Engenharia Enzimática_Cinética e inibição

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Engenharia Enzimática
Enzimas e Cinética das Reações Enzimáticas
Curso: Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia
UTFPR - Campus Toledo
Profª. Karina G. Fiametti Colombo
Profª. Dra. Karina G. Fiametti Colombo
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Profª. Dra. Karina G. Fiametti Colombo 2
Fundamentos da Cinética Enzimática
Evolução da Enzimologia:
1)Empírica: 4000 a 3000 a.C. – curtumes, coagulação do leite para 
produzir queijo
2)Descritiva: séc. XIX, atividade enzimática
3)Quantitativa: modelos matemáticos para quantificar a atividade 
enzimática (Michaelis-Menten, 1913)
4)Aplicada com planejamento: 1940: aperfeiçoamento e novas 
enzimas
❑ O estudo da cinética enzimática tem como objetivos:
1. Medir a velocidade 
das transformações que 
se processam
2. Estudar a influência de 
condições de trabalho - 
[reagentes], [enzima], T, pH, 
[ativadores] e [inibidores] 
nas velocidades
3. Correlacionar as velocidades 
das transformações com alguns 
dos fatores que as afetam (por 
meio de equações empíricas ou 
por meios de modelos 
matemáticos)
4. Colaborar na 
otimização do processo
5. Estabelecer critérios 
para o controle do 
processo
6. Projetar o reator mais 
adequado
Cinética Enzimática: estudo da velocidade das reações enzimáticas
Importância da Prática da Cinética Enzimática
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Supondo que no sistema que nos interessa:
❑ Seja possível medir a [S] ou de um dos 
produtos durante o desenvolvimento da 
reação a partir do início:
S → P + Q +....
E
Representação esquemática das variações das concentrações do 
substrato e do produto em função do tempo. Medidas das 
velocidades no instante ‘t’ e das velocidades iniciais (t=0).
Nota-se que as velocidades mudam ao longo do 
tempo – variação nas condições – importância da 
medida no inicio da reação – velocidade inicial (V0) 
(cond. exp. conhecidas)
Velocidade inicial = velocidade de consumo de ‘S’ ou de formação de ‘P’
Medida da Velocidade
4
Modelo cinético de Michaelis e Menten
❑ Ainda hoje é um dos mais aceitos com o objetivo básico de explicar a influência das [E] e de 
[S] na velocidade inicial da reação enzimática.
❑ Hipóteses básicas deste modelo:
I. O substrato e a enzima reagem reversivelmente entre si formando um composto 
intermediário denominado complexo enzima-substrato [ES];
II. O complexo formado ou se decompõe, ou reage com outra substância, regenerando a 
enzima e formando os produtos da reação.
Medida da Velocidade
5
REPRESENTAÇÃO DE UMA CATÁLISE ENZIMÁTICA SEGUNDO 
MICHAELIS E MENTEN
6
k1= constante de velocidade de formação do complexo;
k2= constante de velocidade de dissociação do complexo;
k3= constante de velocidade de decomposição do complexo 
formando o produto;
k4= constante de velocidade de formação do complexo
E + S → ES → E + P
k1

k2
k3 k4da equação obtida
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c) Equação de Eadie-Hofstee: Equação de Burk multiplicada por [VMAX]
V = − 𝐾𝑀
𝑉
[𝑆]
 + 𝑉𝑀Á𝑋
- KM
VMÁX
v
V/[S]
VMÁX 
KMy a x b
Fazer em casa a demonstração da equação obtida
❑ Outros métodos de linearização:
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Exemplo 3: Verifique os dados abaixo e encontre os valores de KM e VMáx. para os três métodos 
de linearização estudados.
S (mol/L) V (μmol/L.min)
0,0 0,0
15,0 0,13
24,0 0,19
30,0 0,23
45,0 0,31
70,0 0,43
90,0 0,50
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Solução:
[S] (mol/L)
V(umol/litro/mi
n)
Linewearver-Burk Hanes-Woolf
Eddie-
Hofstee
1/S 1/V S/V V/S
0 0 - - - -
15 0,13 0,0667 7,6923 115,3846 0,0087
24 0,19 0,0417 5,2632 126,3158 0,0079
30 0,23 0,0333 4,3478 130,4348 0,0077
45 0,31 0,0222 3,2258 145,1613 0,0069
70 0,43 0,0143 2,3256 162,7907 0,0061
37
Imprecisão para Km
y = 102,1307x + 0,9315
R² = 0,9992
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 0,1 0,1
Lineweaver-Burk
y = 0,8496x + 104,7531
R² = 0,9906
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
140,0
160,0
180,0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Hannes-Woolf
y = -118,77x + 1,1436
R² = 0,9828
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,0000 0,0020 0,0040 0,0060 0,0080 0,0100
Eddie-Hofstee
L-LB L-HW L-EH
KM 109,6 123,6 118,8
Vmáx 1,07 1,18 1,14
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sem inibidor
com inibidor
Representação gráfica da velocidade 
da reação com e sem inibidor
▪ Chama-se inibidor da reação enzimática uma substância que acarreta 
diminuição da velocidade da reação.
