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COLETA E MANIPULAÇÃO DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS NA INVESTIGAÇÃO FORENSE Ana Júlia Goulart dos Santos¹ Isabella Drumond Martins¹ Keila Oliveira Silva¹ Roberta Ramos Vieira de Paiva¹ Vitoria Ferreira Oliveira¹ Alana Serrano Campelo de Souza² 1. INTRODUÇÃO As ciências forenses vêm sendo utilizadas na investigação criminal desde 1985, por meio da investigação forense e da realização de atividades em laboratórios genéticos, que se utilizam de diferentes vestígios biológicos como auxílio ou até mesmo provas na solução de crimes. Dentre os vestígios biológicos obtidos no local de um crime que podem ser necessários para busca e comprovação de um suspeito, é possível citar: fios de cabelo, sangue, ossos, dentes, saliva, urina e fezes, células da pele presentes. Danos não somente propositais, mas também os provocados por ação do tempo e clima, por manuseio e armazenamento incorretos ou por imperícia, podem comprometer as amostras (STUMVOLL, 2014 apud PRADO, 2018, p. 2). Portanto, é extremamente importante garantir que os vestígios permaneçam imaculados a partir do momento de sua descoberta, para que não se percam. Neste contexto, o objetivo deste estudo é apresentar meios de coleta de amostras biológicas presentes em uma cena de crime, tal como manipular e analisar corretamente o material coletado para que o mesmo não perca sua validade por alterações físicas, químicas e/ou biológicas, e a importância do uso das mesmas. 2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 2.1. USO E DESCARTE DE EPI (EQUIPAMENTO DE PROTEÇÃO INDIVIDUAL) Durante o processo da perícia é fundamental que os peritos façam a coleta dos materiais biológicos da forma correta. Assim, é necessário primeiramente isolar e preservar o local do crime, e avaliar com cautela cada detalhe e objeto no local. Cuidados como o uso de equipamentos de proteção individual dentro e fora do de cena (luvas descartáveis, máscaras e óculos de proteção ao manusear e processar todas as evidências, tanto no ato da coleta como na análise) devem ser tomados, assim como todos os materiais descartáveis que foram usados no ato da coleta, devem ser armazenados de forma provisória em embalagens adequadas e descartados de acordo com o regulamento vigente. (AGUIAR, 2016; KASVI, 2019) 2.2. ISOLAMENTO DA ÁREA Em face de uma cena criminal, os primeiros passos a se seguir são o isolamento da área, para que nenhuma amostra seja danificada ou perdida pela ação de terceiros. Situações como a livre circulação de pessoas na cena ou a limpeza da mesma antes da chegada da perícia, como ocorreu no caso conhecido como “Springfield Three”, podem levar ao descarte de evidências úteis, que se tornaram inúteis pela contaminação, ou até mesmo fazer com que as amostras passem despercebidas. (AGUIAR, 2016; KASVI, 2019; SARIAN, 2021; SCHNEIDER, 2021) 2.3. A COLETA É recomendado o uso da luz forense ou de reagentes quimioluminescentes e colorimétricos, a fim de que vestígios biológicos invisíveis a olho nu possam ser identificados. Por exemplo, o reagente Luminol emite uma luz azulada ao entrar em contato com íons de ferro e, dessa forma, identifica manchas de sangue mesmo quando a superfície foi limpa com materiais de limpeza mais agressivos. (IBAP, 2023; IPOG, 2021) Figura 1 - Luminol aplicado sobre banheira Fonte: LOBATO, 2014, p. 33. Na figura 1, é possível notar a reação causada pelo luminol em uma banheira que, a olho nu, poderia parecer limpa. Com a aplicação do reagente é possível notar resquícios de amostras biológicas que poderiam passar despercebidas pelo perito. Além de identificar os íons de ferro, ele auxilia na identificação do formato da mancha, que pode indicar gotejamento, o arrastamento do corpo a uma outra área, e até mesmo a tentativa de limpeza do sangue. No entanto, nem todos os resíduos biológicos podem ser encontrados dessa maneira e nem sempre aqueles íons que o reagente identificou se tratam, de fato, de sangue, portanto toda a área referente à