Analise_Instrumental_Aula_2_24_09_2013_final (Cópia em conflito de MacBook-Air-de-Ana 2013-09-24)

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Introdução às separações
HPLC
Profa. Ana Carolina Costa
ana.costa@ufsc.br
Análise Instrumental 
Técnicas de Separação
CAL 410012
A FASE ESTACIONÁRIA em cromatografia é imobilizada em uma coluna ou sobre uma superfície plana.
A FASE MÓVEL em cromatografia movimenta-se através da fase estacionária transportando a mistura dos analitos. A fase móvel pode ser um gás, um líquido ou um fluido supercrítico. 
A ELUIÇÃO é um processo no qual os solutos são levados através da fase estacionária pelo movimento de uma fase móvel. A fase móvel que deixa a coluna é denominada eluato. 
 
Um ELUENTE é um solvente empregado para transportar os componentes de uma mistura através de uma fase estacionária. 
	
Conceitos 
Análise Instrumental – Técnicas de separação 
Profa. Ana Carolina Costa
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Conceitos 
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(a) Diagrama descrevendo a separação de uma mistura dos componentes A e B por eluição em cromatografia em coluna.
(b) O sinal do detector em vários estágios da eluição mostrados em (a)
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Conceitos 
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Perfis de concentração dos solutos A e B na coluna no t1 e mais tarde no t2  B é mais fortemente retido pela fase estacionária do que A, portanto B se atrasa durante a migração. 
A distância aumenta a medida que os dois se movem pela coluna. 
Alargamento das bandas = perda de eficiência
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Conceitos 
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Cromatograma original com picos sobrepostos
Melhoria proporcionada pelo aumento da separação das bandas
Melhoria proporcionada pela diminuição das larguras
Muitas variáveis físicas e químicas influenciam as velocidades das bandas e seu alargamento. Como consequência, melhores separações podem ser geralmente obtidas pelo controle de variáveis que aumentam a velocidade de separação das bandas ou diminuem a velocidade de alargamento delas. 
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A extensão do alargamento de uma banda depende do tempo que a FM fica em contato com a FE, o qual por sua vez depende da vazão da FM. 
VOLUME DE RETENÇÃO (VR) é o volume da fase móvel necessário para eluir o analito a uma dada vazão (F).
			 Volume de retenção, VR = tR F
VOLUME MORTO (VM) é o volume total de solvente na coluna entre as partículas da fase estacionária (partículas não porosas) e no interior dos poros das partículas (partículas porosas, tipo esponja). Portanto, se o tempo para que a fase móvel ou o soluto não retido passe pela coluna é tM, e a vazão é F:
 VM = tM F
	
Conceitos 
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FATOR DE RETENÇÃO*: o fator de retenção (k) é o grau de retenção de um componente da amostra na coluna, sendo definido como o tempo necessário para eluir o pico (tR) menos o tempo necessário para a FM passar através da coluna (tM).
Conceitos 
*Fator de capacidade em algumas referências.
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k = 
tR – tM 
 tM 
=
t‘R
 tM 
Rever!
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Um pico com k = zero, indica um componente não retido pela FE e eluído com o solvente. Portanto, quando k é  1, separação ruim, tR  tM.
Quando k é > 20 ou 30, a separação é lenta, indica que o soluto está altamente retido, apresentando tempos de eluição muito longos. Sendo de difícil detecção, uma vez que apresentam alargamento das bandas.
Na maioria das análises, os compostos eluem com k entre 1 e 20, então esses possuem “oportunidade suficiente” para interagir com a FE, resultando em uma migração diferenciada.
Separação ideal: k entre 1 e 5.
Conceitos – Fator de retenção 
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A eficiência de uma coluna cromatográfica em separar dois solutos depende em parte das velocidades relativas segundo as quais as duas espécies são eluídas. Essas velocidades, por sua vez, são determinadas pelas razões das concentrações dos solutos em cada uma das fases. 
Todas as separações cromatográficas estão baseadas em diferenças de extensão na qual os solutos são distribuídos entre as fases móvel e estacionária. Para o soluto de espécie A, o equilíbrio envolvido é descrito pela equação
A constante de equilíbrio K para essa reação é denominada constante de distribuição, a qual é definida como:
				
 	onde, [A]E e [A]M são a concentração do analito A na FE e FM, respectivamente. 
A (móvel)  A (estacionária)
Conceitos – Constante de distribuição
K = 
[A]E
[A]M
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Idealmente a constante de distribuição permanece invariável sobre uma faixa ampla de concentração do soluto; isto é, cE é diretamente proporcional a cM.
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Então, a distribuição do analito A é governada pela constante de distribuição (também chamada de coeficiente de partição), K. 