▪ Tipos de inibidores: Irreversível e Reversível.
▪ Tipos de inibidor reversível: competitivo, não competitivo, 
incompetitivo.
Inibição Enzimática
Esquema cinético para inibidores
enzimáticos reversíveis. 
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❑ Inibição Competitiva (Reversível)
I. Inibidor é muito semelhante ao substrato;
II. Inibidor liga-se ao sitio ativo da enzima e bloqueia o acesso do 
substrato a ele;
III. Inibidor COMPETE com o substrato pelo sítio ativo da 
enzima;
IV. Este tipo de inibição depende das concentrações de substrato
e de inibidor.
Importante: O aumento 
da concentração do 
substrato pode reverter 
o problema pois sua 
disponibilidade 
aumenta no meio.
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❑ Inibição Competitiva (Reversível)
1. O percentual de inibição resultante dependerá de dois 
fatores: [S] e [I competitivo] 
2. Afinidade diferencial da enzima pelo substrato e pelo 
inibidor Representação esquemática da aplicação do Método de 
Lineweaver-Burk ao caso de inibição competitiva
Km´ (com inibição)
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Ex.: Metanol/Etanol (Semelhança estrutural!) 
Nesse caso o inibidor só se liga à enzima livre
(com inibição)
Demonstração para exercício da lista
❑ Inibição Competitiva (Reversível)
Com [I] alta → Km aumenta
Linearização: invertendo ambos os lados , temos:
1
𝑉𝑖
=
𝐾𝑀 ( 1+
𝐼
𝐾𝑖
)
𝑉𝑚𝑎𝑥
 . 
1
𝑆
 + 
1
𝑉𝑚𝑎𝑥
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❑ Inibição Não Competitiva (Reversível)
I. Inibidor se liga à enzima em um sítio que não é o sítio ativo, provocando 
mudança na estrutura da enzima, especialmente em torno do sítio ativo;
II. Substrato ainda pode ligar-se ao sitio ativo, mas a enzima não pode 
catalisar a reação enquanto o inibidor estiver ligado a ela;
III. Aumento da [S] não diminui a inibição: não há competição.
Importante: O aumento da 
concentração do substrato 
não eliminará o problema,
não restituindo o valor de 
Vmax sem a inibição. 
48
O inibidor não compete com o substrato pelo sítio ativo, 
mas vai ocupar outro sítio da enzima (sítio regulativo ou de 
inibição).
A velocidade da reação enzimática neste caso, será: 
❑ Inibição Não Competitiva (Reversível)
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Representação esquemática da aplicação do Método de 
Lineweaver-Burk ao caso de inibição enzimática reversível 
não competitiva
Representação gráfica da inibição 
enzimática reversível não competitiva
Inibidor
Inibidor
❑ Inibição Não Competitiva (Reversível)
50a afinidade da enzima pelo substrato não muda, sítio ativo livre.
a enzima perde sua capacidade devido à nova ligação formada pelo 
inibidor em outro sítio.
Inibição Competitiva
Inibição Não Competitiva
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❑ Características das Inibições
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❑ Inibição Incompetitiva (Reversível)
I. Inibidor não se combina com a enzima livre, não afetando sua 
reação normal com o substrato;
II. Inibidor liga-se ao complexo ES formando ESI inativo, incapaz de 
sofrer a transformação em produto;
III. O grau de inibição aumenta com o aumento da [S].
Importante: O aumento da [S] aumenta 
a inibição pois o inibidor não se liga ao 
sítio ativo da enzima, mas ao composto 
[ES] formado. Isso retarda a quebra do 
composto [ES] à [E] + [P]. 
