Técnicas básicas de microbiologia

Prévia do material em texto

TÉCNICAS BÁSICAS DA 
MICROBIOLOGIA
Técnicas básicas da Microbiologia
DUAS OPERAÇÕES BÁSICAS EM MICROBIOLOGIA
CULTURA DE MICRORGANISMOS
Crescimento de populações de microrganismos em meios de cultura laboratoriais
(usualmente, em cultura pura)
ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS
Separação de estirpes microbianas específicas a partir de populações mistas
(ex. amostras ambientais, amostras clínicas) 
Técnicas de assépsia e de esterilização
Preparação de meios de cultura
Isolamento de culturas puras 
Microscopia
Manutenção de células viáveis no laboratório
Preparação de meios de cultura
A composição de um dado meio de cultura está
dependente da espécie que se pretende cultivar. 
O conhecimento do habitat natural de um dado microrganismo é
muitas vezes útil na selecção do meio de cultura adequado, já
que as suas necessidades nutricionais reflectem esse mesmo 
habitat.
ELEMENTOS ESSENCIAIS
Enxofre (S)
(~ 1% do peso seco da célula) Proteínas, coenzimas
Carbono (C) 
(Elemento comum a todos os 
constituintes celulares 
~ 50% do peso seco da célula)
Proteínas, ácidos nucleicos, polissacáridos, lipidos
Azoto (N) 
(~ 14% do peso seco da célula) Proteínas, ácidos nucleicos, coenzimas
Fósforo (P)
(~ 3% do peso seco da célula) Fosfolípidos, ácidos nucleicos, ATP
Hidrogénio (H)
(~ 8% do peso seco da célula) Proteínas, ácidos nucleicos, polissacáridos, lipidos
Oxigénio (O) Proteínas, ácidos nucleicos, polissacáridos, lipidos(~ 20% do peso seco da célula)
Fontes de energia
Fontes de Carbono
- CO2
- Compostos orgânicos
CATEGORIAS
NUTRICIONAIS
DOS
MICRORGANISMOS
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Chlorophyll or
bacteriochlorophyll
Maior parte dos microrganismos
usam um de três tipos de 
fontes de energia
Fig. 9.1
Macronutrientes (�)
Macronutrientes – Fontes de elementos principais 
(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
(g/l)
(mg/l)
(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
Micronutrientes ou elementos traço (µg/l)
Vitaminas – factores de crescimento essenciais.
(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
•Meios de cultura sintéticos ou definidos – meios 
de cultura cuja composição química é perfeitamente conhecida. 
•Meios de cultura complexos - meios de cultura cuja 
composição exacta é desconhecida. Podem ter como componentes 
diversos ingredientes, tais como Peptonas, Extracto de Levedura, 
Extracto de Carne, etc.
PEPTONAS 
Hidrolizados de 
proteínas preparados 
por digestão 
proteolitica parcial 
de fontes proteicas
(p.ex. extracto de 
carne, caseína, soja, 
gelatina, etc.). Os 
aminoácidos e 
pequenos péptidos 
resultantes servem 
como fonte de 
carbono (C), de 
energia e de azoto 
(N), para os 
microrganismos. 
EXTRACTO DE 
LEVEDURA
(“Yeast extract”)
Obtido a partir da lise 
de células de levedura 
da cerveja e hidrólise 
dos seusconstituintes.
Fonte de vitaminas, 
compostos de 
Carbono (C), de azoto 
(N) e sais minerais. 
Meios selectivos
suprimem o crescimento de 
determinados 
microrganismos em 
benefício de outros.
(ver aula sobre “cultura de 
enriquecimento”)
Meios de cultura liquidos e sólidos
Agar
agente solidificante 
(polissacárido de alga marinha vermelha) 
Os meios de cultura podem ser usados na selecção e crescimento de um 
determinado microrganismo ou na identificação de uma espécie em particular. 
Meios diferenciais
permitem a distinção entre diferentes 
grupos de microrganismos com base na 
capacidade de metabolizar componentes 
específicos presentes no meio de cultura 
e/ou 
na morfologia (aparência) das colónias. 
Permitem, por vezes, a identificação de 
microrganismos com base nas suas 
características fisiológicas. 
Meios selectivos e meios diferenciais
(In J. Black, Microbiology, principles and exploration, 6th ed, J Wiley & Sons)
Microrganismos são ubíquos 
(água, ar, solo, corpo, etc.)
Solo
ar
língua
Figura mostra colónias de microrganismos (na superfície de meio sólido)
Pasteur – Sec. XIX
. Refutação final da teoria da geração expontânea
. Desenvolvimento de técnicas de esterilização
eficientes
(pasteurização)
(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
Crescimento microbiano em meio líquido ⇒ turbidez
Esterilização no Laboratório 
CALOR
CALOR SECO - em estufa (160ºC/2horas; 180ºC/1 hora)
- pouco eficiente
- em desuso; só aplicável a material de vidro
ou outro resistente a temperaturas altas
CALOR HÚMIDO – na AUTOCLAVE
FILTRAÇÃO
RADIAÇÃO Ultra- Violeta (λλλλ = 260 nm)
Limitada a superficies (p.ex. salas, pequenos compartimentos, superficie de utensílios
(Não penetra vidro, filmes sujos, água, etc.)