cena do crime deve ser bem isolada independentemente da disposição de reagentes e luzes para auxiliar o perito. (IPOG, 2021) A coleta é uma fase que representa muitas vezes um desafio, uma vez que as cenas de crime podem ser complexas e caóticas. Por isso deve ser feita por pessoal habilitado com formação em ciências forense, com conhecimentos técnicos e experiência adequada para o desempenho desta função. O método de coleta depende da condição em que o material biológico se encontra. (KASVI, 2019) “A coleta é o processo essencial para a solução dos casos, pois amostras que não estiverem adequadamente coletadas, identificadas e documentadas podem ser questionadas e são passíveis de não serem analisadas;” (ROCHA et al., 2011, apud AGUIAR, 2016, p. 3). Logo é importante ressaltar que, além da identificação correta de cada material encontrado, é necessário também acondicioná-los de maneira adequada para que eles não se modifiquem no período entre a coleta e a análise. Além da falta de qualificação técnica, as variações climáticas também podem alterar e comprometer o valor probatório das amostras biológicas, o que pode levar ao seu descarte. Figura 2 e 3 - Vestígios de amostras biológicas (sangue) Fonte: LOBATO, 2014, p. 5. A figura 2 mostra resquícios de sangue em uma faca encontrada na cena de um crime. Nota-se que as amostras permanecem conservadas o máximo possível para a análise. A figura 3, por sua vez, representa a correta identificação do material coletado para que o mesmo seja enviado ao laboratório. De acordo com Giovanelli e Garrido (2011), a análise do crime deve ser feita de maneira técnica, imparcial e especializada, logo essa análise deve ser baseada em fundamentos científicos e cada etapa do processo deve ser documentada para que haja transparência no tribunal quando as mesmas forem mostradas como provas e possam ser dignas de confiança no ato de um processo. Em crimes em que há contato direto entre os envolvidos, podem haver resquícios da pele do agressor sob as unhas da vítima, saliva e até mesmo sangue nas roupas e calçados. Esses elementos, inclusive as peças de roupa de ambas as partes, devem ser coletados no momento da investigação para que sejam examinadas. (VÊNUS PODCAST, 2023) No entanto, em diversos casos no Brasil, há um atraso na realização do procedimento de coleta das roupas dos indivíduos presentes na cena do crime, quando há suspeitos bem definidos. A exemplo disso temos o caso Nardoni. Segundo testemunho da perita do caso, dra. Rosangela Monteiro, ao Venus Podcast (2023) as roupas de Alexandre Nardoni que continham evidências (sangue e poeira da rede de proteção da janela) demoraram nove dias após a perícia inicial para serem liberadas e enviadas ao laboratório. Essa demora poderia ter causado a não-resolução do caso, pois, caso as roupas de Alexandre tivessem sido lavadas ou descartadas, muitas evidências se perderiam. 2.4. TIPOS DE COLETA Há diferentes maneiras de coletar amostras biológicas em uma cena de crime, como também diferentes tipos de amostras. Abaixo estão alguns dos exemplos mais importantes de amostras biológicas que a perícia criminal utiliza para ajudar na solução dos delitos, bem como sua coleta segura. 2.4.1. COLETA DE SANGUE O sangue é um vestígio comum em cena de crime, especialmente quando envolve agressão corporal (homicídios e/ou lesão corporal). Pode ser encontrado na forma líquida, úmida ou seca.(IBAP, 2023; FDLE, 2009; PRADO, 2018) Ao coletar essa evidência biológica o perito deve estar usando luvas. Segundo o FDLE (2009), quando o vestígio sanguíneo estiver na forma líquida - em manchas ou misturados a outros líquidos - os instrumentos mais utilizados para a coleta são seringas, swab e pipetas; sempre esterilizados para não haver contaminações. No uso de uma seringa ou pipeta, o sangue é transferido para um tubo de coleta sanguínea com substâncias anticoagulantes. Caso o profissional tenha ao seu alcance somente um cotonete estéril, um algodão ou um cartão FTA, deve-se secar o sangue antes de armazenar. Sob nenhuma circunstância uma evidência que contenha líquido deve permanecer seladaem recipientes de papel ou plástico por mais de duas horas. A umidade propicia o crescimento de microorganismos que podem destruir ou alterar a evidência. (SCHIRO, 1999) Na forma seca, o vestígio é coletado com swab umedecido com água destilada ou raspagem com lâmina, canivete ou espátula. O material resultante da raspagem deve ser acondicionado em um envelope identificado. (JOBIM, 2003; SILVEIRA, 2009; INTERPOL, 2009 apud SOUSA e QUEIROZ, 2012, p. 106) Em sua forma úmida, que geralmente é encontrada em tecidos de roupas ou móveis, deve ser recolhida a peça, quando possível, embalada em saco plástico e transportada ao laboratório, onde deve ser realizada a secagem do material e o armazenamento em envelope pardo. Cada peça deve ser guardada em um envelope individual devidamente identificado e bem selado para evitar a contaminação. Em face de uma peça muito grande, como o tecido de um móvel, por exemplo, corta-se a parte onde os resquícios de sangue se encontram e prosseguem-se os mesmos passos anteriores. Além da amostra do vestígio, é preciso coletar uma segunda amostra do mesmo local onde o vestígio foi encontrado, para fins comparativos em situações onde os depoimentos são insuficientemente esclarecedores. Adicionalmente, em caso de transfusões de sangue recentes (como quando a vítima precisa receber transfusões após o incidente), a amostra pode ser insuficiente. Portanto, é necessário que sejam coletadas amostras alternativas, como a de células da mucosa bucal, para que sirvam de complemento à amostra sanguínea (FDLE, 2009). 2.4.2. COLETA DE SÊMEN Esse vestígio é constituído por dois líquidos, sendo um o líquido seminal e o segundo o líquido prostático, onde se encontram os espermatozoides. O líquido seminal, por ser rico em moléculas proteicas, coagula logo após a ejaculação, e após 10 a 20 minutos esse líquido se dissolve devido à ação de enzimas e antígenos presentes no líquido prostático. Por tratar-se se um período de tempo muito curto, essa liquefação não permite ao perito determinar quanto tempo se passou desde a ejaculação, porém isso não o impede de encontrar dados importantes contidos na amostra. (FDLE, 2009; PRADO, 2018) O sêmen é uma excelente fonte de DNA por conta da presença dos espermatozoides, sendo, portanto, um vestígio de extrema importância. Primeiramente, é de fundamental importância a pesquisa microscópica na amostra para verificar a existência de espermatozóide e do teste ou reação de brentamina que determina a atividade da fosfatase ácida, na qual o resultado positivo indica a presença de células seminais (PINHEIRO, 2004; apud SOUSA e QUEIROZ, 2012, p. 107). O sêmen é geralmente encontrado na forma seca em peças íntimas e roupas de cama. É necessário coletar toda a peça, realizar a secagem e armazená-la em saco de papel ou plástico, assim como a amostra sanguínea. Também deve-se acondicionar em local refrigerado até o envio para o laboratório. Caso a superfície em que a mancha se encontra não possa ser transportada, como o piso, paredes ou móveis, utiliza-se swab ou gaze umedecida em água destilada paraé mais comumente encontrada no interior de preservativos, por vezes também em sacolas. O objeto deve ser amarrado e colocado em recipiente selado para que não vaze. Também é necessário congelá-lo. Nesse tipo de vestígio, é possível que material biológico da vítima também seja encontrado. Caso a amostra não esteja no preservativo é necessário utilizar uma pipeta, swab ou seringa para a coleta do líquido e, em seguida, ele deve ser transferido para um recipiente para ser congelado. a coleta do material, que deve ser seco, envelopado e identificado da mesma forma para que não haja contaminação. (FDLE, 2009; PRADO, 2018) Já a sua forma líquida é mais comumente encontrada no interior de preservativos, por vezes também em sacolas. O objeto deve ser amarrado e colocado em recipiente selado para que não vaze. Também é necessário congelá-lo. Nesse tipo de vestígio, é possível que material biológico da vítima também seja encontrado. Caso a amostra não esteja no preservativo é necessário utilizar uma pipeta, swab ou seringa para a coleta do líquido e, em seguida, ele deve ser transferido para um recipiente para ser congelado. Amostras seminais muito envelhecidas ou degradadas podem apresentar resultados tanto conclusivos quanto inconclusivos durante a análise (FDLE, 2009). 