Biofilmes - Microbiologia

Prévia do material em texto

Instituto Federal Goiano - Campus Rio Verde
MICROBIOLOGIA: Biofilme na Indústria de Alimentos
Acadêmica: Thalyta do Prado Carvalho
Rio Verde
Novembro 2014
INTRODUÇÃO
Apesar dos recentes avanços tecnológicos e científicos nas indústrias de alimentos, observa-se a ocorrência de enfermidades de origem alimentar, devido à ingestão de produtos contaminados por microrganismos patogênicos.
Na indústria, os microrganismos podem se aderir a resíduos orgânicos e inorgânicos presentes na superfície de equipamentos e utensílios, caso o processo de higienização seja aplicado incorretamente. O biofilme, por exemplo, é uma comunidade cooperativa e estruturada de microorganismos que estão embutidos em uma matriz auto produzida que está associada com uma superfície. Células sésseis, presentes no biofilme, além de reduzir a eficiência e vida útil de equipamentos, em função do fenômeno denominado corrosão microbiologicamente induzida, são mais resistentes ao processo de desinfecção.
O objetivo deste trabalho é descrever a formação e caracterização de biofilmes, ressaltando os principais aspectos de importância na indústria de alimentos, e os métodos de prevenção de biofilmes disponíveis.
CONCEITO, ESTRUTURA E COMPOSIÇÃO DE BIOFILMES
Um biofilme consiste em um complexo ecossistema microbiológico formado por populações desenvolvidas a partir de uma única ou de múltiplas espécies, sejam bactérias, fungos e/ou protozoários de modo isolado ou em combinação, associados a seus produtos extracelulares constituindo uma “crosta” de polímeros orgânicos que se encontram aderidos a uma superfície, podendo se desenvolver em qualquer superfície úmida, seja ela biótica (formada por espécies vivas) ou abiótica (minerais). 
Os biofilmes podem existir como agregados mais ou menos confluentes, em camadas únicas ou arquiteturas tridimensionais¹.
Contém partículas de proteínas, lipídeos, fosfolipídeos, carboidratos, sais minerais e vitaminas, entre outros, que formam uma matriz, abaixo da qual, os microrganismos continuam a crescer, formando um cultivo puro ou uma associação com outros microrganismos, e aumentando a proteção contra agressões químicas e físicas².
Observa-se na sua composição que água é a fração mais significativa, podendo chegar a 97% da matriz do biofilme. Os microrganismos, por sua vez, representam somente pequena parte, frequentemente 2 a 5% da matriz do biofilme, embora excretem substâncias poliméricas que predominam na matéria orgânica da massa seca do biofilme.
Diversos fatores contribuem para a adesão de uma bactéria à determinada superfície e dependem não apenas da fisiologia do microrganismo e seus fatores de crescimento, mas também da natureza do substrato³. Dentre estes se destacam: a genética, a virulência e a resistência do microrganismo; a nutrição; a área e o material da superfície e a velocidade do fluxo de líquidos4.
Para a adesão ocorrer devem existir forças atrativas entre a célula e a superfície, e evidentemente essas forças devem ser mais fortes que as repulsivas. Dentre as forças atrativas relacionadas à adesão estão as eletrostáticas, força de Van der Waals, interações hidrofóbicas e ligações químicas. Em suma, o crescimento de qualquer biofilme é limitado pela disponibilidade de nutrientes no ambiente circundante e pela sua propagação às células localizadas no interior do biofilme. Fatores como o pH, difusão de oxigênio, fonte de carbono e osmolaridade controlam também a maturação do biofilme. Quando completamente maduro, o biofilme funciona como um consórcio funcional de células, com padrões de crescimento alterados, cooperação fisiológica e eficiência metabólica. Nesta fase, as células localizadas em regiões diferentes do biofilme exibem diferentes padrões de expressão genética5.
FORMAÇÃO E ETAPAS DE DESENVOLVIMENTO DE BIOFILMES
As bactérias do biofilme possuem a mesma origem genética das bactérias planctônicas, entretanto, suas atividades bioquímicas diferem em 40%, o que as torna mais difíceis de serem eliminadas, pela maior resistência adquirida4.
A formação de biofilmes inicia-se com a adsorção de moléculas orgânicas ou inorgânicas a superfície, formando o filme condicionante. Em instalações de indústrias alimentícias, resíduos proteicos, lipídicos e de carboidratos, oriundos de produtos derivados do leite ou de carnes, são elementos importantes para formar a camada condicionante.