ESTERILIZAÇÃO – Morte ou remoção de todos os organismos vivos, estruturas 
biológicas e virus de um material, meio de cultura, etc. (in Brock Biology of Microorganisms)
na AUTOCLAVE
por acção do calor húmido*
Esterilização
CONDIÇÕES DE 
ESTERILIZAÇÃO
NA AUTOCLAVE
121ºC (pressão: 1 bar)
Duração depende de:
Volume de material 
dentro da autoclave; 
Grau de contaminação do 
material a esterilizar
(usual – 15 min)
* Vapor de água saturado,
sob pressão (1 bar)
APLICADA A:
- Meios de cultura sem 
componentes termolábeis
(p.ex. muitos açucares, aminoácidos, 
vitaminas, não são estáveis a 121ºC)
- Materiais de plástico ou vidro
- Descontaminação de materiais
contaminados com células viáveis(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
ENDÓSPOROS:
- Presentes na água, solo, etc
- Podem permanecer viáveis durante muito tempo 
(décadas; milhares/milhões(?) de anos – encontrados em locais arqueológicos, no intestino de 
abelha extinta preservada em ambar)
- Algumas bactérias que os produzem são agentes de doenças graves (ex. Tétano, Botulismo)
Esterilização na autoclave Porquê 121ºC, durante pelo menos 15 minutos?
Condições que causam a MORTE CELULAR:
Levedura
Bolor
Bactéria
Vírus
Células vegetativas
5 min a 50-60ºC
30 min a 62ºC
10 min a 60-70ºC
30 min a 60ºC
Esporos
5 min a 70-80ºC
30 min a 80ºC
2-800 min a 100ºC
ou 0,5-12 min a 
121ºC
-
Esporos bacterianos (endósporos) são as estruturas biológicas 
mais resistentes ao calor
(é a sua extrema resistência que determina quais as condições de 
funcionamento da autoclave que asseguram uma esterilização eficiente dos materiais)
Bacillus sp.
Endósporo
Célula
vegetativa
(Perry, Staley, Lorry, Microbial Life, Sinauer ed.)
TESTE QUE PODE SER USADO 
PARA VERIFICAR O FUNCIONAMENTO EFICIENTE DA AUTOCLAVE
“Spore strip” = Tira de papel esterilizada contendo sobre a superfície endósporos de uma 
bactéria (p.ex. do género Bacillus)
(1)
(2)
Esterilização 
por filtração
(In J. Black, Microbiology – Fundamentals and Applications, 
J. Wiley and sons) 
APLICADA A: 
���� Líquidos
- Soluções de compostos sensíveis a temperaturas altas
(p.ex. antibióticos, vitaminas, aminoácidos, açucares 
podem sofrer alterações, incluindo degradação, a 121ºC)
-Meios de cultura liquidos com componentes termossensíveis
���� Gases 
Esterilização do AR por filtração
• Máscaras cirurgicas
• Rolhas de algodão nos frascos
onde são cultivados
microrganismos
. Sistemas usados para filtrar ar
que entra em bioreactor
• Filtros HEPA
(“high-efficiency particulate air 
filters”)
(eficácia de retenção de 99,99% para
particulas de 0,3 µg)
usados em:
- câmaras de fluxo laminar
de segurança biológica
- salas limpas (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Câmaras de FluxoLaminar de Segurança Biológica
(vários graus de contenção biológica)
Segurança Biológica 
(nível de contenção 4)
( In Microbiology today, vol 33, pag 18)
Transferência de culturas de microrganismos - Técnicas de assépsia
(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
Chama do bico de Bunsen
(Vizinhança da chama do bico de Bunsen oferece condições assépticas)
Ansa de repicagem 
(filamento metálico)
A imobilização das células num meio sólido torna possível a visualização do 
crescimento em massas celulares homogéneas e isoladas denominadas colónias. 
Isolamento de
colónias pela técnica 
de RISCADO EM
MEIO SÓLIDO
(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
Isolamento de colónias em meio sólido
Colónia – cultura pura de um microrganismo
A cultura pura de um dado microrganismo é uma cultura de células genética e 
morfologicamente idênticas. 
(Inóculo inicial
num ponto da superfície 
de meio de cultura sólido)
1ª geração 2ª geração 3ª geração
...
...
CRESCIMENTO MICROBIANO é exponencial
Isolamento de colónias de microrganismos 
Técnica de ESPALHAMENTO em meio sólido
Após incubação à T ambiente durante 24 h 
Exemplo:
Suspensão de solo em água
(População mista de microrganismos)
COLÓNIAS COM MORFOLOGIAS DIFERENTES 
→ MICRORGANISMOS DIVERSOS
(Noção de estirpe) 
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Morfologia de colónias
forma e tamanho dependem do microrganismo
mas, também podem depender das condições ambientais,
tais como, quantidade de oxigénio e
nutrientes disponíveis no meio de cultura, pH,etc.. 
