a suas densidades, é a seguinte:</p><p>solução de Dextrana ou solução de PEG, solução do sal e água. Como a temperatura</p><p>afeta a formação do sistema de fases, é necessário que as soluções-estoque já estejam</p><p>na temperatura de trabalho antes do preparo do sistema. Uma vez preparado o sistema,</p><p>deve-se agitá-lo, por exemplo, sob vórtice, por 20 a 60 segundos ou por inversão a baixa</p><p>rotação, por 3 a 5 minutos, e, em seguida, deixá-lo em repouso para que atinja o</p><p>equilíbrio. A separação das fases pode ser acelerada por centrifugação sob valores de</p><p>Fc de 1.000 a 2.000 xg por 3 a 5 minutos.</p><p>EXTRAÇÃO REPETIDA</p><p>A aplicação de repetidas extrações em SDFA é recurso vigoroso na purificação de</p><p>proteínas. Na primeira aplicação da extração, caso a proteína migre para a fase de topo</p><p>e alguns contaminantes para a fase de fundo, extrai-se a fase de topo com a molécula-</p><p>alvo e a ela adiciona-se uma solução a fim de formar uma nova fase inferior, que resulte</p><p>em aumento de pureza adicional em relação à primeira etapa. Essa estratégia é</p><p>particularmente importante na purificação de meios</p><p>complexos, por exemplo, meios</p><p>contendo proteínas diversas, ácidos nucleicos, polissacarídeos e pigmentos oriundos</p><p>do rompimento de células.</p><p>Na purificação da enzima amiloglicosidase extracelular produzida por Aspergillus</p><p>awamori, submeteu-se o meio clarificado a uma sequência de duas extrações em</p><p>sistemas PEG/fosfato. Na primeira etapa, a enzima foi extraída na fase salina, enquanto</p><p>impurezas de baixa massa molar, como os pigmentos produzidos pelo fungo, foram</p><p>extraídos na fase rica em PEG de massa molar 6.000 Da. Na segunda etapa, a adoção de</p><p>PEG de massa molar de 1.000 ou 1.500 Da foi eficiente para a extração das impurezas de</p><p>elevada massa molar na fase leve e a recuperação, η, de 100% da enzima na fase salina.</p><p>CLARIFICAÇÃO DE SUSPENSÕES MICROBIANAS</p><p>Células e seus fragmentos podem ser extraídos usando sistemas de duas fases</p><p>aquosas (SDFA), o que é útil para sólidos pequenos, como fragmentos de membranas</p><p>celulares e bolores, que são difíceis de clarificar por centrifugação devido à sua baixa</p><p>densidade. O uso de SDFA também pode simplificar a purificação de proteínas, pois</p><p>células e fragmentos tendem a se acumular na interface ou na fase de fundo, enquanto</p><p>proteínas-alvo e outras moléculas podem ser extraídas na fase de topo.</p><p>Em experimentos com diferentes massas molares de PEG e pH, moléculas como</p><p>a retamicina se concentram na fase superior, enquanto as células bacterianas vão para</p><p>a fase inferior. Na produção de anticorpos monoclonais, é possível separar os anticorpos</p><p>das células usando SDFA, com os anticorpos indo para a fase leve rica em PEG e as</p><p>células ficando na interface.</p><p>No caso de bactérias como Escherichia coli, que produzem proteínas no interior</p><p>da célula, a homogeneização pode ser evitada usando substâncias que permeabilizam</p><p>a parede celular. Mesmo sem homogeneização, a viscosidade do meio aumenta,</p><p>tornando a centrifugação difícil. Nesse caso, SDFA pode ser usado com sucesso para</p><p>clarificar o meio, separando as células na interface ou na fase de fundo e extraindo as</p><p>proteínas de interesse na fase leve rica em PEG.</p><p>O meio contendo a molécula-alvo pode vir de várias fontes, como animal, vegetal,</p><p>microbiana ou efluentes. Meios com partículas podem ser purificados diretamente no</p><p>SDFA. Lipídeos podem interferir na eficiência da purificação, exigindo remoção prévia.</p><p>Além disso, o pH e a concentração salina devem ser ajustados, pois afetam a afinidade.</p><p>MEDIDAS DE EFICIÊNCIA</p><p>A eficiência de extração de uma biomolécula-alvo em sistemas de duas fases</p><p>aquosas (SDFA) é medida pelo coeficiente de partição (K). Um valor alto de K indica que</p><p>a molécula-alvo se concentra na fase de topo. A separação entre a molécula-alvo e os</p><p>contaminantes é avaliada comparando os valores de K da molécula-alvo com os dos</p><p>contaminantes. O fator de purificação é calculado pela razão entre a pureza da</p><p>molécula-alvo antes e depois da extração. Mesmo com um valor alto de K e boa</p><p>separação, é importante garantir que o rendimento da molécula-alvo seja alto na fase</p><p>desejada para que a extração em SDFA seja viável.