Radiologia

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“Radiobiologia: Efeitos dos danos no DNA ”
Paulo R D V Godoy
2013
Universidade de São Paulo, Brasil
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP) 
Departamento de Genética
Laboratório de Citogenética e Mutagênese
1
1
1895: Descoberta dos raios-X – Röntgen 
1896: Radioatividade natural é descoberta por Becquerel; 
Tratamento de câncer de mama com raios X: Inicio da radioterapia clínica 
1898: Marie Currie: Ra como fonte natural de fótons de alta energia (radiação gamma). 
1900 em diante: Utilização e aperfeiçoamento na utilização da radiação no tratamento de vários tipos de câncer.
Histórico - Radiobiologia
Röntgen
Marie Currie
1927: Descoberta de que as radiações induzem mutações em Drosophila (Müller)
1945: Bomba atômica: Novo México (16/07); Hiroshima (06/08) e Nagasaki (11/08).
1956: Primeira curva de sobrevivência em células de mamíferos– irradiação in vitro (Puck)
1965: Atividade de reparo demonstrado em experimentos de doses fracionadas em células de mamíferos (Elkind)
1972: Descoberta da apoptose por Kerr e colaboradores
HJ Müller
Hiroshima
1986: Acidente em Chernobyl
1987: Acidente em Goiânia
1999: Primeira aplicação do método de microarranjos em radiobiologia (Amundson)
2001: Sequenciamento do genoma humano.
2011: Acidente radioativo (terremoto em 11/03) – usina de Fukushima no Japão
Microarranjos
RADIOBIOLOGIA
“Campo do conhecimento e estudos dos princípios, mecanismos, e efeitos das radiações ionizantes em organismos vivos”
(Hall et al., 2006)
NÍVEIS DE ESTUDO
Macroscópico
Microscópico
Molecular
Possibilidade de estudar as interações das radiações com as células, tecidos e organismo. 
Tipos de radiações
http://www.arpansa.gov.au/radiationprotection/Basics/ion_nonion.cfm
Tipos de radiação ionizante
Fontes de exposição pública à radiação ionizante
Lima et al., 2009
Bonato et al., 2011
Magnitude da exposição à radiação
Brenner D J et al. PNAS 2003;100:13761-13766
©2003 by National Academy of Sciences
A) Modelo linear
B) Modelo subestimado
C) Modelo superestimado
D) Modelo do threshold
E) Modelo da hormese
Modelos de extrapolação de riscos de câncer/ dose para doses abaixo de 100 mGy
Schematic representation of different possible extrapolations of measured radiation risks down to very low doses, all of which could, in principle, be consistent with higher-dose epidemiological data. Curve a, linear extrapolation; curve b, downwardly curving (decreasing slope); curve c, upwardly curving (increasing slope); curve d, threshold; curve e, hormetic.
Size of a cohort exposed to different radiation doses, which would be required to detect a significant increase in cancer mortality in that cohort, assuming lifetime follow-up (9).
Brenner D J et al. PNAS 2003;100:13761-13766
©2003 by National Academy of Sciences
Size of a cohort exposed to different radiation doses, which would be required to detect a significant increase in cancer mortality in that cohort, assuming lifetime follow-up (9).
Silva et al., 2011
Doses direcionadas ao câncer de cabeça e pescoço
Efeitos adversos das radiações ionizantes
Efeitos agudos
Tecidos de proliferação rápida
Associado a inflamação
Reversível
Efeitos tardios
Meses ou anos após a IR
Não reversível
Dermatite
Mucosite
Cistite
Proctite
Perda de cabelo
Supressão da medula óssea
Fibrose e atrofia
Endurecimento da área irradiada
Dano vascular
Telangectasia
Microangiopatia cardial
Infertilidade
Deficiência hormonal
Malignidades secundárias
Edgar Selzer e Alexandra Hebar, 2012
G
C
A
T
C
G
A
T
T
A
G
C
A
T
C
G
G
C
A
T
A
T
T
A
T
A
T
A
T
A
p+
e-
Direct effect
p+
e-
H2O
OH●
Indirect effect
Ação das radiações ionizantes
quebras simples e duplas:
SSB: single strand break
DSB: double strand break
Danos de base
Efeito direto (Alto LET):radiação particulada
Efeito indireto (Baixo LET): radiação gama
Lesões no DNA:
Hoeijmakers et al, (2001) Nature 411, 366-374
Agentes causadores de danos, tipos de reparo e consequências
Common DNA damaging agents (top); examples of DNA lesions induced by these agents (middle); and most relevant DNA repair mechanism responsible for the removal of the lesions (bottom). b, Acute effects of DNA damage on cell-cycle progression, leading to transient arrest in the G1, S, G2 and M phases (top), and on DNA metabolism (middle). Long-term consequences of DNA injury (bottom) include permanent changes in the DNA sequence (point mutations affecting single genes or chromosome aberrations which may involve multiple genes) and their biological effects. Abbreviations: cis-Pt and MMC, cisplatin and mitomycin C, respectively (both DNA-crosslinking agents); (6–4)PP and CPD, 6–4 photoproduct and cyclobutane pyrimidine dimer, respectively (both induced by UV light); BER and NER, base- and nucleotide-excision repair, respectively; HR, homologous recombination; EJ, end joining
16
Sensores de dano 
Transdutores
(amplificação do sinal, cascata de quinases) 
Efetores
Reparo
do DNA
Controle da
transcrição
Controle do
ciclo celular
Apoptose
Harper and Elledge, (2007) Molecular Cell Volume 28, Issue 5 739 - 745 
Harper and Elledge, (2007) Molecular Cell Volume 28, Issue 5 739 - 745
p53: TRAFFIC COP AT THE
CROSSROADS OF DNA REPAIR AND RECOMBINATION
S. Sengupta and C.C. Harris
Nature, vol 6: 44 (2005)
Principais mecanismos de reparo no DNA em resposta às radiações ionizantes
Bases oxidadas
Quebras de fita dupla
BER
NHEJ e HRR
Reparo por excisão de bases
Reparo recombinacional homólogo (HRR)
Procesamento terminal pelo complexo (M/R/N) sentido 5´-3´
Ligação do fator Rad52 nas extremidades livres
Reações mediadas pela Rad51
Invasão de fita, mediada pelos genes Rad51, BRCA1 e BRCA2
Clivagem da Junção Holliday, pelo heterodímero MUS81.MMS4
NBS1
Junção de Extremidades não Homólogas (NHEJ)
Reconhecimento das extremidades
Processamento das extremidades
Ligação
NBS1
Principais tipos de morte celular em células irradiadas
(Lauber et al., 2012)
Mecanismos de Apoptose
(Elmore et al., 2007)
Via Intrínsica
Alberts et al., Molecular Biology of the Cell , Figure 17-39 (B) 
Como estudar os efeitos de agentes químicos e físicos?
		