2.4.3. COLETA DE SALIVA Considera-se a saliva: Um fluido aquoso, que lubrifica os movimentos da língua e lábios durante o ato de falar e umedece as túnicas mucosas e o esôfago, sendo secretado pelas glândulas parótidas, submandibular e sublingual em menor quantidade por pequenas glândulas na boca. (GUYTON, 2008) De acordo com SOUSA e QUEIROZ (2012), na forma seca (mancha) o vestígio pode ser coletado com swab ou gaze umedecida em água destilada. É realizada a secagem e armazenamento da amostra, e o transporte deve ser feito à temperatura ambiente. Durante a coleta é importante deixar uma parte do material usado, sem vestígio para servir de controle negativo. (FDLE, 2009) Caso o vestígio se encontre em um objeto transportável, coloca-se o objeto em um envelope ou caixa de papel vegetal identificado, utilizando-se pinça ou luvas para seu manuseio (SOUSA e QUEIROZ, 2012). Também podem ser utilizados swabs umedecidos com água destilada para coleta de amostra em alguns dos objetos, como copos e garrafas, e em seguida é feita a secagem e o envio para o laboratório. No caso das pontas de cigarro, podem ser armazenadas juntas as pontas que se encontrarem no mesmo recipiente, deixando de fora as cinzas. 2.4.4. COLETA DE URINA A urina é comumente coletada em crimes de agressão sexual e infanticídio para identificar a presença de células que contenham DNA, como as células das vias urinárias, leucócitos e sêmen que podem estar presentes no líquido. (FDLE, 2009) A coleta dependerá da forma como o vestígio for encontrado, seguindo-se os mesmos passos das substâncias anteriores. No seu estado líquido, a urina pode ser coletada utilizando a pipeta, seringa ou swab umedecido com água destilada. Caso a urina esteja presente no estado de mancha em tecidos ou móveis, o material deve ser transportado ao laboratório seguindo as normas de manipulação, identificação e acondicionamento. (FDLE, 2009) 2.4.5. COLETA DE PELOS E CABELOS LARA e FARIA (2014), mencionam: Um tipo particular de microvestígio de extrema importância, e, muitas vezes ignorado pela perícia no Brasil, é o cabelo humano. Este vestígio pode ser encontrado em locais de crime contra pessoa (homicídio), crimes contra o patrimônio, crimes contra a dignidade sexual, e até mesmo contra a incolumidade pública. Na coleta de pelos e fios de cabelo, o interessante para o perito não é a estrutura do folículo como o senso comum imagina, mas sim a raiz capilar, que é irrigada por sangue e, dessa forma, contém DNA nuclear possível de ser extraído. O fio sem o bulbo capilar contém DNAmt que pode ser extraído também, entretanto existe a possibilidade de os resultados serem inconclusivos, pois fatores como tratamentos químicos podem impedir a análise correta do material coletado. A análise do fio permite que o perito descubra se o mesmo veio de um animal, de um humano, se foi arrancado, se caiu naturalmente, se pertence à vítima ou ao agressor, e pode até mesmo revelar de qual parte do corpo ele é proveniente. (MONTEIRO; 2010; PRADO, 2018) Segundo FDLE (2009), é utilizada uma pinça para remover o pelo do cadáver, quando houver um, ou para coletá-lo na cena em que foi encontrado. O material, então, deve ser transferido para uma folha de papel, dobrando para evitar a perda, selado e devidamente identificado. No caso de pelos presentes em um corpo ou tecido orgânico, coleta-se a amostra por inteiro. Células bucais ou sangue já identificados podem ser utilizados para comparação quando a amostra capilar for desconhecida. Essas são alguns dos tipos de coletas mais frequentes feitas pelo perito no local do crime. Antes de tudo as amostras