O fator de retenção (k) também pode ser descrito pela razão do número total de mols do analito em cada fase:
 , sendo 
Onde VE é o volume da fase estacionária e VM é o volume da fase móvel na coluna ou o volume morto. k é primariamente controlado pela força da fase móvel, a natureza da fase estacionária, e a temperatura em que a separação é realizada.					 OU SEJA,
Conceitos – Constante de distribuição
k = 
mols do soluto A na FE
mols do soluto A na FM
[A]E
[A]M
VE
VM
então, k = K
k = 
K = 
[A]E
[A]M
VE
VM
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Idealmente a constante de distribuição permanece invariável sobre uma faixa ampla de concentração do soluto; isto é, cE é diretamente proporcional a cM.
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Fatores que influenciam 
a retenção de um soluto 
A separação é efetuada tendo por base a afinidade química relativa de cada componente da amostra pelas fases móvel e estacionária.
Este parâmetro depende de:
Tipo e propriedades da fase estacionária
Tipo e propriedades da fase móvel
Forças intermoleculares:
Analito e fase móvel
Analito e fase estacionária
Temperatura
Forças de dispersão de London
(interações dipolo induzido – dipolo induzido)
Interações dipolo – dipolo induzido
Interações iônicas
Pontes de hidrogênio
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O fator de seletividade  (ou fator de separação) para os solutos 1 e 2 é definido como a razão entre a constante de distribuição do soluto mais retido (2) e a constante de distribuição para o soluto menos retido (1).
A seletividade deve 
	ser > 1,0 para que haja 
	a separação dos picos.
Seletividade é 
	dependente de muitos
	fatores que afetam K
	tal como a natureza da
	FE, composição da FM,
	e propriedades dos 
	solutos. 
Conceitos – Fator 
de separação (seletividade)
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K, constante de distribuição; k = fator de retenção 
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Exercícios:
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Em uma análise cromatográfica de ácido de baixo peso molecular, o ácido butírico elui com um tempo de retenção (tR) de 7,63 min. O tempo de retenção da fase móvel (tM) é 0,31 min. Calcule o fator de retenção (k) do ácido butírico. (23,6)
Na mesma análise cromatográfica para ácidos de baixo peso molecular do exemplo anterior, o tempo de retenção para o ácido isobutírico é 5,98 min. Qual o fator de separação (α) para o ácido butírico e isobutírico? (1,29)
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Conceitos – Resolução
A resolução Rs de uma coluna nos diz o quanto duas bandas se distanciam uma em relação a outra em comparação com as suas larguras. 
A resolução fornece uma medida quantitativa da habilidade da coluna em separar dois analitos. 
Rs =
 (tR)2–(tR)1
 w1 + w2 
2
Rs =
 (tR)2–(tR)1
 (w1 + w2)/2 
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Idealmente a constantede distribuição permanece invariável sobre uma faixa ampla de concentração do soluto; isto é, cE é diretamente proporcional a cM.
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Conceitos – Resolução
Análise Instrumental – Técnicas de separação 
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Idealmente a constante de distribuição permanece invariável sobre uma faixa ampla de concentração do soluto; isto é, cE é diretamente proporcional a cM.
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Conceitos – Resolução
Análise Instrumental – Técnicas de separação 
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Idealmente a constante de distribuição permanece invariável sobre uma faixa ampla de concentração do soluto; isto é, cE é diretamente proporcional a cM.
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Exercício
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3) 	Um pico com tempo de retenção de 407 s tem uma largura na base de 13 s. Um pico vizinho é eluído a 424 s com uma largura de 16 s. Encontre a resolução entre esses dois componentes. (1,17)
Idealmente a constante de distribuição permanece invariável sobre uma faixa ampla de concentração do soluto; isto é, cE é diretamente proporcional a cM.
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Conceitos – Descrição 
quantitativa da eficiência da coluna
TEORIA DOS PRATOS
MARTIN e SYNGE: em 1920 estabeleceram analogias entre a cromatografia, a destilação e a extração com solventes;
Consideraram que uma coluna cromatográfica consistia de vários estágios de extração líquido-líquido, ou pratos teóricos (termo emprestado da teoria da destilação, técnica popular na época)  sendo conhecido como teoria dos pratos. 
PRÊMIO NOBEL em 1952
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Análise Instrumental – Técnicas de separação 
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TEORIA DOS PRATOS
Entretanto, uma coluna cromatográfica não possui os pratos como na destilação, mas a fase estacionária é distribuída uniformemente, de maneira que vários estágios de equilíbrio entre a FE e a FM irão ocorrer.
Pela inexistência de pratos reais como em destilação, estes pratos foram denominados de pratos teóricos. 
Contudo, o modelo de pratos não é bem sucedido ao tentar explicar o alargamento das bandas, mas serve para explicar o formato gaussiano dos picos cromatográficos, bem como os fatores que influenciam as  nas velocidades de migração dos solutos.