Esses resíduos, aderidos aos equipamentos e utensílios, em razão de falhas no procedimento de higienização, são fontes potenciais de contaminação. A fixação de células livres provenientes do meio líquido nas superfícies sólidas ocorre em seguida, poucos minutos após o transporte e adsorção de substâncias orgânicas e inorgânicas dissolvidas no meio aquoso. Microrganismos, em seu estilo de vida planctônico, recebem algum estímulo que os leva a aderir em alguma superfície. Embora esse processo necessite de maior elucidação, alguns fatores possíveis de influenciá-lo já são descritos: pH, concentração e biodisponibilidade de nutrientes, auto indutores de quorum sensing, presença de compostos orgânicos, inorgânicos e temperatura. Propriedades da superfície da célula, como presença de flagelo, fimbrias, pili, proteínas adesinas, lipopolissacarideos, acido lipoteicoico e cápsula, influenciam na aderência á superfície6.
Existem várias teorias propostas para formação de biofilmes. A primeira teoria foi descrita pôr MARSHALL, et al. (1971)7, e ressalta que a adesão é um processo que ocorre em duas fases; na primeira fase, o processo é ainda reversível, em função do processo de adesão do microrganismo na superfície ocorrer por forças de Van der Walls e atração eletrostática. Na segunda etapa, ocorre a interação física da célula com a superfície por meio de material extracelular de natureza polissacarídea ou proteica, produzida pela bactéria, que é denominada matriz de glicocálix, que suporta a formação de biofilmes8. O glicocálix é produzido após o processo de adesão superficial, e vai fornecer condições de adesão do peptideoglicano das bactérias Gram positivas e a parte externa da membrana externa das Gram negativas9. Esta teoria de formação de biofilmes pode ser observada na Figura 1. 
Figura 1: Primeira teoria de formação de biofilme 
Fonte: www.yourgenotype.com.br11
Outra teoria sugere para a formação de biofilmes, cinco etapas que didaticamente podem ser colocadas na seguinte ordem: (I) condicionamento da superfície pela adsorção de material orgânico; (II) transporte de células e nutrientes para o sítio de aderência; (III) inicia-se o processo de adesão bacteriana, ainda reversível, por atração eletrostática; (IV) crescimento celular, colonização e adesão irreversível; e, (V) o biofilme apresenta alta atividade metabólica com liberação de células localizadas na periferia (DUDDRIDGE & PRITCHARD, 1983; CHARACKLIS & COOKSEY, 1983; CHARACKLIS, 1984 citados por SALUSTIANO, 2007)10.
Figura 2: Segunda teoria de formação de biofilme 
Fonte: INOVAÇÃO TECNOLÓGICA, 200812.
Quando o microrganismo atinge uma proximidade crítica da superfície, a ocorrência de adesão depende do balanço final entre forças atrativas e repulsivas geradas entre as duas superfícies. 
Após a adesão primária, as células fracamente ligadas consolidam o processo de adesão produzindo exopolissacarídeos que complexam os materiais da superfície e os receptores específicos localizados nos flagelos, pili ou fímbrias. Esses polissacarídeos extracelulares, com carga ou neutros, não só permitem a adesão da célula à superfície, mas também atuam como sistemas trocadores de íons, para captura e concentração de nutrientes da água. À medida que os nutrientes se acumulam, as células pioneiras se reproduzem e a colônia se estabelece originando microcolônias. 
Na ausência de interferência mecânica ou química, a adesão torna-se, nesta fase, irreversível. As microcolônias também sintetizam matriz exopolissacarídica (EPS) e passam a atuar comosubstrato para a aderência de microrganismos denominados colonizadores secundários, que podem se aderir diretamente aos primários ou promoverem a formação de coagregados com outros microrganismos e então se aderirem aos primários13.
Posterior à adesão irreversível da bactéria à superfície, inicia-se o processo de maturação do biofilme, a densidade e complexidade do biofilme aumenta à medida que as células se dividem (ou morrem) e os componentes extracelulares gerados pelas bactérias interagem com moléculas orgânicas e inorgânicas do ambiente circundante para formar o glicocálix. Nesta fase, os biofilmes tornam-se altamente hidratados, formando-se estruturas abertas compostas por 73 a 98% (75-95%) de material não celular, incluindo exopolissacarídeo e canais por onde circulam os nutrientes. Este conteúdo aquoso torna o biofilme com aspecto gelatinoso e escorregadio. A rede de polímeros capta outras células e seus resíduos, ou seja, os colonizadores secundários, agregando mais volume ao biofilme. O biofilme nesta fase apresenta alta atividade metabólica13.
Quando o biofilme atinge uma determinada massa crítica e o equilíbrio dinâmico é alcançado, as camadas mais externas do biofilme começam a liberar células em estado planctônico, que se podem rapidamente dispersar e multiplicar, colonizando novas superfícies e organizando novos biofilmes em outros locais. Existem três tipos de processos de dispersão: expansiva, quando parte das células de uma microcolônia sofre lise e outra retoma a motilidade, sendo então liberadas da estrutura; fragmentação, onde porções de matriz extracelular associadas a microrganismos são liberada, e superficial que ocorre pelo crescimento do próprio biofilme como um todo. 