</p><p>Os polímeros e sais podem ser reciclados para redução de custos operacionais</p><p>e dos danos ambientais causados pelos sais empregados. Quando a fase de topo</p><p>contém a molécula-alvo, é possível recuperar o polímero por meio da indução à</p><p>formação de uma nova fase de fundo, na qual a molécula apresente maior solubilidade.</p><p>Haverá, todavia, uma perda da molécula de interesse, dado que ocorre sempre uma</p><p>distribuição entre as fases. Alternativamente, pode-se separar o polímero dos demais</p><p>solutos por meio da cromatografia de exclusão molecular ou ultrafiltração, ou, ainda, por</p><p>precipitação da molécula-alvo quando se tratar de proteína, com solventes como o</p><p>etanol ou acetona, ou com soluções salinas, desde que o polímero não precipite.</p><p>EXTRAÇÕES BASEADAS EM AFINIDADE</p><p>A extração de biomoléculas em sistemas de duas fases aquosas (SDFA) pode ser</p><p>melhorada ao utilizar ligantes que têm afinidade específica pela molécula-alvo. Isso é</p><p>feito modificando quimicamente um componente do SDFA para aumentar a interação</p><p>com a biomolécula, elevando o coeficiente de partição (K) e, consequentemente, a</p><p>eficiência da extração. Ligantes específicos ou pseudoespecíficos, como anticorpos ou</p><p>corantes, podem ser acoplados a polímeros como o PEG para direcionar a molécula-alvo</p><p>para uma fase específica, como indicado na Figura 5.</p><p>Figura 5: Sistema de extração por afinidade: fase superior rica em PEG-ligante e molécula-alvo e</p><p>fase inferior rica em sulfato de sódio e contaminantes.</p><p>A escolha de um ligante específico a uma dada proteína-alvo deve estar</p><p>relacionada aos seguintes critérios:</p><p>• a constante de dissociação proteína-ligante deve ser menor que 10–3 M;</p><p>• o ligante deve ser bifuncional, isto é, oferecer um sítio de ligação específico</p><p>para a proteína e um sítio para sua imobilização no polímero;</p><p>• o ligante deve ser estável durante a imobilização e na operação de</p><p>extração;</p><p>• o ligante não deve conter grupos hidrofóbicos ou carregados, pois tais</p><p>grupos podem promover a adsorção de proteínas do meio, isto é,</p><p>adsorções sem especificidade;</p><p>• o ligante não deve apresentar toxicidade para o produto final, tendo em</p><p>vista a existência de risco de “vazamento” do ligante para o produto final.</p><p>Em geral, o ligante é acoplado a polietilenoglicol, pois PEG reage facilmente com</p><p>grupos químicos ativadores em virtude da presença de hidroxilas substituíveis. Após a</p><p>extração, é importante recuperar e reciclar o polímero e o ligante, utilizando métodos</p><p>como mudança de pH, adição de agentes quelantes, ou ultrafiltração. A Figura 6</p><p>representa o processo de recuperação de polímero com ligantes.</p><p>Figura 6: Processo de reciclagem de polímeros.</p><p>A tabela a seguir apresenta uma séria de moléculas ou conjunto de moléculas</p><p>purificadas por meio de extração em SFDA com afinidade.</p><p>Metalo-afinidade: Proteínas podem ser extraídas usando metais como ligantes</p><p>dos polímeros no SDFA, uma técnica semelhante à cromatografia de metalo-afinidade.</p><p>O PEG-IDA-metal é o complexo mais utilizado, com metais como Cu(II), Ni(II), Zn(II), e</p><p>Co(II) aumentando a seletividade da extração dependendo dos resíduos de aminoácidos</p><p>na superfície da proteína.</p><p>Afinidade por Corantes: Corantes são utilizados como ligantes</p><p>pseudoespecíficos devido ao baixo custo e resistência química. Eles são semelhantes a</p><p>ligantes bioespecíficos e são eficazes na purificação de enzimas e proteínas. Corantes</p><p>como Cibacron Blue e Procion Red H-3 são comumente usados em SDFA.</p><p>Outros Ligantes: Ligantes hidrofílicos, hidrofóbicos ou magnéticos podem ser</p><p>acoplados ao PEG. Esses ligantes ajudam na avaliação das propriedades de proteínas,</p><p>como hidrofobicidade e carga superficial, e permitem a separação de células com base</p><p>em suas cargas.</p>