devem ser devidamente fotografadas para o arquivo docaso. Após a fotografia, os vestígios biológicos podem ser coletados, armazenados em refrigeração e encaminhados para um laboratório forense, local em que serão realizadas suas respectivas análises. (KASVI, 2019) 2.5. TIPOS DE ANÁLISE Uma vez coletadas as amostras, é necessário realizar a analise para averiguar a compatibilidade de DNA entre a vítima e o suspeito. Os elementos coletados, identificados e armazenados são levados ao laboratório, onde é feita a análise visual e bioquímica para a identificação de resquícios de DNA, que é uma das principais evidências na resolução de um delito. No entanto, testes presuntivos também são realizados para constatar se as amostras coletadas são, de fato, o que o perito suspeita. (MONTEIRO, 2010; PRADO, 2018) 2.5.1. PCR - REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE Essa técnica possibilita a amplificação de um fragmento de DNA. A partir dele, é possível extrair o DNA de uma única célula e multiplicá-la in vitro, gerando assim material suficiente para um teste genético e, dessa forma, possibilitando a análise laboratorial de amostras recolhidas na cena do crime, ainda que essa amostra seja pequena. (KASVI, 2018) Segundo KASVI (2018), o procedimento PCR passa por três fases: 1. Desnaturação: O DNA é desnaturado a 95ºC por cerca de 30 segundos, o que modifica a estrutura do ácido pela quebra das ligações de hidrogênio. Antes formado por uma dupla cadeia, a desnaturação faz com que ele se separe em duas cadeias simples. 2. Anelamento ou Hibridização: Após a separação das cadeias, um par de iniciadores específicos para os genes alvo da análise une-se às cadeias. Um deles complementa uma cadeia simples oposta, e o outro complementa a outra. Dessa forma, geram-se duas cadeias duplas a partir de cada molécula de DNA. Essa etapa ocorre a uma temperatura de 60ºC. 3. Extensão ou Polimerização: A enzima DNA-polimerase utiliza a nova fita dupla como molde para sintetizar uma nova cadeia de DNA, e agrega bases complementares na extremidade dessa terceira fita. Esse processo acontece a uma temperatura de 72ºC. Essas três fases são repetidas diversas vezes até que se obtenha uma quantidade satisfatória de amostra, como está representado na Figura 4 abaixo: Figura 4 - Fases do procedimento PCR Fonte: Biologia Molecular da Célula, 6ª edição. ArtMed, 2017. p. 473 e 474. A figura 4 ilustra as três etapas do procedimento PCR: desnaturação, anelamento e extensão. A técnica do PCR é uma das principais utilizadas pela perícia criminal, pois ela possibilita ao perito ter uma visão mais específica do que se passou na cena, de quem esteve presente e do que foi consumado, a partir de amostras variadas, como a de sangue, de urina ou de sêmen. (PRADO, 2018) 2.5.2. FENOFTALEÍNA (KASTLE-MEYER) O teste de Kastle-Meyer é um dos exames presuntivos utilizado na identificação de manchas de sangue. Em suma, a mancha de sangue encontrada é coletada com o swab e umedecida em água destilada ou soro fisiológico. Em seguida, se adiciona uma gota de fenoftaleína à ponta da haste e outra de peróxido de hidrogênio a 5%, que será decomposto pela hemoglobina presente nas hemácias (peroxidase), e o oxigênio resultante da decomposição do peróxido reagirá com a fenoftaleína, evidenciando uma coloração rosada na amostra. (JÚNIOR e RAMOS, 2012) No entanto, é possível que a presença de outras substâncias capazes de decompor o peróxido de hidrogênio, em casos onde a mancha não trata-se verdadeiramente de sangue, cause um falso positivo no teste. Figura 5 - Teste de Kastle- Meyer Fonte: EMIKOJADE, 2020. A Figura 5 ilustra de maneira simples a reação esperada ao se utilizar o teste de Kastle-Meyer. Ao reagir com o oxigênio gerado na peroxidase, a fenoftaleína toma uma coloração rosada. Caso não haja reação, não há indícios de sangue na substância coletada. 