Robert KOCH (1876) – primeiro cientista a definir CULTURA PURA e
a isolar COLÓNIAS de bactérias em meios de cultura sólidos.
R. Koch
Microfotografia de bactérias 
provenientes de uma colónia
isolada (confirmação de ser 
um único tipo morfológico) 
Bacillus anthracis
(desenhos de R. Koch, sec XIX) 
(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
Passo1. Diluições sucessivas da 
suspensão de solo
(10-1 ou 1: 10; 
10-2 ou 1: 100; 
10-3 ou 1: 1000; 
10-4 ou 1: 10000; 
...)
Solo – população mista
- vários triliões de células
de microrganismos
diversos
Suspensão de solo em água
(10g / 100 ml)
Passo 1. 
Passo 2. 
(In R. Maier, I L Pepper, C P Gerba, Environmental Microbiology, Academic Press)
Passo 3a 
Passo 3b 
Passo 4. 
Isolamento de colónias e 
enumeração de Unidades Formadoras de Colónias (UFC) – células viáveis
(p.ex. numa amostra de solo)
0,1 ml
Nº de colónias em cada placa de Petri está
relacionado com o tamanho da POPULAÇÃO 
CULTIVÁVEL presente na amostra original de solo
Tipos morfológicos diferentes das colónias
em cada placa relacionado com a diversidade
de microrganismos cultiváveis presentes 
no solo.
Bactérias Fungos miceliais (bolores)
Diluição 10-2 10-3 10-4
50 colónias (diluição 10-3)
50 x 10 x 103 UFC / ml suspensão de solo (A) 
50 x 106 UFC / 100 ml de suspensão de solo 
/10 g de solo
(In R. Maier, I L Pepper, C P Gerba, Environmental Microbiology, Academic Press)
CULTURA DE 
ENRIQUECIMENTO
Isolamento de
microrganismos
pouco abundantes e
com requerimentos
nutricionais específicos,
a partir de populações
mistas
(p.ex. bactérias que são capazes
de degradar benzoato, i.e.
usam benzoato
como fonte de C e 
energia).
Outros exemplos:
- Isolamento de bactérias que 
degradam um certo 
pesticida ou
hidrocarbonetos do
petróleo ou 
outros poluentes orgânicos
do Ambiente.
Crescimento em 
meios de cultura selectivos
1º) enriquecimento em meio liquido
(nas bactérias em causa)
2º) isolamento de colónias
em meio sólido
(adaptado de Perry, Staley, Lory, 
Microbial Life, Sinauer ed.)
PRESSÃO SELECTIVA 
presença de fonte de C e energia 
única (neste caso, benzoato)
versus
Bactérias observáveis numa amostra de solo 
(observação directa através de microscópio 
de fluorescência)
4.2 x 1010 Células totais / g solo
4.2 x 10 UFC de bactérias / g solo 
UFC=CFU
Unidades Formadoras de Colónias
(Colony Forming Units)
6
vs
Diversidade microbiana no solo é uma fonte
importante para exploração biotecnológica de 
NOVOS microrganismos, produtos e processos
LIMITAÇÃO DAS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO DE COLÓNIAS
Estima-se que que somente 1-10% dos microrganismos funcionais presentes nos ambientes naturais 
(p.ex solo, água, amostras clínicas) são cultiváveis em meios de cultura laboratoriais conhecidos
Células viáveis, mas não cultiváveis
Exploração das potencialidades dos microrganismos “não-cultiváveis”
nos meios de cultura laboratoriais conhecidos
- Desenvolvimento de métodos moleculares (não dependentes do cultivo) 
para pesquisa e identificação ( ex. Análise de DNA, RNA, proteínas) 
-Procura de “novas fórmulas” para cultivo de microrganismos
(Prescott, Harley e Klein, “Microbiology”, 5th edition)
���� Procura de microrganismos adequados para um processo industrial:
- a partir da Natureza / Ambiente (solo, água, etc.) 
� Estirpes adequadas (estirpes selvagens, mutantes ou geneticamente 
manipuladas) são conservadas em coleccções de culturas nacionais 
e internacionais
(por ex. Micoteca da Universidade do Minho, American Type Culture Collection – ATCC,
National Collection of Industrial Cultures - UK)
Maximizar o rendimento do processo
Novos produtos
- são frequentemente sujeitos a processos de melhoramento
(Engenharia Genética; mutação)
Manutenção de microrganismos viáveis no Laboratório e em Colecções de Culturas
. Em rampas ou placas de Petri contendo meio sólido
(viabilidade das células: dias ou semanas)
. Congelação
(células suspensas em meio de cultura + glicerol (anti-criogénico) 
(viabilidade das células: anos)
- em Azoto líquido (-196ºC)
- em Arcas congeladoras (-70ºC)
. Liofilização
(liofilização - desidratação das céluas por 
sublimação de água congelada, sob vácuo)
(viabilidade das células: anos; décadas)
Várias metodologias permitem a manutenção de culturas viáveis, não contaminadas e 
inalteradas nas suas propriedades durante períodos de tempo mais ou menos longos, 
nomeadamente: