Espectrofotometria: conceitos e aplicações

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Boa noite!
BCL 0308-15 Bioquímica: 
estrutura, propriedade e funções de biomoléculas
Prática 1: Espectrofotometria: conceitos e aplicações
Prof. Dr. Paulo de Avila Junior
A cor é uma propriedade do objeto, assim 
como textura e densidade? 
https://www.tricurioso.com/2019/03/17/por-que-os-tomates-ficam-vermelhos-quando-estao-maduros/
A cor não é uma propriedade do objeto
Parece preto
Atenção
A cor não é uma propriedade do objeto
https://www.youtube.com/watch?v=GDN8Uyw1uRI
Aspectos históricos
https://www.youtube.com/watch?v=IWTAIUiLJvk
Aristóteles
As cores eram 
propriedades 
dos objetos
Isaac Newton
As cores eram 
propriedades 
da luz e não 
dos objetos
Estudou a 
influência da 
luz do sol na 
formação das 
cores
Leonardo da Vinci
Difração da luz
https://br.pinterest.com/pin/532691462148785574/
Introdução à Prática 1
Análise qualitativa de proteínas em alimentos 
por meio de reação de complexação do íon 
cúprico
http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc35_1/06-EEQ-79-11.pdf
Reagente de biureto é uma solução com: 
hidróxido de sódio (NaOH) OH- Na+
sulfato de cobre (CuSO4) Cu2+ SO4
2-
estabilizador e antioxidante.
(https://labtest.com.br/wp-content/uploads/2016/09/FISPQ_Proteinas_Totais_Ref__99_Portugues.pdf).
CuSO4 anidro: pó fino acinzentado. Muito higroscópico.
https://www.labsynth.com.br/fispq/FISPQ-%20Sulfato%20de%20Cobre%20Anidro.pdf
https://www.facebook.com/Qua
litativaInorgUfrj/photos/a.91275
5995420140/18703933996563
90/?type=3
Biureto tem estrutura semelhante com proteínas, as 
quais ao interagirem com íons Cu2+ em meio alcalino, 
também resultando em uma solução de coloração violeta
http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc35_1/06-EEQ-79-11.pdf
Biureto
Biureto
Proteína Proteína
Método 2: reagente de Biureto
- identifique os tubos de ensaio com os valores das 
concentrações das soluções-padrão de albumina 
fornecidas, inclusive a desconhecida;
- Coloque 1,5 mL de solução de cada concentração de 
albumina em seu respectivo tubo (no tubo “branco” 
adicione 1,5ml de água).
Método 2: reagente de Biureto
- Adicionar 1,5 mL do reagente de Biureto e agitar 
levemente;
- Após 5 minutos, usar o ESPECTROFOTÔMETRO DE 
BANCADA com comprimento de onda 550nm.
Método 2: reagente de Biureto
No ESPECTROFOTÔMETRO DE BANCADA:
- Pegar o tubo do “BRANCO” e transferir para a cubeta. 
Limpar as faces de leitura da cubeta com papel macio 
e inserir a cubeta com o branco no espectrofotômetro. 
Este tubo deve ser utilizado para “zerar” a absorbância 
do espectrofotômetro.
Método 2: reagente de Biureto
- No ESPECTROFOTÔMETRO DE BANCADA:
- Em seguida, apenas ler as absorbâncias de cada um 
dos pontos da curva-padrão em ordem crescente de 
concentração, transferindo sucessivamente o conteúdo 
de cada um dos tubos de ensaios para a cubeta e 
limpando as faces da mesma com papel macio antes 
de efetuar a leitura. É só anotar os valores de 
absorbância que aparecem no visor, não é necessário 
apertar nenhum botão adicional.
Método 2: reagente de Biureto
- Lavar a cubeta com água destilada, secar bem 
batendo sobre o papel, transferir a amostra 
desconhecida e ler a absorbância no 
espectrofotômetro. Anote atentamente o valor de 
absorbância de cada solução na tabela.
Método 2: reagente de Biureto
- Anote atentamente o valor de absorbância de 
cada solução na tabela presente na apostila.
Fazer a análise dos dados (p.22)
Absorbância
https://www.youtube.com/watch?v=bgdbAyeorIk
Parece preto
https://biologiavegetal.com/aula-13-espectro-de-acao-dos-pigmentos-cloroplastidicos/
https://www.youtube.com/watch?v=IWTAIUiLJvk
Parece preto
https://biologiavegetal.com/aula-13-espectro-de-acao-dos-pigmentos-cloroplastidicos/
Absorção de luz de uma amostra que 
absorve luz (utilizada) medida em 
diferentes comprimentos de onda.
Espectro de 
absorbância: 
característico para 
cada amostra de 
substância que 
absorve luz.
Parece preto
Concentração na solução da substância absorvente 
é proporcional à quantidade de luz absorvida
https://cesad.ufs.br/ORBI/public/uploadCatalago/18025316022012Metodos_Instrumentais_de_Analise_-_Aula_02.pdf
Concentração 
crescente
Quanto maior a concentração, 
maior a absorbância (percepção 
de cor mais intensa na cubeta)
C I1
Dessa forma, a absorbância é direta e linearmente 
proporcional à concentração e com o caminho 
óptico (diâmetro interno) da cubeta. Ou seja, se 
dobrarmos o caminho óptico mantendo a concentração 
constante, teremos um valor de absorbância duas vezes 
maior. 
Essa relação é frequentemente referida como:
Lei de Lambert-Beer: A = a.b.c
Onde: A = absorbância, a = constante de absortividade, 
b = caminho óptico (em centímetros); c = concentração
Parece preto
https://cesad.ufs.br/ORBI/public/uploadCatalago/18025316022012Metodos_Instrumentais_de_Analise_-_Aula_02.pdf
Concentração 
crescente
Escolha do 
comprimento 
de onda
(x5 mais concentrado)
Prática 1
Determinação da [albumina] via:
Método 1, teórico (dados na apostila): absorbância 
de seus aminoácidos aromáticos e cistinas a 280nm.
Método 2, Biureto: formação de complexos com Cu2+ 
presentes na solução contendo reagente de biureto (e 
que absorvem luz com máximo em 550 nm).
Método 1
Construir uma curva-padrão a partir da tabela presente 
na apostila (b=1cm) e determinar o valor de ε 
(coeficiente angular) e utilizar da fórmula abaixo.
Favor um(a) integrante do grupo 
me encaminhar por e-mail até a 
próxima aula os resultados obtidos 
e as análises realizadas:
paulo.avila@ufabc.edu.br
Bons estudos!
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