Aula Replicação

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REPLICAÇÃO DO DNA
A replicação do DNA é semiconservativa
Replicação do DNA em procariotos
	A replicação de DNA envolve uma variedade de enzimas, muita dessas enzimas foram isoladas primeiramente em procariotos sendo, portanto melhor compreendidas em procariotos. Assim iniciamos com a descrição sobre a replicação de E. coli.
	
	
Na bactéria E. coli, há uma região do DNA que contém a origem de replicação do cromossomo chamada de oriC, 
A região oriC - apresenta uma seqüência rica em CATC
Em células eucarioticas, o processo de replicação ocorre durante o período de síntese (S) do ciclo celular.
Origem de replicação:
 
	A replicação do DNA ocorre ao longo da molécula, a partir de um ponto de origem. 
origem isolada de procariotos e de alguns eucariotos – são ricas em sequência AT.
 
células procarióticas, vírus e plasmídeos – só tem 1 origem de replicação.
 
células eucarióticas – várias origens de replicação
Replicação do cromossomo de E. coli.
 
 
A síntese de uma molécula de DNA pode ser dividida em 3 etapas: 
-iniciação, 
alongamento e 
 terminação
A oriC (ponto de origem da replicação) consiste de 245 pares de bases (pb) muito dos quais são altamente conservados entre as bactérias.
 
quatro seqüências de 9 pb
Figura 1- O arranjo de seqüências na origem de replicação da E. coli, chamada de oriC.
 
FASE DE INICIAÇÃO
Enzimas que participam da fase de iniciação:
 
DnaA – a ligação da dnaA a quatro locais em oriC próximos aos grupos de 13 ricos em AT inicia um intrincado processo de etapas que levam ao desenrolamento do molde de DNA e síntese de um primer. O DNA tem que ter superelicoidização negativa para possibilitar a ligação de dnaA. 
 
As proteínas dnaB e dnaC juntam-se à dnaA para dobrar e abrir a dupla hélice.
A proteína dnaB é uma helicase: ela catalisa o desenrolamento da dupla-hélice de DNA.
A parte desenrolada do DNA é então estabilizada por uma proteína ligadora de fita simples (SSB) a um filamento de DNA. 
O desenrolamento do DNA circular na origem produz uma superelicoidização positiva, que tem que ser aliviada para permitir que a replicação continue. O alívio é fornecido pela enzima DNA girase, que introduz superélice negativa à medida que hidrolisa ATP.
O molde do DNA é então exposto, mas o novo DNA não pode ser sintetizado até que um primer seja construído. (lembre-se que a DNA polimerase necessita de um primer com uma 3’ OH livre para a síntese do DNA). O RNA serve como primer para a síntese do DNA. 
A enzima RNApolimerase, chamada de primase junta-se ao pré-primer em uma montagem de múltiplas subunidades chamado de primossomo. A primase sintetiza um filamento curto de RNA (~5 nucleotídeos) que é complementar ao filamento molde do DNA. 
Obs: O primer de RNA é removido no final da replicação pela atividade 5’  3’ da DNA polimerase I.
A holoenzima DNA polimerase III catalisa a formação de muitos milhares de ligação fofodiester antes de liberar seu molde (a DNA polimerase III não deixa o molde de DNA até que ele tenha sido replicado), em comparação a apenas 20 para a DNA polimerase I ( usado como preenchedora de espaço ou de reparo). 
A DNA polimerase III se posiciona na forquilha de replicação, onde começa a síntese da fita contínua (leading) e da fita descontínua (lagging). Usando o primer de RNA formado pela primase. A proteína de ligação (SSB) mantêm o DNA desenrolado distendido e acessível, de modo que ambos os filamentos podem servir como molde.
O fita contínua (5’3’) é sintetizada continuamente pela polimerase III, que são libera o molde até que a replicação tenha sido completada. A DNA girase concomitantemente introduz superélices negativas para evitar uma crise topológica.
 
A fita descontínua (3’5’) é sintetizada em fragmentos pela polimerase III de modo que a polimerização 5’ 3’ leva um crescimento geral no sentido 3’5’. A DNA polimerase III deixa a fita descontínua após cerca de 1000 nucleotídeos adicionados, formando um fragmento de Okazaki. Um novo primer é sintetizado pela primase para iniciar a formação de um novo fragmento de Okazaki. 
Os espaços entre os filamentos nascentes (fragmento de Okazaki) são preenchidos pela DNA polimerase I. Esta enzima também usa a sua atividade de exonuclease 5’ 3’ para remover o primer de RNA. O primer não pode ser removido pela DNA polimerase III porque a enzima não tem a atividade de exonuclease 5’ 3’. Finalmente a DNA ligase une os fragmentos.
Proteína
função
Helicase (dnaB)
Desenrola a dupla hélice
Primase
Sintetizaprimersde RNA
SSB
Estabiliza regiões unifilamentares
DNA girase
Introduz superélices negativas
DNA polimerase III
Sintetiza o DNA
DNA polimerase I
Elimina oprimere preenche os espaços
DNAligase
Une as pontas do DNA
Resumindo a função de cada enzima:
Figura 3 – O primer do RNA é removido pela atividade de exonuclease 5’3’ da DNA polimerase I. O espaço na filamento filho é então preenchido pela ação de polimerase desta enzima. A enzima DNA ligase catalisa a etapa final de ligação.
Figura complementar- Diagramas de moléculas de DNA que diferem em sua superelicoidização. A maioria das moléculas de DNA de ocorrência natural tem superelicoidização negativa.
Alguns Vírus tumorais com RNA e outros retrovírus se replicam por meio de DNAs intermediários de dupla hélice. 
 
Quando o RNA viral entra na célula hospedeira. Este RNA é o molde para a síntese de um filamento complementar de DNA pela enzima transcriptase reversa, uma enzima viral que também entra na célula hospedeira. 
A transcriptase reversa sintetiza o DNA a partir do RNA, formando o híbrido DNA-RNA. O novo DNA serve como molde para a síntese da sua dupla fita, esta dupla fita de DNA viral fica incorporado no DNA cromossômico do Hospedeiro e se replica juntamente com o DNA celular normal no curso da divisão celular. Posteriormente, o genoma viral integrado se expressa para formar o novo RNA e proteínas virais, que se juntam em novas partículas virais.
 
Transcriptase reversa
Transcriptase reversa
RNA
DNA
RNA Viral
Proteínas Virais
Novas Partículas Virais
Integração do DNA viral ao genoma
Núcleo da célula
DNA