Métodos-Biof-de-Análise-Rep

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Profa. Dra. Iracy Lea Pecora 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2011 
 
 
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MÉTODOS BIOFÍSICOS DE ANÁLISE 
 
A análise de soluções diluídas na investigação científica ganhou grande importância ao 
longo dos anos, pois permitiu o fracionamento, a identificação e a quantificação de substâncias 
envolvidas em diversos e diferentes processos. 
Os métodos biofísicos de análise fundamentam-se em fenômenos físicos que, aplicados 
sobre as substâncias, promoverão sua separação ou caracterização. Dessa forma, tem-se: 
1) Os métodos fotométricos, que avaliam a interação da luz com a matéria; 
2) Os métodos cromatográficos, que se baseiam na ação de forças como gravidade, pressão, 
ligações intermoleculares, etc. sobre a matéria; 
3) Os métodos eletroforéticos, que aplicam um campo elétrico sobre as soluções; 
4) Os métodos de sedimentação acelerada, que se utilizam da força centrípeta para acelerar o 
fenômeno da decantação. 
 
Aqueles métodos que são capazes de identificar as substâncias são ditos QUALITATIVOS. 
Aqueles métodos que permitem a separação dos componentes de uma solução são ditos 
FRACIONÁRIOS e aqueles métodos que determinam a concentração de uma dada substância são 
denominados QUANTITATIVOS. 
De uma forma geral, a seguir estão os principais métodos biofísicos de análise. Este 
material não tem a intenção de esgotar o assunto, mas, fornecer a base para se compreender os 
princípios utilizados e seus procedimentos. 
 
 
MMÉÉTTOODDOOSS FFOOTTOOMMÉÉTTRRIICCOOSS oouu 
MMÉÉTTOODDOOSS DDEE MMEEDDIIDDAA DDEE AABBSSOORRÇÇÃÃOO EE EEMMIISSSSÃÃOO DDEE LLUUZZ 
 
I. FUNDAMENTO 
Átomos e moléculas NÃO podem ter quantidades arbitrárias de energia. Somente certos 
níveis são possíveis e a condição necessária para a interação entre moléculas e radiação 
eletromagnética é que dois níveis de energia (E: energia do fóton ou quantum) difiram por: 
E = h onde 
h é a constante de Planck (6,63 x 10-27 erg/seg) e  (“ni”) é a 
frequência da radiação. 
A interação envolve excitação atômica, onde os 
elétrons se distanciam ou se aproximam do núcleo, recebendo 
ou eliminando energia. Essa interação depende de “pacotes” 
pré-definidos para cada átomo, orbital ou elétron. Ou seja, 
esse fenômeno somente ocorre associado a esses valores de 
energia. Na Figura 1, encontra-se o Diagrama de Níveis de 
Energia para o átomo de hidrogênio. A excitação atômica pode 
ocorrer no átomo isolado ou mesmo se inserido em uma 
substância, em orbitais mais internos ou externos. 
Além da excitação atômica, há movimentos 
internos das moléculas como um todo (rotação, torção, 
distensão, etc.), onde as ligações químicas permitirão 
movimento característico de cada radical ou componente. Na 
Figura 2 estão representados três movimentos possíveis para a 
molécula de butano. 
Dessa forma, é possível até identificar certas 
substâncias, pela presença de radicais ou ligações químicas 
particulares. Como exemplo, tem-se as proteínas, cuja 
presença é detectada por absorverem energia de ondas 
eletromagnéticas de 280nm ou abaixo de 220nm. 
Figura 1 - Diagrama de níveis de 
energia para o átomo de hidrogênio. 
(www.colegiosaofrancisco.com.br/alfa
/fisica-moderna/fisica-moderna-
4.php). 
3 
 