2.6. EFETIVIDADE DE RESOLUÇÃO DE CASOS Um estudo baseado em 1600 casos ocorridos entre setembro de 1980 e fevereiro de 1982 nas cidades de Peoria, Chicago, Kansas City e Oakland, nos Estados Unidos, e coletados aleatoriamente, descreve os impactos que o uso de evidências físicas diretamente provoca na resolução de casos policiais, utilizando-se de variáveis que possam prejudicar a investigação. A partir desse estudo e analisando as tabelas abaixo, podemos comparar a porcentagem de crimes solucionados com e sem evidências. (PETERSON, J. L.; MIHAJLOVIC, s.; GILLILAND, M; 1984) Tabela 1 - Resultado de casos de homicídio em que evidências físicas foram analisadas Cidade Peoria Chicago Kansas City Oakland Nº de casos 33 73 47 63 Queixas registradas 82% 63% 85% 81% Queixas retiradas 15% 20% 33% 14% Outros fins* 0% 7% 9% 2% Crimes confessos 7% 35% 35% 51% Julgados 78% 46% 18% 41% Condenados 90% 76% 71% 89% Absolvidos 10% 24% 29% 11% *Essa categoria inclui os casos cujos réus foram processados por outros crimes, foram considerados incapazes de passar pelo julgamento, onde o réu morreu ou onde o réu ainda está a solta. Fonte: PETERSON et at., 1984, p. 180. A tabela 1 indica que em casos de homicídio cujas evidências foram analisadas corretamente e os réus julgados, a quantidade de condenamentos foi consideravelmente superior à de absolvições. Tabela 2 - Porcentagem de crimes resolvidos com e sem evidências COM EVIDÊNCIAS Cidade Crime Peoria Chicago Kansas City Oakland Roubo 69% 66% 46% 87% Agressão 91% 78% 67% 84% Roubo à propriedade 74% 43% 42% 76% SEM EVIDÊNCIAS Cidade Crime Peoria Chicago Kansas City Oakland Roubo 20% 59% 27% 20% Agressão 63% 62% 64% 67% Roubo à propriedade 9% 37% 9% 24% Fonte: PETERSON et at., 1984, p. 138. A tabela 2 apresenta que, nos casos que possuíam evidências, inclusive compostas por materiais biológicos, a porcentagem de sucesso na resolução foi superior quando comparado a casos onde não foram encontradas evidências, ou cujas amostras foram consideradas inúteis. 3. RESULTADOS E DISCUSSÕES Pela análise dos artigos foram encontradas as seguintes formas de coleta de evidências biológicas, manuseio e proteção de material, uso de equipamentos de proteção individual e análises de vestígios na solução de crimes. Essa busca foi realizada por meio de documentos bibliográficos, baseados em artigos científicos e regulamentos colhidos sobe base de dados em bibliotecas virtuais, com um alvitre trabalho em questão, como: "biologia forense”, “coleta e análises de vestígios biológicos”, “perícia criminal”, “perito criminal”, “genética forense.” Figura 6 - ETAPAS DA INVESTIGAÇÃO DO CRIME Fonte: LOPES, 2016. A figura 6 apresenta uma proposta que condiz com resultados do presente estudo, demonstra resumidamente um processo divido em etapas de como uma perícia forense deverá ser praticada. Com base nos artigos analisados, averigua-se que a investigação forense que segue esses passos pode obter resultados precisos e confiáveis para solucionar crimes e trazer justiça para as vítimas com maior agilidade e assertividade, diferente de quando há ausência de evidências suficientes, seja por má identificação ou por contaminação em alguma etapa da coleta ou análise. A implementação de medidas preventivas e protocolos de segurança em todas as etapas da investigação também é essencial para minimizar os riscos de contaminação e proteger a saúde dos profissionais envolvidos. No entanto, podemos ver em diversos casos que nem sempre esses procedimentos são seguidos devidamente, o que demonstra a necessidade de treinamento e atualização constante das práticas de biossegurança para garantir a proteção tanto dos materiais coletados, quanto dos profissionais que realizam a coleta. A padronização dos procedimentos periciais e a implementação de novas técnicas de coleta e análise podem fazer uma grande diferença na resolução desses casos, mas ao seguir corretamente os procedimentos já existentes e citados neste trabalho, já é possível garantir a integridade das amostras biológicas de maneira satisfatória. REFERÊNCIAS AGUIAR, Marina Abrantes. Técnicas de biologia molecularna genética forense. 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