Com a ausência de nutrientes e/ou de oxigênio ou dificuldades na sua difusão, a diminuição do pH e acúmulo de metabólitos secundários tóxicos, inicia-se um processo de morte celular junto à superfície e subsequente desintegração do biofilme13.
Uma vez que o biofilme tenha se estabelecido, passa a ser uma intensa fonte de endotoxinas, muramilpeptídios e polissacarídeos, assim como de fragmentos de endotoxinas que são liberados na água. É extremamente difícil a remoção de biofilmes já constituídos, em função da forte adesão gerada pelas bactérias à superfície4.
BIOFILME E A INDÚSTRIA DE ALIMENTOS
As falhas nos procedimentos de higienização permitem que os resíduos aderidos aos equipamentos e superfícies transformem-se em potencial fonte de contaminação. Sob determinadas condições, os microrganismos se aderem, interagem com as superfícies e iniciam crescimento celular2, 3.
O crescimento de microrganismos na superfície de alimentos é uma das principais causas de deterioração e perdas de produtos processados e in natura. Desta forma, com o intuito de prolongar a vida útil dos produtos, agentes antimicrobianos são adicionados diretamente ao alimento ou pulverizados na superfície para controlar o crescimento da microbiota presente; e embalagens ativas são adotadas visando interagir com o produto alimentício eliminando ou inibindo microrganismos. Dentre estes, podem-se citar nitratos, lactato, nisina, natamicina, benzoato, propionato e, mais recentemente, o composto triclosan.
Na indústria de alimentos os biofilmes podem se acumular em uma variedade de substratos como, por exemplo: aço inox, vidro, borracha, polipropileno, fórmica, ferro, poliestileno de baixa densidade, policarbonato, entre outros. Convém ressaltar que o biofilme, quando submetido ao calor, pode cristalizar e formar depósitos ou crostas que são muito aderentes, protegendo novos microrganismos e dificultando ainda mais os procedimentos de higiene².
A higienização nas indústrias é dividida em duas etapas muito bem definidas: limpeza e sanitização. A limpeza tem como objetivo a remoção de resíduos orgânicos e inorgânicos aderidos às superfícies, constituídos principalmente por proteínas, carboidratos, gorduras e sais minerais. Após a limpeza, o número de microrganismos sobreviventes ainda e elevado, o que faz da sanitização procedimento obrigatório. A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), através da portaria n° 15, de 23 de Agosto de 1988, define sanitizante ou desinfetantes como formulações que tem na sua composição substâncias microbicidas que apresentam efeito letal sobre microrganismos não esporulados. 
Os sanitizante mais utilizados em superfícies de equipamentos e utensílios nas indústrias alimentícias brasileiras são aqueles que possuem princípios ativos dos grupos: quaternários de amônio, compostos inorgânicos liberadores de cloro ativo, compostos orgânicos liberadores de cloro ativo, compostos a base de acido pera cético, iodo e derivados.
A escolha do agente sanitizante depende, principalmente, do tipo de microrganismo a ser destruído, assim como da natureza do equipamento a ser sanitizado. Os sanitizante utilizados nas indústrias dentro das condições indicadas pelos fabricantes são aprovados em testes como os de suspensão e diluição de uso, pesquisas que utilizam bactérias planctónicas. 
Em contrapartida, existem algumas recomendações na sanitização de superfícies industriais que levam em consideração o numero de células microbianas aderidas dentro de uma determinada área. Essas exigências são mais validas do que testes em suspensão por se referirem as células microbianas no estado séssil. Para a American Public Health Association (APHA), agentes sanitizante devem eliminar as bactérias patogênicas e reduzir o numero de microrganismos deteriorantes em níveis aceitáveis.
De maneira geral, para que as recomendações de qualidade microbiológica sejam alcançadas, a adoção de efetivos programas de limpeza e sanitização, bem como a utilização de matéria-prima de qualidade e a adoção de praticas higiênico-sanitárias por parte dos colaboradores, são fundamentais. Para tanto, a aplicação de ferramentas de controle de qualidade e imprescindível. As Boas Praticas de Fabricação (BPF) e os Procedimentos Padrão de Higiene Operacional (PPHO), que são pré-requisitos do sistema de Analise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC), abordam, dentre outros, os princípios básicos de higiene industrial, como: higiene de instalações, de equipamentos e de utensílios utilizados no preparo de alimentos. As BPF e os PPHO são os requisitos mínimos para a obtenção de alimentos seguros e devem ser utilizadas por todas as indústrias alimentícias que desejam produzir alimentos com esta caracteristica6. Além disso uma tendência futura é o uso de desinfecção "ecologicamente correta" através de ozônio online, irradiação ultravioleta e água aquecida para prevenção de contaminação da rede de distribuição de água tratada4 
BENEFÍCIOS DO BIOFILME PARA A INDÚSTRIA
Por outro lado, os biofilmes nas indústrias, em alguns casos, podem ser benéficos, como na produção e degradação de matéria orgânica, degradação de poluentes ou na reciclagem de nitrogênio, enxofre e vários metais. A maioria destes processos requer o esforço coletivo de organismos com diferentes capacidades metabólicas. 
Assim, os biofilmes são usados em tratamentos aeróbios e anaeróbios de efluentes domésticos e industriais, metabolizando esgotos e águas contaminadas. 
No processo de tratamento de água potável, a remoção de nitrogênio, carbono biodegradável e precursores de trihalometanos podem ser obtidos por biofilmes microbianos submersos. Outro exemplo são os biofilmes existentes em reatores para a produção de fermentados3.
CONCLUSÃO
Os microrganismos formam o biofilme como uma maneira de otimizar seu desenvolvimento, sobrevivência, e multiplicação Vendo que são consideravelmente mais resistentes às substâncias antimicrobianas e à remoção por agentes comuns de higienização industrial, o biofilme, representa um alvo de preocupação para indústria de alimentos por serem constituídos por patógenos ou deteriorantes, que podem ocasionar enfermidades aos consumidores e prejuízos econômicos devido à depreciação do produto final por alterações físico-químicas e sensoriais.Dessa forma, a compreensão do conceito de biofilmes microbianos e de aspectos inerentes a sua estrutura e composição, bem como de seu processo de formação, são fundamentais para o desenvolvimento de estratégias de controle efetivas e entendimento do risco que estes representam as indústrias. Considerando que para evitá-los de forma eficaz, a adoção dos procedimentos de controle de qualidade é imprescindível.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Stoodley P, S. K, D. DG, Costerton JW. Biofilms as complex differentiated communities. Annu Rev Microbiol. 2002; cáp.56: p.187-209. 2002.
PARIZZI, S. Q. F., et al. Bacterial adherence to different inert surfaces evaluated by epifluorescence microscopy and plate count method. Brazilian Archives of Biology Technology. Mar. 2004, vol.47, no.1, p.77-83. ISSN 1516-8913. 2004.
MACEDO, J. A. B. MILKNET. Biofilmes Bacterianos: Uma Preocupação Para a Indústria de Alimentos. 18 de julho de 2006. Disponível em<www.milknet.com.br>. Acesso em 12 de novembro de 2014.
MEDONLINE. Medicina no Line. Biofilme: um velho problema, uma nova batalha. Revista Virtual de Medicina. 2008 Disponível em <www.medonline.com.br>. Acesso em 12 de novembro de 2014.
KASNOWSKI, M. C., et al. Formação de biofilme na indústria de alimentos e métodos de validação de superfícies. Revista Científica Eletrônica de Medicina Veterinária, v. 15, p.1-23, 2010.
OLIVEIRA, M.M.M, Bruguera. DF, Picoli. RH. Biofilmes microbianos na indústria de alimentos: uma revisão. Revista Instituto Adolfo Lutz. São Paulo, 2010; 69(3):277-84.
MARSHALL, K. C.; STOUT, R.; MITCHELL, R. Mechanism of initial events in the sorption of marine bacteria to surfaces. Journal off General Microbiology, v. 68, p.337-348, 1971.
MELO, P. C. Estudo fenotípico e genotípico da produção de biofilmes por estirpes de Staphylococcus aureus isoladas de casos de mastite subclínica bovina. 2008, 103f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária – Medicina Veterinária Preventiva) - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, 2008.
PARIZZI, S. Q. F. Adesão bacteriana em superfície de serviços de alimentação hospitalar avaliada pela microscopia de epifluorescência. 1998. 57 f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 1998.
SALUSTIANO, V. C. Isolamento, ribotipagem e controle de Bacillus cereus após a pasteurização do leite. 2007, 75 f. Tese (Doutorado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2007.
YOURGENOTYPE. Blog de Biociências. Biofilmes bacterianos: Como as bactérias podem colonizar qualquer lugar. Disponível em <www.yourgenotype.com.br>. Acesso em 20 de novembro de 2014.
INOVAÇÃO TECNOLÓGICA. Biofilme de bactérias agora pode ser quebrado. Redação do Site Inovação Tecnológica, 2006. Disponível em <www.inovacaotecnologica.com.br>. Acesso em 20 de novembro de 2014.
IST. Grupo de Ciências Biológicas do Instituto Superior Técnico. Universidade Técnica de Lisboa. Crescimento microbiano em biofilmes. Publicado em 18/11/2005, Revisto em 03/04/2008. Disponível em <http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=354>. Acesso em 21 de novembro de 2014.