Conceitos – Descrição 
quantitativa da eficiência da coluna
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Conceitos – Descrição 
quantitativa da eficiência da coluna
Dois termos relacionados são empregados amplamente para as medidas quantitativas da eficiência da coluna cromatográfica
 Altura de prato H
 Contagem de pratos ou número de pratos teóricos N
As duas estão relacionadas pela equação:
em que L é o comprimento (geralmente em cm) do recheio da coluna. 
A eficiência cromatográfica aumenta à medida que o número de pratos se torna maior, e, conforme a altura do prato H torna-se menor.
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H ou HETP = 
L
N
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A altura do prato, H, foi adaptado da teoria da destilação (já discutido anteriormente) , onde a separação pode ser feita em estágios discretos denominados pratos. A altura do prato também é conhecida como altura equivalente a um prato teórico (HETP ou H). Ela é, aproximadamente, o comprimento da coluna necessário para que o soluto atinja um equilíbrio entre as fases móvel e estacionária. 
Quanto menor a altura do prato, menor a largura da banda. 
A capacidade de uma coluna em separar os componentes de uma mistura aumenta com a diminuição da altura do prato. 
Dizemos que uma coluna eficiente tem mais pratos teóricos do que uma coluna ineficiente. 
H ou HETP=
L
N
Conceitos – Altura 
equivalente a um prato
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Idealmente a constante de distribuição permanece invariável sobre uma faixa ampla de concentração do soluto; isto é, cE é diretamente proporcional a cM.
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Solutos diferentes, passando através da mesma coluna, possuem alturas de pratos diferentes, pois possuem coeficientes de difusão diferentes.
H =
L
N
Conceitos – Altura 
equivalente a um prato
Curiosidade: as alturas dos pratos se situam na faixa de  0,1 a 1 mm na CG,  10 µm na HPLC e– Técnicas de separação 
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Eficiência cromatográfica
CAMINHOSMÚLTIPLOS
termo A
DIFUSÃO
LONGITUDINAL
termo B
TRANSFERÊNCIA DE MASSA
NA FASE MÓVEL
termo Cm
TRANSFERÊNCIA DE MASSA NA FASE ESTACIONÁRIA
termo Cs
H = A + B/u + (CE + CM) u
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EQUAÇÃO de van DEEMTER
o termo A (caminhos múltiplos)
A = 2 l dP
Detector
Sinal detectado
Tempo
Uma vez que diferentes moléculas do mesmo soluto tomam diferentes caminhos, elas chegarão ao final do leito em diferentes tempos, e a zona como um todo vai se alargar. Por que o leito cromatográfico apresenta caminhos irregulares. 
o diâmetro da partícula
 caminhos múltiplos de fluxo
l: constante que depende da qualidade do enchimento da coluna 
Página 888 do Skoog as extensões desses caminhos podem diferir
significativamente; assim, os tempos de residência na coluna para moléculas
da mesma espécie são também variáveis. As moléculas do soluto
atingem o final da coluna após um certo intervalo de tempo, o que leva a
um alargamento de banda. Esse efeito dos múltiplos caminhos, que às
vezes é denominado eddy diffusion, deveria ser independente da velocidade
do solvente se este não fosse parcialmente afetado pela difusão
ordinária, a qual leva as moléculas a ser transferidas de uma corrente que
segue um determinado caminho para outra que percorre outra rota. Se a
velocidade de fluxo é muito baixa, um grande número dessas transferências
vai ocorrer e cada molécula vai experimentar numerosos caminhos ao
se deslocar pela coluna, permanecendo um breve intervalo de tempo em
cada um deles.
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EQUAÇÃO de van DEEMTER
o termo B/u (difusão longitudinal)
B/u = (2 g DM) / u
as moléculas da amostra irão difundir de uma região de maior concentração (banda inicial ou centro da zona) para uma região de concentração menor.
contribuição da difusão longitudinal é inversamente proporcional à velocidade da fase móvel: com o aumento de u, soluto permanece na coluna por períodos mais curtos (difusão tem menos tempo para ocorrer). 
: constante que depende da qualidade do enchimento da coluna 
DM: coeficiente de difusão do soluto na FM
a grandeza do termo B é predominantemente determinada pelo coeficiente de difusão DM do analito na fase móvel e é diretamente proporcional a essa constante. 
Em cromatografia, a difusão longitudinal resulta na migração do
soluto do centro da banda (na qual a concentração é maior) para as
regiões mais diluídas de qualquer lado (isto é, na direção do fluxo e na
direção oposta do fluxo). A difusão é uma fonte comum de alargamen-to de banda em cromatografia gasosa, na qual a velocidade dedifusão
das moléculas é alta. O fenômeno é de pequena importância em cro-matografia líquida, na qual as velocidades de difusão são muito
menores. Como mostrado pela Equação 30-27, a contribuição da difusão longitudinal na altura do prato é
inversamente proporcional à velocidade linear do eluente. Essa relação não é surpreendente, uma vez que
o analito permanece na coluna por um período mais breve quando a vazão é alta. Assim, a difusão a par-tir do centro da banda para as duas laterais tem menos tempo para ocorrer.