A absorção em 280nm deve-se à presença de 
certos aminoácidos (fenilalanina, cisteína, triptofano, 
cistina, metionina, histidina e tirosina), que fazem com 
que a curva de absorção espectral (veja adiante) de 
proteínas apresente um pico nesse comprimento de onda 
(Figura 3). A absorção abaixo de 220nm é devida à 
ligação peptídica. Assim, a determinação da absorção em 
280nm, fornece uma avaliação semi-quantitativa da 
presença de proteínas e a determinação em 220nm ou em 
valor menor, fornece um valor mais próximo do real. 
A absorção da radiação eletromagnética de 
uma forma geral pode ocorrer desde a faixa da radiação 
ultravioleta até o infravermelho. 
Os métodos fotométricos foram inicialmente 
desenvolvidos para medir a absorção da luz de forma 
padronizada. Entretanto, algumas substâncias por 
possuírem a característica de se excitarem após a 
interação com a radiação eletromagnética, e depois 
voltarem ao estado fundamental emitindo luz visível, 
permitiram o estabelecimento dos métodos fotométricos 
de emissão. São as substâncias fluorescentes, muito 
presentes nos seres vivos. 
 
Mais recentemente, surgiram os 
métodos fotométricos que exploram uma das 
características dos elementos metálicos: absorver 
e emitir o mesmo comprimento de onda. São os 
métodos de fotometria e espectrofotometria de 
absorção atômica. 
 
 
 
 
 
 
 
 
II. ESQUEMA GERAL 
 
 ABSORÇÃO EMISSÃO 
 
 IE(1) 
 
 
 
 I0() I0() 
   IT () 
      
   IT ()    
      
 IR IA IR IA 
 
 
Sendo: 
I0: luz incidente ou excitadora IT: luz transmitida IR: luz refletida 
IA: luz absorvida (refratada) IE: luz emitida 
 
Figura 2 - Molécula de butano sendo 
deformada elasticamente por: a) uma 
distensão; b) uma flexão e c) uma torção 
(http://w3.ufsm.br/juca/oscila.htm). 
Cubeta 
contendo a 
amostra 
Figura 3 (ao lado) – Curva de absorção espectral 
típica de proteínas, mostrando pico em 280nm 
devido à presença de certos aminoácidos. 
(www2.iq.usp.br/docente/mhgdmede/.../Purificacao_
Proteinas_Maycon.pdf). 
 
 
4 
III. MÉTODOS FOTOMÉTRICOS 
Classificam-se em dois grupos: 
a) Métodos fotométricos por ABSORÇÃO, que relacionam a quantidade e o comprimento de 
onda da luz que foi capaz de interagir (= absorvida) com a substância: Colorimetria, 
Fotocolorimetria, Espectrofotometria, Fotometria de Absorção Atômica, além de 
Turbidimetria e Nefelometria 
b) Métodos fotométricos por EMISSÃO, que relacionam a emissão de luz na faixa do visível e 
seu comprimento de onda (= fluorescência) com a substância que foi excitada por raios na 
faixa do ultravioleta ou pelo calor: Espectrofluorimetria e Fotometria de Chama. 
 