Estudos celulares:
Índices de proliferação celular; cinética do ciclo celular
Morte celular (curvas de sobrevivência, apoptose e necrose)
 Estudos citogenéticos/ citomoleculares:
	Alterações cromossômicas (numéricas e estruturais)
	Translocações cromossômicas
	Micronúcleos
	foci de gamma-H2AX
 
Estudos moleculares e análise de expressão gênica
	
	Expressão transcricional: Microarranjos de DNA
	RT-PCR em tempo real
	Expressão proteica: Western Blot, Imuhistoquímica, Gel 2D	
	
Sistemas in vitro	Culturas de células de mamíferos
 Técnica	 	 Limite de detecção 	 	 Aplicação
Dicêntricos, anéis e fragmentos
Translocações
Micronúcleo
Ensaio Cometa
Gamma-H2AX
	0,1 - 5 Gy	
	0,25 - 4 Gy
	0,2 - 4 Gy
	0,1 – 8 Gy
	0,01 – 8 Gy
 
Estimativa da dose absorvida semanas após o evento
Estimativa da dose após um longo período de tempo	
Teste genético de toxicologia e biomonitoramento de indivíduos expostos
Detecção de danos no DNA minutos ou dias após a irradiação
Detecção de danos no DNA minutos ou dias após a irradiação
Principais ensaios para detecção de danos cromossômicos/ DNA
Pernot et al., (2012). Mutation Research 751 258–286
Análise citogenética (cromossômica)
Doenças genéticas
Câncer
Exposição a agentes químicos e físicos (Radiação)
Aplicações
Aberrações Estruturais
Estáveis
Instáveis
dicêntricos, anéis, trocas e fragmentos cromatídicos ou cromossômicos 
Morte celular
translocações balanceadas e rearranjos simétricos 
Permanecem por
 várias gerações
Detectadas por citogenética convencional
Detectadas por FISH
Aberrações cromossômicas
Indicadores de dano ao DNA e de instabilidade genômica
Monitorização de indivíduos expostos a radiação
Curva de calibração
Análise de dicêntricos e anéis em linfócitos das vítimas
Problema: Aberrações Instáveis tendem a ser eliminadas 
Estimativa da dose absorvida
Charles D. Bangs1, Timothy A. Donlon2
1 Stanford University Hospital, Stanford, California, 2 The Queen's Medical Center, Honolulu, Hawaii
Publication Name:  Current Protocols in Human Genetics
Unit Number:  Unit 4.1
DOI:  10.1002/0471142905.hg0401s45
Online Posting Date:  May, 2005
Princípio do método
Extração de sangue periférico
Separação dos linfócitos (Ficoll)
Cultivar os linfócitos em meio de cultura + fitohemaglutinina
(2-4 dias)
Colheita
Adicionar colchicina as culturas
Solução hipotônica
Solução fixadora
Preparação das lâminas
Coloração por Giemsa
Bangs et al., 2005. Current Protocols in Human Genetics
 
Metáfases coradas com Giemsa: análise de dicêntricos, anéis e outras aberrações cromossômicas 
John R.K. Savage
Aberrações cromossômicas
DOSIMETRIA BIOLÓGICA
CURVA DE CALIBRAÇÃO PARA RADIAÇÃO IONIZANTE
Curva Linear quadrática (Baixo LET)
Y =  D +  D2
Y= frequência de dicêntricos e anéis
D= dose (Gy)
 = coeficiente linear
 = coeficiente da D2
Curva linear (Alto LET):
 Y=  D 
Pinto et al., (2010), Radiat Environ Biophys
Aplicada em caso de acidente logo após a exposição à radiação.
Deve ser analisada após a primeira divisão e antes de 3 meses pós-irradiação.
The reason for that is
related to differences in the quantity of energy deposited
per micrometre of an ionization track, leading to a different
biological effectiveness as a function of different types of
radiation (IAEA 2001).
36
A técnica do micronúcleo é utilizada para biomonitoramento de agentes genotóxicos in vivo e in vitro, sendo utilizado em diversas áreas como farmacogenômica ou como preditor de radiossensibilidade de tecidos normais e tumorais.
Eventos:
 clastogênicos
aneugênicos
Radiação ionizante
CITOCALASINA – B
Bloquieio na citocinece
38
Fenech et al., (2007), Nature Protocols 2, 1084 - 1104
 