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EQUAÇÃO de van DEEMTER
o termo C (coeficientes de transferência de massa na FM)
ao passar no interstício de partículas, as moléculas que viajam perto das paredes da fase estacionária terão velocidades menores daquelas que viajam no centro.
a velocidade da fase móvel aumenta o valor de H, porém, o diâmetro da partícula contribui ainda mais por estar ao quadrado.
 CM u = (f(k) dp2 / DM) u
o termo C (coeficientes de transferência de massa na FE)
 CE u = (f(k) df2 / DE) u
após a difusão das moléculas dentro do poro, elas penetram na FE ou se ligam a ela por algum mecanismo. Se algumas penetram mais profundamente dentro da FE, também demorarão mais a sair e consequentemente se atrasarão em relação a outras e como consequência o pico se alargará.
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0,0060
0,0040
0,0020
0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
H, cm
u, cm/s (velocidade da fase móvel)
CM u 
H = A + B/u + (CE + CM) u
l, : constantes que dependem da qualidade do recheio
DS, DM: coeficientes de difusão do soluto na fase estacionária e móvel, respectivamente
dp, df: diâmetro da partícula e espessura do filme que recobre o suporte da fase estacionária
EQUAÇÃO de van DEEMTER
CE u 
H
B/u 
Contribuição dos vários termos de transferência de massa para a altura do prato. 
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High Performance Liquid Chromatography
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Cromatografia a líquido 
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HPLC
“HPLC usa pressões elevadas para forçar a passagem do solvente através de colunas fechadas que contém partículas muito finas capazes de proporcionar separações muito eficientes (com alta resolução)”. Daniel C. Harris.
Cromatografia líquida de alta eficiência
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Recipientes contendo fase móvel que será bombeada dentro do sistema analítico. 
Características desejadas para reservatórios de FM são:
Reservatórios com capacidade de 1 a 2 L, vidro (borossilicato) ou 
	dependendo da FM – outro polímero conveniente ou teflon;
Sua tampa deve conter furos para a passagem de tubulações, 
	as quais servirão de canal de passagem de fase móvel 
	(linha de solvente). A superfície livre dos furos deve ser a menor possível a fim de evitar a difusão de solvente para a atmosfera;
É comum proceder-se a desgaseificação da FM, com a intenção de eliminar gases nela dissolvidos que poderão, principalmente na bomba, criar bolhas, causando aumento do ruído da linha de base;
A linha de solvente deve possuir obrigatoriamente um filtro para reter partículas sólidas porventura existente – vidro sinterizado.
Instrumentação
reservatório da fase móvel e sistemas de tratamento de solvente
Instrumentação
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Equipados com dispositivo para remoção de gases dissolvidos (evitar formação de bolhas: causam alargamento ou interferem na eficiência do detector) 
Desgaseificadores:	bomba de vácuo
	dispositivos para aquecimento e agitação do 	solvente
	borbulhamento de gases inertes (He ou N2) junto com 	agitação
Câmara de mistura: eluições em gradiente
Solventes misturados à soluções tampão  altas concentrações de ácidos orgânicos e sais devem ser evitadas  corrosão da bomba e outras partes do equipamento; precipitação de sais, etc. 
reservatório da fase móvel e sistemas de tratamento de solvente
Instrumentação
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sistemas de bombeamento
REQUISITOS:
pressões de até 10 000 psi ( 690 bars)
a maioria das partes de uma bomba de LC que entram em contato com a FM são construídas de aço inoxidável
vazão contínua, sem pulsos (ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos)
vazões de 0,01 a 10 mL/min (aplicações analíticas) e até 100 mL/min (aplicações preparativas)
devem ser capazes de pressurizar os solventes com precisão e exatidão (melhor que 0,5 %)
devem ser compatíveis com ampla faixa de fluxo do solvente, fáceis de trocar de solvente, e atender aos gradientes de eluição
2 TIPOS:
bombas de pressão (ou pneumáticas)  recheio de colunas (gera elevadas pressões)
bombas mecânicas: recíprocas  mais utilizadas (equipamentos comerciais)
 deslocamento (tipo seringa)  reservatório da FM
Instrumentação
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bombas recíprocas
2 válvulas(esferas de safira) são abertas e fechadas alternadamente para controlar a vazão de solvente dentro e fora do cilindro; solvente está em contato direto com o pistão
VANTAGENS:
pequeno volume interno (35 a 400 mL)
pressões elevadas de saída (até 10000 psi)
fácil adaptação a eluição em gradiente
vazão constante
fluxo independe da pressão de retorno da coluna e da viscosidade do solvente
DESVANTAGENS:
fluxo pulsado que deve ser amortecido (ruído de fundo na linha de base)
pistão recíproco
vedação
coluna
amortecedor de pulso
válvulas de controle do tipo bola
solvente
motor
Instrumentação
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tipos de eluição
Isocrática: A composição da fase móvel (%) permanece constante durante toda a análise cromatográfica. É realizada com um único solvente ou mistura constante de solventes.
