Extração e Purificação de DNA

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<p>DNA GENÔMICO</p><p>(kits de extração de DNA)</p><p>Metodologia fácil e imediata para extração e purificação de DNA, utilizando a</p><p>técnica de remoção de sangue, e kits de extração de DNA, com o auxílio do</p><p>protocolo.</p><p>A metodologia utiliza isocianato de guanidina e aliança covalente de DNA com</p><p>partículas de sílica.</p><p>A prática foi realizada no laboratório dia 19/03/2024, no bloco D, sala 201.</p><p>1. Materiais utilizados:</p><p>● Todos os materiais necessários, incluindo os tampões L1, L2, L3 e L4, a</p><p>aquisição de eluição (E1), tubos de centrifugação, pipetas, agitador de vórtice,</p><p>uma estufa e amostra biológica (sangue).</p><p>2. Homogeneização da Amostra:</p><p>● homogeneizar a amostra no tubo contendo o padrão L1 e no agitador de</p><p>vórtex por 10 segundos.</p><p>3. Adição e Incubação da Amostra:</p><p>● Adicionar 100 µL da amostra homogeneizada ao tubo com a variação L1 e</p><p>agite novamente no agitador de vórtex por 10 segundos.</p><p>● Deixe o tubo em temperatura ambiente por 10 minutos, agitando</p><p>periodicamente a cada minuto.</p><p>4. Centrifugação Inicial:</p><p>● Centrifugar o tubo de 10.000 g por 30 segundos para separar os componentes</p><p>sólidos e líquidos.</p><p>5. Descarte do Sobrenadante:</p><p>● Descartar o sobrenadante com cuidado, sem remover o precipitado formado.</p><p>6. Primeira Lavagem:</p><p>● Adiciona 900 µL do seletiva L2 ao precipitado e dissolver o pellet através de</p><p>repetidas pipetagens.</p><p>● Centrifugar o tubo de 10.000 g por 30 segundos e descartar o sobrenadante</p><p>sem remover o precipitado.</p><p>7. Segunda Lavagem:</p><p>● Repetindo o processo de lavagem do precipitado com 900 µL do regular L2,</p><p>dissolvendo o pellet e centrifugando.</p><p>8. Terceira e Quarta Lavagem:</p><p>● Realize duas lavagens adicionais, cada uma com 900 µL do regular L3,</p><p>seguindo os mesmos passos de dissolução e centrifugação.</p><p>9. Quinta e Sexta Lavagem:</p><p>● Repita o processo de lavagem do precipitado duas vezes com 900 µL do</p><p>aquecimento L4, dissolvendo o pellet e centrifugando após cada lavagem.</p><p>10. Secagem do Pellet:</p><p>● Deixe o pellet de ácidos nucléicos secar a 56°C por 10 minutos com a tampa do</p><p>tubo aberta, utilizando uma estufa ou termobloco.</p><p>11. Eluição dos Ácidos Nucléicos:</p><p>● Adiciona 100 µL do líquido de eluição (E1) ao precipitado seco.</p><p>● Incubar o tubo a 56°C por mais 10 minutos com a tampa do tubo fechado para</p><p>extrair os ácidos nucléicos.</p><p>12. Centrifugação Final:</p><p>● Centrifugar o tubo de 12.000 g por 10 minutos para sedimentar quaisquer</p><p>resíduos sólidos.</p><p>13. Transferência do Sobrenadante:</p><p>● Com cuidado, transfira o sobrenadante contendo os ácidos nucleicos extraídos</p><p>para um novo tubo limpo.</p><p>14. Utilização dos Ácidos Nucléicos:</p><p>● Utilize o material obtido em procedimentos de biologia molecular, como</p><p>amplificação por PCR.</p><p>15. Verificação e Quantificação dos Ácidos Nucléicos:</p><p>● Verificar a presença de ácidos nucleicos por eletroforese em géis de agarose</p><p>corados ou quantifique-os em espectrofotômetro para garantir a qualidade e</p><p>quantidade adequadas.</p><p>EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS</p><p>Metodologia a remoção de DNA de tecidos vegetais, este método detalhado visa</p><p>fornecer uma abordagem passo a passo para a proteção eficiente de DNA de tecidos</p><p>vegetais.</p><p>A prática foi realizada no laboratório dia 27/02/2024, no bloco D, sala 302.</p><p>1.Materiais utilizados:</p><p>● Todos os materiais necessários, Amostras de tecido vegetal (Cebola),</p><p>Água, Sal de cozinha (NaCl), Detergente translúcido, Álcool 70%, Becker,</p><p>Filtro de café, Banho-maria, Centrífuga.</p><p>2.Preparação da Solução de Lise:</p><p>● Adicione ¾ de água ao becker.</p><p>● Adicione uma colher de chá de sal e uma colher de sopa de detergente</p><p>transparente. Misture bem para formar a solução de lise.</p><p>3.Macerar o Material Biológico:</p><p>● Macere o material biológico utilizando Gral</p><p>● Adicione o material biológico macerado à solução de lise no becker.</p><p>Misture delicadamente para evitar a formação de espuma.</p><p>4.Incubação em Banho-maria:</p><p>● Coloque no becker com a mistura em um banho-maria com água a</p><p>aproximadamente 70°C.</p><p>● Incube a mistura por cerca de 20 minutos, mantendo uma temperatura</p><p>constante.</p><p>5.Filtragem da Mistura:</p><p>● Retire o copo do banho-maria.</p><p>● Passe a mistura por um filtro de papel para separar os sólidos, coletando</p><p>o filtrado em outro becker.</p><p>6.Resfriamento da Solução:</p><p>● Coloque o becker com o filtrado em um banho de gelo com água gelada</p><p>por aproximadamente 5 minutos para esfriar.</p><p>7.Adição de Álcool:</p><p>● Retire o becker do gelo e, vagarosamente, adicione álcool gelado pela</p><p>parede do copo.</p><p>● Adicione uma parte de álcool para cada parte filtrada.</p><p>8.Observação da Precipitação do DNA:</p><p>● Repouse o becker em uma superfície plana e observe a separação das</p><p>substâncias.</p><p>● O DNA precipitará em uma nuvem esbranquiçada enquanto a pectina</p><p>permanecerá no topo da fase tranquila.</p><p>PREPARO DO GEL DE AGAROSE</p><p>A metodologia de eletroforese em gel de agarose é uma técnica comum que permite a</p><p>separação dessas moléculas com base em seu tamanho, carregamento e mobilidade</p><p>em um campo elétrico, o gel de agarose é comumente usado em técnicas de biologia</p><p>molecular, como eletroforese em gel de agarose para separar fragmentos de DNA.</p><p>A prática foi realizada no laboratório dia 05/03/2024, no bloco D, sala 302.</p><p>1. Materiais utilizados:</p><p>● Todos os materiais necessários, Agarose, Tampão TBE , Balança de pesagem,</p><p>becker, Micropipetas e ponteiras, Placa de gel de agarose, Proveta graduado de</p><p>100ml, Microondas, Cuba horizontal por eletroforese com a fonte de energia.</p><p>2.O Gel de Agarose a 2% (Cuba</p><p>Grande):</p><p>● 29 g de agarose</p><p>● 100 ml de tampão TBE 0,5x</p><p>3. Preparação do Tampão TBE 0,5x:</p><p>● 10 ml de tampão TBE 5x</p><p>● 90 ml de água destilada</p><p>4.Blue Green Loading Dye (Corante para Ácidos Nucleicos):</p><p>● Descongelar o corante e armazená-lo em quantidades menores</p><p>● Para cada 10 µL de amostra, aplicar entre 0,5-1,0 µL de Blue Green Loading Dye</p><p>(BGLD)</p><p>5. Remoção do DNA e Superfícies Contaminadas:</p><p>● Descongelar o corante.</p><p>● Remover o DNA e contaminantes de superfícies com etanol 95% por 20</p><p>minutos a -20°C.</p><p>● Centrifugar por 10 minutos.</p><p>● Lavar duas vezes com etanol 70% a 4°C, centrifugado por 5 minutos a 1200 g</p><p>cada vez.</p><p>● Tampão TE.</p><p>6.Preparação do Tampão TBE 10x:</p><p>● 1 mol de Tris base</p><p>● 55 g de ácido bórico</p><p>● 800 ml de água destilada</p><p>● 40 ml de solução de EDTA 0,5M</p><p>(pH 8)</p><p>● (Ajustar o volume para 1 L)</p><p>Modo de execução:</p><p>7. Preparação do Tampão TBE 0,5x:</p><p>● Diluir o tampão TBE 10x</p><p>concentrado 10 vezes com água</p><p>destilada ultra pura.</p><p>● A solução final deve conter:</p><p>● Tris 0,13M (pH 7,6)</p><p>● Ácido bórico 45 mM</p><p>● EDTA 2,5 mM</p><p>● Pesar 29 g de agarose e adicionar a 100 ml de tampão TBE 0,5x em uma cuba</p><p>grande.</p><p>● Misturar 10 ml de tampão TBE 5x com 90 ml de água destilada para preparar o</p><p>tampão TBE 0,5x.</p><p>● Aquecer a mistura de agarrose em tampão TBE no micro-ondas até que a</p><p>agarose se dissolva completamente.</p><p>● Deixar a solução de agarose esfriar até cerca de 60°C.</p><p>● Adicionar Blue Green Loading Dye à amostra de acordo com as proporções</p><p>mencionadas.</p><p>● Verta a solução de agarose na cuba e coloque os pentes.</p><p>● Deixe o gel solidificar por aproximadamente 30 minutos.</p><p>● Após a solidificação, remova os pentes e adicione o tampão TBE na cuba para</p><p>cobrir o gel em 1 mm ou um pouco mais.</p><p>● Prepare as amostras conforme descrito na etapa de remoção de DNA e</p><p>contaminantes.</p><p>● Carregue as amostras cuidadosamente nos pocinhos do gel, não esquecendo</p><p>de aplicar o ladder.</p><p>● Conecte os fios na cuba e na fonte de energia, ajustando a voltagem conforme</p><p>necessário.</p><p>● Após a corrida, desligue a corrente quando as amostras tiverem migrado o</p><p>suficiente.</p><p>● Examine o gel utilizando um transiluminador e fotografe conforme necessário.</p>