Índice de 
divisão nuclear
500-1000 células
Morte celular
Danos 
1000 células binucledas
Fenech, M., 2006 Mutation Research
NDI=(M1 + 2M2 + 3M3 + 4M4)/N
Análise cromossômica em linfócitos de sangue periférico
Grupo exposto: médicos e técnicos
Tipo de exposição: raios- e raios-X
Tempo de exposição:19,8 (8 a 26 anos)
Dose acumulada total avaliada por dosimetria física: 9,5 a 209,42 mSv (média: 55,41 mSv)
Aumento estatístico de aberrações cromossômicas comparado ao grupo controle
Doses absorvidas calculadas por dosimetria estavam dentro dos limites estabelecidos pelo Comitê Internacional de Proteção Radiológica (ICRP)
O estudo sugere que esse aumento no dano cromossômico pode ser perigoso, sugerindo que estudos citogenéticos sejam feitos juntamente com a dosimetria física para monitorar os trabalhadores.
Conclusões
Burdak-Rothkamm et al., 2007
Detecção de foci de gamma-H2AX
Short et al., 2007
Hibridação in situ fluorescente (FISH)
Ainda não estabelecido em pacientes com irradiação total do corpo
Tentativa da utilização desta técnica para a estimativa de doses absorvidas anos após a exposição
Problemas:
Estabilidade das translocações dependem da co-ocorrência de alterações instáveis
Podem ser eliminadas
Preparação cromossômica em lâminas de vidro
Desnaturação do DNA
Hibridação com sonda marcada
Renaturação
Análise por microscopia de fluorescência
O acidente com o 137Cs em Goiânia (Brasil) em 1987
 Atividade da fonte de 137Césio era de 50,9 TBq, com uma taxa de dose de 4,6 Gy/h a 1 metro;
 Exposição externa e/ou contaminação interna de 245 pessoas, sendo que 130 foram atingidas em grau mais elevado, havendo 4 vítimas com óbito;
 Sintomas da contaminação: náusea, vômito, tontura e diarréia; 
Objetivos
Determinação de freqüências de translocações cromossômicas em vítimas do 137Césio de Goiânia, 10 anos após o acidente
Realização de dosimetria biológica retrospectiva
Material e Métodos
Amostras de sangue de 10 indivíduos expostos ao acidente, e 5 indivíduos controle.
Doses de 0.5, 1.0, 2.0, e 3.0 Gy para a construção da curva de calibração
Utilização das sondas para os cromossomos 1, 4 e 12 (19% do genoma)
Resultados
Curva de calibração (translocações terminais, reciprocas e intersticiais). Sondas para os cromossomos 1, 4 e 12
Dose estimada pela análise por dicêntricos foi maior do que a de análise por translocações
Valores similares para os pacientes com dose absorvida de menos de 0,3 Gy
Diminuição no número de translocações pode estar envolvida na eliminação de células contendo grandes quantidades de danos
Discrepância entre as doses estimadas mostra a limitação do uso de reconstrução de dose absorvida no passado. Necessidade de fatores de correção: persistência de tranlocações em linfócitos circulantes, idade e fumo
Efeitos tardios do tratamento anticâncer
Estudo em pacientes pediátricos curados de Leucemia e Linfoma
Detecção dos genes ABL (9) e BCR (22) por FISH
B: BCR/ABL fusion in interphase nuclei, t(9q34; 22q11.2)
22
22
9
9
A: BCR and ABL genes detected in metaphase
(lymphocytes)
A
B
controles (n=8), pacientes LNH/LH (n=8) e LLA (n=8).
* p<0,05 relativamente aos controles
Fusões BCR/ABL1 em pacientes curados - linfoma e leucemia
Efeitos tardios das terapias anticâncer
*
Brassesco et al., J Biomed Biotechnol. 2011, pub. Online doi:10.1155/2011/230481
Comet assay – “single cell gel eletrophoresis”
Evaluation of DNA damage
DNA damage: Analysis by the Komet score software IV
(Perceptive Instruments)
Mutagenesis vol.18 no.3 pp.265–271, 2003
100 voluntários
50 expostos ocupacionalmente
50 não expostos
17,8 anos de exposição
último ano: 0- 8548 μSv
Trabalhadores
Controle
Aumento nos níveis de danos no DNA de indivíduos expostos, em relação ao grupo controle
Não houve diferenças nos níveis de danos entre fumantes e gênero em pessoas expostas em relação as não expostas
A técnica do cometa mostrou-se um bom complemento ao procedimento padrão de dosimetria.
Revela o nível de dano no DNA dos trabalhadores no momento da amostragem
DNA MICROARRAYS: análise de expressão gênica (RNAm)
Analisa a expressão gênica simultânea de milhares de genes.
Avalia efeitos de tratamentos, doenças, estágios de desenvolvimento, etc.
Específicos padrões de expressão gênica podem ser associados com tipos específicos de danos (lesões no DNA) e/ou com classes químicas específicas: determinação dos mecanismos de ação do agente.
Microarranjos de cDNA
Aquisição de imagem
Normalização dos dados
Análise dos dados
Cluster
Treeview
S.A.M.
Significance Analysis of Microarrays (Tusher et.al., 2001)
Indivíduos: N = 9 controles
			N = 15 trabalhadores expostos ocupacionalmente
Doses absorvidas: 0.70 to 39 mSv. 
Análise de perfis de expressão pelo método dos microarranjos (4300 genes).
40 genes foram modulados significativamente(q < 0.05) 
Gene expression profiles in chronically exposed individuals (radiation workers)
25% genes induzidos
75% genes reprimidos
Processos biológicos:
 ciclo da ubiquitina (UHRF2 and PIAS1);
Reparo no DNA (LIG3, XPA, XPG);
Ciclo celular / proliferação (RHOA, SEPT6, CABLE2, TGFB2, IL16);
Resposta ao estresse (GSTP1, PPP2R5A, DUSP22). 
-4x
4x
(log2)
Fachin et al., J. Radiat. Res., 2009
Muitas vias moduladas podem levar a desregulação de vias metabólicas aumentando o risco de carcinogênese
Possibilidade de utilizar esses genes como biomarcadores de dano.
Necessidade de novos estudos para definir a dose segura de radiação
Obrigado!!!
E-mail: paulodauria@usp.br