Gradiente: Ocorre alterações da composição da fase móvel (%) durante a execução da análise.
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Instrumentação
sistema de injeção de amostras
fator limitante da precisão: repetibilidade da injeção
volumes devem ser pequenos (evitar alargamento de banda e sobrecarga da coluna, “overload”): US$ 1000) 
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Instrumentação
colunas
	Descrição	Polaridade/ interação
	Octadecil (C18)	Altamente apolar
	Octil (C8)	Moderadamente apolar
	Etil (C2)	Fracamente apolar
	Metil (C1)	Fracamente apolar
	Fenil (PH)	Moderadamente apolar
	Cicloexano (CH)	Moderadamente apolar
	Cianopropil (CN)	Moderadamente apolar/polar
	Diol ( 2 OH)	Polar
	Sílica (Si)	Polar
	Ácido Carboxílico (CBA)	Troca catiônica fraca
	Ácido Propilsulfônico (PRS)	Troca catiônica forte
	Ácido Benzenossulfônico (SCX)	Troca catiônica forte
	Aminopropil (NH2)	Troca aniônica fraca/polar
	Amina Primária/Secundária (PSA)	Troca aniônica fraca/polar
	Dietilaminopropil (DEA)	Troca aniônica fraca/polar
	Amina Quaternária (SAX)	Troca aniônica forte
	Ácido Fenilborônico (PBA)	Covalente
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Instrumentação
colunas
Colunas analíticas: em geral de 10 a 30 cm; 4 a 10 mm diâmetro com partículas de 1,8, 3, 5 e 10 mm (60 000 pratos/m)
Colunas de guarda ( de pré-coluna): introduzida antes da coluna de separação para aumentar a vida útil desta
	remove material particulado e contaminantes provenientes do solvente 	(que se ligam irreversivelmente a FE)
	
	serve para saturar a fase móvel com fase 
	estacionária minimizando a sangria da coluna
	composição deve ser similar a da coluna analítica, com tamanho de 	partícula em geral maior (minimizar queda de pressão)
Termostatização: em geral coluna é operada a temperatura ambiente; no entanto, cromatogramas de melhor qualidade são obtidos quando a temperatura da coluna é controlada; fornos aquecidos até 150 C estão disponíveis
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Instrumentação
características de um detector
Monitoramento do eluente que sai da coluna
ESTRATÉGIAS:
medidas diferenciadas de propriedades gerais de ambas, amostras e fase móvel
medidas de uma propriedade da amostra que não é apresentada pela fase móvel
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Instrumentação
características de um detector
Detectabilidade adequada: nem sempre é desejável, deve ser compatível com a concentração do analito na amostra 
Resposta linear para os solutos que se estenda por várias ordens de grandeza: faixa linear é aquela região da curva de calibração que se ajusta bem a uma reta
Baixo volume interno: grande volume pode gerar alargamento das bandas geradas
Tempo de resposta curto: detectores com respostas lentas geram bandas deformadas (baixa e larga) e com cauda longa.
Boa estabilidade e reprodutibilidade: aumenta a confiabilidade nos resultados.
Não deve ser destrutivo: permite coletar frações e utilizar detectores em linha.
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Instrumentação
tipos de detectores
2 TIPOS BASICAMENTE: SELETIVO versus UNIVERSAL
Os detectores em cromatografia líquida são de 2 tipos:
DETECTORES DE PROPRIEDADES UNIVERSAIS: respondem às propriedades da fase móvel como um todo, como índice de refração, constante dielétrica ou densidade, a qual é modulada pela presença do soluto.
DETECTORES DE PROPRIEDADE DO SOLUTO ou SELETIVOS: respondem a algumas propriedades do soluto (absorvância no UV-vis, fluorescência ou corrente de difusão, que não incluem a fase móvel.
