AAII_Cromatografia_liquida

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15/05/2012 
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
CLAE 
Prof. Cleiton Nunes 
DCA/UFLA 
Comparação CLC x CLAE 
coluna: ø 10cm x 0,5-1,0 m 
ø partícula 60-200μm 
reuso FE dificultado 
coluna: ø 4-10mm x 10-30 cm 
ø partícula 3-20 μm 
reuso FE facilitado 
injeção: 
conta-gotas 
injeção: 
seringa (3-10μl) 
eluição: 
gravidade 
demorada 
eluição: 
alta pressão 
rápida 
detecção: 
coleta manual 
outras técnicas 
detecção: 
automática 
detectores on-line 
gravimetria 
 
análise 
química 
 
análise 
espectral 
 
etc. 
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Técnicas de separação em CLAE 
Adsorção (líquido-sólido) 
 
Principio de separação: competição de adsorção AN-FE por sítios na FE (polar) 
 
FE: sólido adsorvente 
Alumina – Al2O3 
 
sílica – SiO2 
 
FM: 
Hexano 
Metil-tercbutil-eter 
CHCl3 
CH2Cl2 
S L 
F.E F.M. 
 
 
Troca iônica 
 
Princípio de separação: atração entre íons do NA por sítios catiônicos/aniônicos na FE 
 
FE: matriz de polímero ou sílica com grupos catiônicos/aniônicos ligados 
 
 FE troca catiônica: SO3
-, COO- 
 FE troca aniônica: NR3
+ 
 
 
 
FM: soluções tampão 
 
 
 
Técnicas de separação em CLAE 
F.E F.M. 
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Técnicas de separação em CLAE 
poros 
F.E F.M. 
Exclusão molecular 
 
Princípio de separação: diferença de tamanho das moléculas de AN. Maiores eluem 1º 
 
FE: polímeros porosos. (PVA, poliacrilamida, S-DVB) 
 
 
FM: solvente orgânico - permeação em gel 
 aquosa - filtração em gel 
F.E F.M. 
L L 
Partição (líquido-líquido) 
Princípio de separação: diferença de solubilidade AN entre FM/FE 
 
FE: FE líquida ligada à superfície do suporte (SiO2) 
 
 
 
 
 
 
 
 FE polar FE apolar 
 
 
 
 
 
 
FM: MTBE, CHCl3, CH2Cl2, hexano FM: acetonitrila, MeOH, tetrahidrofurano, H2O 
Técnicas de separação em CLAE 
Mais usado 
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Princípios de separação em CLAE 
FASE NORMAL 
 
FE – polar FM – apolar 
apolar  polar FM mais usadas: 
Metil-tercbutil-eter 
Clorofórmio 
Diclorometano 
Hexano 
Princípios de separação em CLAE 
FASE REVERSA 
 
FE – apolar FM – polar 
polar  apolar 
FM mais usadas: 
Acetonitrila 
Metanol 
Tetrahidrofurano 
Água 
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Processo de eluição em CLAE 
 
 
Eluição isocrática 
Composição FM constante 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Eluição por gradiente 
Composição FM variada 
Polaridade FM varia com o tempo 
 Melhora separação 
 Diminui tempo de corrida 
Isocrática 
Gradiente 
40% de CH3CN 
30% de CH3CN 
45% de CH3CN 
80% de CH3CN 
Esquema para escolha de técnica CLAE 
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Equipamento para CLAE 
Desgaseificação 
 Elimina gases na FM 
 Gases podem formar bolhas no sistema 
 O2 pode oxidar a FM 
Fase Móvel 
 Alto grau de pureza 
 Dissolver a amostra sem a decompor 
 Não dissolver ou decompor a fase estacionária 
Fase Móvel e Reservatório 
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FUNÇÃO: proporcionar fluxo constante de FM pelo sistema 
 Alta pressão 
 Constante 
 Reprodutível 
 
 Controle do gradiente de FM 
 
 
 
CONDIÇÕES DE FUNCIONAMENTO: 
Pressões acima de 6000 PSI 
Fluxos de 0,1 a 10 mL/min 
 
Bombas 
BOMBAS RECÍPROCAS (MAIS USADAS) 
 
Consistem de um pequeno cilindro no qual o 
solvente é impelido pelo movimento de vai-vem 
de um pistão acionado por um motor. 
 
Duas válvulas se abrem e se fecham 
alternadamente controlando o fluxo do solvente 
para dentro e para fora do cilindro. 
 