Representação esquemática da aplicação do 
Método de Lineweaver-Burk ao caso de inibição 
enzimática reversível incompetitivo
Representação gráfica da inibição 
enzimática reversível incompetitivo
Inibidor
Inibidor
❑ Inibição Incompetitiva (Reversível)
KM e Vmax se alteram: o inibidor não utiliza o sítio ativo, mas “confunde” a 
enzima ao induzi-la a uma ligação improdutiva com o substrato, resultando 
numa menor Vmax de reação e um maior KM
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❑ Tipos de Inibição Reversíveis e Comportamento nos Gráficos 
Linearizados
Reversível incompetitiva
Reversível competitiva
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❑ Inibição Irreversível
I. Inibidor se combina com a enzima livre, afetando irreversivelmente sua reação 
normal com o substrato; há uma ação direta no sítio ativo da enzima;
II. Complexo EI é inativo e irreversível;
III. Inibidor geralmente é um metal pesado.
IV. Não há um modelo para este caso - [E] ↓ e [EI] ↑
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São úteis como ferramentas no 
estudo de mecanismo de reação, 
principalmente para a 
identificação de aminoácidos 
importantes para a catálise no 
sítio ativo. 
Cinética de inibição similar ao 
inibidor não-competitivo 
(Vmáx diminui, Km não se 
altera). 
Inativadores suicidas: relativamente não 
reativos até que se liguem ao sítio ativo da 
enzima específica ---
Inativadores com base no mecanismo 
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❑ Inibição Irreversível
Aplicações de Inibição enzimática
• Importância Farmacêutica do estudo da inibição enzimática
• Inibidores enzimáticos são agentes moleculares que interferem na catálise, 
diminuindo ou acelerando a velocidade da reação… esse é o mecanismo de 
ação da grande maioria de agentes farmacêuticos. 
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percebeu-se que os 
inibidores da PDE5 
eram capazes de 
induzir o relaxamento 
dos músculos lisos da 
parede dos vasos e 
por esse motivo 
passaram a ser 
estudados para o 
tratamento de 
condições 
cardiovasculares. 
60
61
Aplicações
• Alopurinol: tratar Gota (acúmulo de ácido úrico nas articulações) e cálculos 
renais. Este atua inibindo irreversivelmente a enzima Xantina oxidase, que 
catalisa a oxidação de purinas em ácido úrico. Com isso, as altas concentrações 
de ácido úrico são diminuídas.
• Área ambiental:
• Biossensores para detecção de agentes nocivos, como organosfosforados que inibem a 
enzima acetilcolinesterase; compostos fenólicos, que depois de oxidados pela enzima 
tirosinase, inibe a enzima, e metais pesados que inibem a glicose oxidase.
Área alimentícia:
• Biossensores que se utilizam de inibição enzimática para detecção de 
glicoalcalódes, que podem causar envenenamento, efeitos teratogênicos e 
embriogênicos, sendo a acetilcolinesterase e butilcolinesterase as enzimas 
utilizadas,
• Detecção do ácido benzóico por tirosinase em maioneses e refrigerantes
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Exemplo 4: Que tipo de inibição ocorre neste caso?
Como calcular todas as constantes??
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Sem inibidor: 
VMAX = 1,11 μmol/L.min
KM = 119,25 μmol/L
Com inibidor:
VMAX = 0,38 μmol/L.min
KM = 41,24 μmol/L
Inibição 
Reversível 
Incompetitiva!!
65
y = 102,76x + 0,9005
R² = 0,9993
y = 109,64x + 2,6589
R² = 0,99670,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07
1
/V
1/S
Linearização de L-B
Sem inibidor
Com inibidor
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Obs.: kcat não é a melhor maneira de comparar a eficiência catalítica pois essas constantes são 
válidas para concentrações saturantes de substrato (não fisiológica). Em geral as enzimas 
trabalham em condições não saturantes de substrato (importante para a regulação) 
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Constante cinética aparente de 2ª ordem
68
 
Exercícios:
Utilize a equação de Michaelis-Menten para responder as questões abaixo: 
a) Qual a concentração de substrato para que uma enzima com kcat de 30,0 
s-1 e Km de 0,005 M opere com um quarto da velocidade máxima? 
b) Determine a fração de Vmáx que seria obtida nas seguintes 
concentrações de substrato: 1/2Km; 2Km e 10Km. 
c) Enzimas que catalisam a reação X↔Y são isoladas de 2 espécies de 
bactérias. As enzimas possuem a mesma Vmáx, mas diferentes valores de 
Km. A enzima A tem Km=2 μM e a enzima B tem Km=0,5 μM. Qual destas 
enzimas possui maior afinidade pelo substrato? 
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TAREFA: 
Procurar o mecanismo de ação do glifosato e descrever como 
esse herbicida exerce sua função sobre a atividade da 5-
enolpiruvilshiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS), e que tipo 
de inibição ocorre. 
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	Slide 33: Exemplo 2: Verifique os dados abaixo e encontre os valores de KM e VMáx.
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