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Instrumentação
parâmetros de desempenho
sensibilidade: relação entre o sinal produzido e a quantidade de amostra que gera este sinal (termo relativo, depende da amostra)
linearidade: faixa linear do sistema onde o sinal do detector é diretamente proporcional à concentração do soluto; se concentração da amostra é muito alta (diluições apropriadas) 
limite mínimo de detecção: menor quantidade da substância que pode ser detectada, produzindo um sinal igual ao triplo do nível de ruído do instrumento; ruído é a variação do sinal do instrumento que não é atribuída à amostra e pode ser produzida por falhas eletrônicas, aparelhos mal aterrados, variações de vazão ou temperatura, flutuações na tensão, bolhas de ar no detector, componentes da matriz, etc.
variações na composição da fase móvel podem produzir grandes flutuações na linha de base, principalmente nos casos de eluição por gradiente 
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Instrumentação
detectores de absorvância
PRINCÍPIO: absorvância da luz por parte da amostra ao passar através desta qualquer radiação eletromagnética (normalmente do ultravileta até o infravermelho) 
resposta seletiva: só detecta os componentes da amostra que absorvem a radiação no comprimento de onda selecionado; grande maioria das substâncias absorvem radiação UV (substâncias com elétrons  ou elétrons desemparelhados), por exemplo:
Olefinas ( hidrocarboneto alifático, ou seja, de cadeia aberta, apresentando pelo menos uma ligação dupla entre os carbonos – alcenos), compostos aromáticos e compostos contendo >C=O, >C=S, -N=O e –N=N-
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Instrumentação
detectores de absorvância
volume é mantido pequeno para minimizar alargamento de banda: 1-10 mL
comprimento: 2-10 mm
Pdesejáveis
alto grau de pureza ou de fácil purificação (permitir alta sensibilidade nos detectores de absorvância ou fluorescência)
dissolver a amostra sem decompor os seus componentes (se possível, solvente da amostra é a própria fase móvel)
não decompor ou dissolver a fase estacionária (uso da pré-coluna para saturação da fase móvel com fase estacionária; fase ligada ou sólida dispensam esse procedimento)
ter baixa viscosidade (favorecer transferência de massa)
ser compatível com o tipo de detector utilizado (particularmente importante na eluição por gradiente)
ter polaridade adequada para permitir separação conveniente dos componentes da amostra
Fase móvel
características desejáveis
SOLVENTE ÍNDICE DE VISCOSIDADE PONTO DE ÍNDICE DE FORÇA DO
 REFRAÇÃO cP EBULIÇÃO C POLARIDADE ELUENTE*
n-Hexano
CCL4
Éter dietílico
THF
Clorofórmio
Etanol
Acetato de etila
MeOH
ACN
Etileno glicol
Água
1,.372
1,457
1,350
1,405
1,433
1,359
1,370
1,326
1,341
1,431
1,333
0,30
0,46
0,54
0,34
0,89
81
66
65
82
100
0,04
4,0
5,1
5,8
10,2
-0,2
0,57
0,95
0,65
grande
*sobre Al2O3
Tipo mais utilizado de cromatografia, na qual a FE é um segundo líquido que é imiscível com o líquido da FM.
Líquido-líquido: o líquido estacionário é mantido por adsorção física. 
 Fase ligada: o líquido estacionário encontra-se quimicamente ligado, resultando em recheios altamente estáveis, insolúveis na FM – compatíveis com as técnicas de eluição por gradiente. 
 Mais de 90% das análises atuais são realizadas com fase ligada.
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Cromatografia por partição
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Cromatografia de partição
Fase ligada
Si
OH
silanol livre
••
Si-OH + R3SiCl Si-O-Si-(CH3)2R + HCl
Ciano (-C2H4CN)
Diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH)
Amina (–C3H6NH2)
R = 
A superfície da sílica completamente hidrolisada (por aquecimento com HCl 0,1 mol L-1 por um ou dois dias) é constituída de grupos silanóis quimicamente reativos.
Os recobrimentos com fase ligada mais empregados são os siloxanos formados pela reação da superfície hidrolisada da sílica com um organoclorossilano.
Análise Instrumental – Técnicas de separação 
Profa. Ana Carolina Costa
Cromatografia de partição
Fase normal: 
fase estacionária polar;
fase móvel menos polar que a FE (n-alcanos, clorofórmio, acetato de etila);
solutos neutros;
polaridade soluto  t. retenção;
mecanismo retenção: adsorção.
fase normal x fase reversa
Análise Instrumental – Técnicas de separação 
Profa. Ana Carolina Costa
Cromatografia de partição
Fase normal
Nos trabalhos pioneiros usou-se fases altamente polares, como trietilenoglicol adsorvidos sobre sílica ou alumina e solventes apolares, como hexano ou éter isopropílico, eram usados como fase móvel; por razões históricas, este tipo de cromatografia é chamado de fase normal
Em fase normal, o componente menos polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase móvel; aumentando a polaridade da fase móvel tem o efeito de diminuir o tempo de eluição.
Polaridade do soluto: a > b > c
c
b
a
tempo
c
b
a
tempo
Polaridade da fase móvel
Análise Instrumental – Técnicas de separação 
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Cromatografia de partição
Fase normal
Partícula de sílica – partículas uniformes, porosas, mecanicamente rígidas, tendo comumente diâmetros de 3 a 5 µm.