 
III.1. MÉTODOS DE MEDIDA DA ABSORÇÃO DA LUZ 
III.1.a. ESPECTROFOTOMETRIA 
A interação da luz como visto, dá-se de forma especial, envolvendo pacotes de energia 
pré-determinados. Isso implica na necessidade da mesma ser monocromática. Dessa forma, 
antigamente, existindo apenas fontes de luz policromática (lâmpadas), houve a necessidade de se 
desenvolverem técnicas para selecionar os comprimentos de onda desejados. Atualmente, são usadas 
lâmpadas de deutério, que emitem radiações eletromagnéticas menores que 350 nm e de tungstênio 
ou tungstênio-halogênio, que emitem luz branca, para excitação na região do visível e infravermelho 
próximo (>350 nm). 
Essas lâmpadas emitem luz policromática e espalhada em todas as direções e, para o uso 
nos aparelhos fotométricos, os raios necessitam ser paralelos, formando feixes, e monocromáticos, 
criando dois problemas que os aparelhos fotométricos resolveram de forma semelhante, mas 
diferente. 
Para solucionar a emissãode luz policromática em todas as direções a partir da lâmpada, 
inicialmente os raios luminosos são direcionados e concentrados por espelhos para atingirem um 
colimador, que tem como papel, tornar os raios paralelos (feixe). Os colimadores são lentes 
convergentes onde os raios incidentes passam pelo foco e saem paralelos ao eixo principal (Figura 4). 
Na Física, aprende-se que a lente 
convergente caracteriza-se por concentrar os raios 
incidentes que chegam paralelos ao eixo óptico, 
em um só ponto que define o Foco. No colimador, 
o sentido é oposto: todos os raios incidentes que 
passarem pelo foco, sairão paralelos ao eixo óptico 
(Figura 4). Dessa forma, obtêm-se feixes 
paralelos de luz policromática. 
Esses raios atingem um prisma que 
fará a decomposição da luz nos seus diferentes 
comprimentos de onda, obtendo-se feixes de luz 
monocromatizada (Figura 5). 
 
Para selecionar o comprimento de 
onda necessário para a excitação da 
substância, podem ser utilizados dois 
recursos: filtros e fendas. Os filtros (Figura 6) 
são vidros coloridos que impedem a passagem 
de todos os comprimentos de onda menos 
aquele desejado. As fendas (Figura 7) são 
aberturas em um material totalmente opaco e 
escuro que são posicionadas de tal forma que 
somente o comprimento de onda desejado 
consegue ultrapassar. Alguns equipamentos 
possuem somente fendas, outros somente 
filtros, mas, os melhores e de maior precisão, 
possuem os dois sistemas monocro-
matizadores. 
 
Figura 4 – Esquema de ação dos colimadores. 
Figura 5 – Decomposição da luz branca por um prisma 
(http://nautilus.fis.uc.pt/wwwfi/hipertextos/espectro/i
mg/esp_vis_prisma.gif). 
Foco 
5 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
O feixe de luz monocromática atingirá a amostra diluída que se encontra dentro da cubeta 
e, se houver nela uma substância capaz de absorvê-lo, haverá redução da intensidade inicial de luz, 
conforme visto no Esquema Geral (item II). Assim, havendo absorção, IT < I0, ou seja, a intensidade 
de luz transmitida é menor que a da luz incidente. 
A luz transmitida incidirá sobre uma 
fotomultiplicadora que ampliará o sinal de leitura. 
Depois, alcançará a célula fotoelétrica que a 
transformará em sinais elétricos que serão avaliados 
por um galvanômetro. A célula fotoelétrica é 
constituída de um metal que é capaz de transformar 
luz solar ou outra fonte de luz, em energia elétrica. 
Isso ocorre porque é um diodo fotossensível e os 
elétrons mais externos são liberados com a energia 
luminosa, criando uma corrente elétrica. 
Na Figura 8 temos o experimento de 
descoberta do efeito fotoelétrico por Hertz. Os raios 
luminosos (vermelho) ao incidirem sobre o eletrodo 
liberam elétrons que migram ao eletrodo oposto. 
Esse efeito foi melhor estudado e explicado por 
Einstein, justificando seu Prêmio Nobel de 1.921. 
A contribuição de Einstein foi 
determinar que os elétrons liberados somente o 
faziam ao absorver pacotes de energia pré-definidos 
que os excitava a ponto de permitir sua projeção 
para fora do metal (E=h) (Figura 9). 
A célula fotoelétrica é construída com 
metal que sofre o efeito fotoelétrico. Para que 
funcione como captador de vários comprimentos de 
onda, as células fotoelétricas de aparelhos 
fotométricos são feitas de ligas metálicas. 
Como a luz que incide sobre a célula fotoelétrica é a luz 
transmitida (IT) (Transmitância), o aparelho, antes de fornecer o resultado, 
converte-o em absorbância, que é uma grandeza de mais fácil entendimento. 
A Absorbância reflete a quantidade de radiação luminosa 
(energia) que foi absorvida pela amostra. 
 