Vantagem: 
Altas pressões de saída 
 
Desvantagem: 
Produzem fluxo pulsado 
 
Uso de pistões duplos reduz a pulsação 
 
Bombas 
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BOMBAS DE SERINGA 
 
Consistem de uma câmara equipada com um 
êmbolo que é deslocado continuamente por um 
motor. 
 
O líquido contido na câmara é comprimido e flui 
para o sistema através de uma abertura. 
 
Vantagem: 
Fluxo livre de pulsações 
 
Desvantagem: 
Capacidade limitada de volume de solvente 
(~250mL) 
 
Bombas 
BOMBAS PNEUMÁTICAS 
 
Consistem de uma câmara equipada com um 
êmbolo ou não (gás inerte comprimido). 
 
O líquido contido na câmara é comprimido mediante 
pressão exercida por um êmbolo ou gás inerte e flui 
para o sistema através de uma abertura. 
 
Vantagem: 
Fluxo livre de pulsações 
 
Desvantagem: 
Capacidade limitada de volume de solvente e de 
pressão 
 
Bombas 
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Sistema de injeção 
Volumes de injeção: 1 – 100 μL 
 
Reprodutibilidade alcançada pelo 
uso de alça de amostragem (loop) 
A introdução da amostra é realizada por um sistema de válvulas. 
Operam em duas posições: 
 
 
 
 
 
 
 
 
Carga do loop com a amostra Introdução da amostra na coluna 
Sistema de injeção 
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Colunas 
 Contém a Fase Estacionária 
 5 a 30 cm de comprimento 
 4 a 10 mm de diâmetro interno 
 
Pré-coluna (coluna-guarda) 
• ~2cm de comprimento 
• Composição semelhante à da fase estacionária 
• Instalada entre o injetor e a coluna 
• Remove partículas 
• Remove substância que teriam forte interação com a coluna 
• São substituídas regularmente 
Colunas 
Mantém a temperatura da coluna estável 
 
Temperatura ambiente ou ligeiramente acima 
 
Maiores temperaturas causam maior degradação da coluna 
 
Para a quantificação a termostatização é essencial (± 0,1 C) 
Forno para coluna 
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Cromatografia em fase normal 
FE polar 
FM apolar 
Cromatografia em fase reversa 
FE apolar 
FM polar 
 
Partículas com diâmetro uniforme (ø partícula 3-20 μm) 
 
CLAE de partição líquido-líquido é mais usada 
Sílica microporosa serve como suporte 
Fases estacionárias 
Fases polares comuns Fases apolares comuns 
R = (CH2)3NH2 amino R = (CH2)17CH3 octadecil 
R = (CH2)3C≡N ciano R = (CH2)7CH3 octil 
R = (CH2)2OCH2CH(OH)CH2OH diol R = (CH2)3C6H5 fenil 
Si O Si
CH3
CH3
R
Partícula 
de sílica
Detectores 
Função 
 Monitora continuamente a saída da coluna 
 Mede alguma propriedade física dos componentes eluídos 
 O sinal detectado é transformado em um pico no cromatograma 
 
Requisitos 
 Alta sensibilidade 
 Baixo nível de ruído 
 Alta estabilidade 
 Boa reprodutibilidade 
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Aplicação 
 Detecta a absorbância de radiação UV-Vis do analito 
 compostos que apresentam grupos cromóforos 
 FM deve absorver pouco ou não absorver no l utilizado 
Tipos 
 monocromático 
 policromático 
Detectores 
UV-Vis 
Monocromático 
 
 Monitora um único λ durante a detecção 
 
 Permite mudar λ durante a análise (190-600 nm) 
Detectores 
UV-Vis 
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Policromático 
 
 Registra o espectro inteiro para cada analito 
 Usa um conjunto de fotodiodos para registrar a absorção em cada λ 
Detectores 
UV-Vis 
Relação entre a velocidade da luz no vácuo e a velocidade da luz em outro meio 
 
 Mede a alteração do índice de refração do eluato ao passar o analito 
 Resposta universal 
 Baixa sensibilidade 
 Útil para análise de substâncias sem cromóforos 
 
 
Detectores 
Índice de refração 
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• A FM é evaporada em um spray por um gás (N2) de nebulização 
• A evaporação da FM em região com certa DDP, gera cargas na molécula do analito 
• A molécula carregada no analito é detectada no espectrômetro de massas 
 
 Eventualmente a molécula pode ser fragmentada 
 Os fragmentos gerados são característicos de cada substância 
Detectores 
Espectrometria de massas 
Detectores 
Espectrometria de massas 
 Aplicação universal 
 Fornece informação estrutural do analito 
 Massa molecular e/ou espectro de massas