Análise Instrumental – Técnicas de separação 
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Cromatografia de partição
fase normal x fase reversa
Fase reversa: 
fase estacionária apolar (geralmente um HC);
fase móvel é um solvente relativamente polar (tampões, água, metanol, acetonitrila, THF);
solutos apolares, não-iônicos;
polaridade f. móvel  t. retenção;
mecanismo retenção: interações apolares com radicais da coluna.
Análise Instrumental – Técnicas de separação 
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Cromatografia de partição
fase reversa
Na cromatografia de fase reversa, a fase estacionária é apolar, um hidrocarboneto por exemplo (C18) e a fase móvel é relativamente polar (água, metanol, acetonitrila, etc)
Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase móvel; aumentando-se a polaridade da fase móvel aumenta-se o tempo de eluição
Polaridade do soluto: a > b > c
a
b
c
tempo
a
b
c
tempo
Polaridade da fase móvel
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Análise Instrumental – Técnicas de separação 
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Cromatografia de partição
fase reversa
Fase ligada
Análise Instrumental – Técnicas de separação 
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Cromatografia de partição
fase reversa
Fase ligada
Análise Instrumental – Técnicas de separação 
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Cromatografia de partição
fase reversa
Si-OH + R3SiCl Si-O-Si-R3 + HCl
Si-O-SiR2
Si-O-SiR2
Si-O-SiR2
Si-O-SiR2
soluto
cadeias do hidrocarboneto (C18)
partição (solubilização)
Obs. nas fases ligadas, tem-se também a possibilidade de adsorção do soluto devido aos sítios ativos (silanóis residuais)
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Cromatografia de partição
fase reversa
A sílica tem aproximadamente 8 M de grupos Si-OH por m2. A cobertura superficial por silanização esta limitada a 4 M devido a efeitos estéricos. Os Si-OH restantes são prejudiciais causando alargamento das bandas devido a polarização da superfície. Principalmente na análise de analitos básicos. Reação com trimetilsilano (efeito estérico reduzido -CH3) minimiza o problema (encapados) 
Análise Instrumental – Técnicas de separação 
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Fase móvel
tipos de eluição
Isocrática: A composição da fase móvel (%) permanece constante durante toda a análise cromatográfica. É realizada com um único solvente ou mistura constante de solventes.
Gradiente: Ocorre alterações da composição da fase móvel (%) durante a execução da análise.
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Fase móvel
tipos de eluição
A eluição isocrática é feita com um único solvente (ou mistura de solventes). Se um solvente não propiciar uma eluição suficientemente rápida de todos os componentes, então pode ser utilizada uma eluição por gradiente.
Análise Instrumental – Técnicas de separação 
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Fase móvel
tipos de eluição
Separação isocrática por HPLC de uma mistura de compostos aromáticos a 1 mL/min em uma coluna C18. Solvente A: água; solvente B: acetonitrila (pH 3,5 aj. com KH2PO4)
1) Álcool benzílico
2) Fenol
3) 3’-4’-dimetoxia
cetofenona
4) benzoína
5) Benzoato de etila
6) Tolueno
7) 2,6-dimetoxi
tolueno
8) ortometoxi
bifenila
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Fase móvel
ISOCRÁTICO
Em uma separação em fase reversa, a força do eluente diminui quando o solvente se torna mais polar. 
força 
Compostos eluídos + rápidos 
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Fase móvel
ISOCRÁTICO
Análise Instrumental – Técnicas de separação 
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Fase móvel
ISOCRÁTICO
duas horas de corrida cromatográfica
Análise Instrumental – Técnicas de separação 
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Fase móvel
tipos de eluição
Com base nas eluições isocráticas foi elaborado o gradiente a seguir.
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Fase móvel
GRADIENTE
Análise Instrumental – Técnicas de separação 
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Fase móvel
tipos de eluição
Pode haver várias formas de se separar um dado conjunto de analitos, entretanto algumas informações são essenciais para determinação do modo de operação
ESCOPO DA CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO
Figura 28-1 Skoog p642 vp
espécies MM>104: cromatografia por exclusão
espécies iônicas de baixa MM: cromatografia por troca iônica
espécies pequenas e polares,mas não-iônicas: métodos de partição (série homóloga)
espécies não-polares: cromatografia por adsorção (isômeros estruturais, hidrocarbonetos alifáticos)
TROCA IÔNICA
PARTIÇÃO
ADSORÇÃO
fase normal
fase reversa
EXCLUSÃO
filtração em gel
permeação em gel
insolúvel em água solúvel em água
não-polar iônico 
polar não-iônico 
POLARIDADE DO SOLUTO
102
103
104
105
106
massa molecular
Conceitos 
TEMPO DE RETENÇÃO (tR): é o tempo decorrido entre a injeção da amostra e o aparecimento do pico do soluto no detector de uma coluna cromatográfica.
tR = tE + tM
TEMPO MORTO ou tempo de retenção da FM (tM ou t0): é o tempo necessário para que um soluto não retido passe através de uma coluna cromatográfica. 
TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO (t’R): é igual a (tR – tM), ou seja, o tempo que o soluto permanece na fase estacionária. Então 
	tR = t’R + tM ou o tempo de retenção, é o tempo total que o soluto permanece na FE (t’R) e na FM (tM), então: t’R = tE
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Relembrando alguns conceitos
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Onde: 	tR = tempo de retenção
	t’R = tempo de retenção ajustado
	t0 = volume morto
	Wb = largura da base do pico em unidade de tempo
	W1/2 = largura a meia altura em unidade de tempo
Inject
W1/2 
Wb
t0 ou tM
Cromatograma
t’R
Constante de distribuição: constante de equilíbrio para a distribuição do soluto A entre as duas fases (móvel e estacionária) 
A constante de distribuição pode ser manipulada dentro de limites pela escolha apropriada da fase móvel, da fase estacionária ou de ambas. Podemos alterar a razão molar das duas fases pelo ajuste do volume da fase.
Fator de retenção: parâmetro experimental importante amplamente usado para comparar as velocidades de migração dos solutos nas colunas. A razão pela qual k é tão útil é que ele não depende da geometria da coluna ou da vazão. Isso significa que para uma dada combinação de soluto, FM e FE em qualquer coluna, com qualquer geometria e operando em qualquer vazão de FM se dará o mesmo fator de retenção, definido como:
			 ou
Relembrando alguns conceitos
Análise Instrumental – Técnicas de separação 
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A (móvel)  A (estacionária)
K = 
[A]E
[A]M
K = 
nE/VE
nM/VM
k = K
VE
VM
k = 
tR – tM 
 tM 
=
t‘R
 tM 
Separação ideal: k entre 1 e 5.
Fator de separação: é uma medida da retenção relativa k2/k1 de dois componentes da amostra. Onde k2 e k1 são os fatores de retenção para os solutos 2 e 1, respectivamente. 
A substituição da Eq. para os dois solutos na Eq. 
resulta em uma expressão que permite a determinação de  a partir de um cromatograma obtido experimentalmente. 
Relembrando alguns conceitos
Análise Instrumental – Técnicas de separação 
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 = 
k2
k1
k = 
tR – tM 
 tM 
 = 
k2
k1
 = 
(tR)2 – tM 
 (tR)1 – tM 
Descrição quantitativa da eficiência da coluna: a eficiência da coluna cromatográfica aumenta à medida que o número de pratos N torna-se maior e à medida que a altura de prato H torna-se menor.
A origem dos termos “altura de pratos” e “número 
de pratos” encontra-se em um estudo teórico 
pioneiro, feito por Martin e Synge, no qual eles 
trataram uma coluna cromatográfica como se 
fosse similar a uma coluna de destilação que, 
em vez de ser constituída por numerosos pratos 
discretos, apresentava camadas estreitas e 
contínuas denominadas pratos. Considera-se que 
em cada prato ocorre o equilíbrio do soluto entre
FM e FE. O movimento do soluto através da 
coluna é, então, tratado como transferência em 
etapas da FM em equilíbrio de um prato para o próximo.
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H = 
L
N
Relembrando alguns conceitos
N 
Onde: 
L = comprimento da coluna
H = altura do prato
Determinação experimental de H e N: o número de pratos pode ser calculado a partir de duas medidas de tempo, tR e wb; para obter H, o comprimento do recheio da coluna L também deve ser conhecido. 
Como as determinações experimentais de H e N descritos são baseadas em picos cromatográficos Gaussianos, os cálculos são considerados estimativas.
Análise Instrumental – Técnicas de separação 
Profa. Ana Carolina Costa
Relembrando alguns conceitos
N = 16 
tR
wb
2
N = 5,546 
tR
w ½ 
2
Cromatografia planar e de coluna
Análise Instrumental – Técnicas de separação 
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EQUAÇÃO de van DEEMTER
B/u = (2 g DM) / u
Em cromatografia, a difusão longitudinal resulta na migração do
soluto do centro da banda (na qual a concentração é maior) para as
regiões mais diluídas de qualquer lado (isto é, na direção do fluxo e na
direção oposta do fluxo). A difusão é uma fonte comum de alargamen-to de banda em cromatografia gasosa, na qual a velocidade dedifusão
das moléculas é alta. O fenômeno é de pequena importância em cro-matografia líquida, na qual as velocidades de difusão são muito
menores. Como mostrado pela Equação 30-27, a contribuição da difusão longitudinal na altura do prato é
inversamente proporcional à velocidade linear do eluente. Essa relação não é surpreendente, uma vez que
o analito permanece na coluna por um período mais breve quando a vazão é alta. Assim, a difusão a par-tir do centro da banda para as duas laterais tem menos tempo para ocorrer.
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