 
 
 
Figura 6 – Filtros para seleção de comprimento 
de onda. (www.studiolightworld.com/es/ 
components/com_virtuemart/shop_image/produ
ct/ebf59ae2c771a2a86179b516b0b199ad.jpg). 
Figura 7 – Luz decomposta por prisma e 
atravessando uma fenda por onde somente está 
passando o comprimento de onda da luz vermelha 
(www.espacofotografico.com.br/Dicasteoriadecores/t
eorias19.jpg). 
Figura 8 – Descoberta do efeito fotoelétrico 
por Hertz. A aplicação de um campo 
elétrico orientava a migração dos elétrons 
para o eletrodo da direita 
(http://www.fisica.net/einsteinjr/1/efeito_f
otoeletrico_introducao.html). 
Figura 9 – Contribuição de Einstein à descrição do efeito fotoelétrico correlacionando-o 
a valores exatos de energia, dados por E=h. 
(http://www.comciencia.br/reportagens/2005/03/07.shtml). 
Fenda 
 
 
6 
De forma intuitiva, essa absorbância será diretamente proporcional à quantidade de 
substância presente na amostra. Em outras palavras, concentrações crescentes da mesma substância 
(C1<C2), nas mesmas condições de medida, terão absorbâncias crescentes também (A1<A2). Esse 
fenômeno foi estudado por Beer que determinou que a absorbância é diretamente proporcional à 
concentração da substância (Figura 10). 
Paralela e separadamente, Lambert e Bouguer demonstraram que a absorbância dependia 
do comprimento da cubeta, pois um trajeto óptico () mais longo permitiria maior interação entre a 
luz e a substância (Figura 11). 
 
 I0 I1 I0 I2 
 
 
 
 
 
 I0 I1 I0 I2 
 
 
 
 1 2 
 
 
 
Dessa forma, a absorbância é diretamente proporcional à concentração e ao trajeto 
óptico: A  , C. Entretanto, se a fórmula final só dependesse dessas variáveis, substâncias 
diferentes, na mesma concentração, mesmo trajeto óptico e avaliadas no mesmo comprimento de 
onda deveriam apresentar a mesma absorbância. Mas, cada substância pode interagir com a luz de 
formas diferentes, envolvendo ligações químicas e/ou estruturas atômicas, fazendo com que cada 
uma delas apresente um comportamento típico, e, por isso, na fórmula final surge mais um 
componente: o coeficiente de extinção (E), que tem um valor constante para cada substância. 
O coeficiente de extinção pode ser encontrado na literatura científica ou pode ser 
determinado experimentalmente. Para tanto, deve-se possuir a substância pura e isolada e, com ela, 
faz-se 5 soluções de concentrações crescentes e mede-se a absorbância no comprimento de onda 
adequado para essa substância, sempre usando cubetas iguais (mesmo trajeto óptico). Obtém-se um 
resultado como o da Tabela 1, com os quais pode ser construído o gráfico da Figura 12. 
 
Tabela 1 – Valores de Absorbância 
medidos em 500 nm, para concentrações 
molares crescentes da substância. 
C (M) A500 
1 0,1 
2 0,2 
4 0,4 
8 0,8 
16 1,6 
C1 C2 
Figura 10 – Lei de Beer: Duas 
soluções da mesma substância 
com concentrações diferentes 
(C1<C2) ao interagirem com a 
intensidade de luz I0, terão a luz 
transmitida diferente (I1>I2). 
Figura 11 – Lei de Lambert e Bouguer: A mesma solução (C1) colocada em cubetas de trajetos ópticos 
diferentes (1<2) ao interagir com a intensidade de luz I0, terá a luz transmitida diferente (I1>I2). 
C1 C1 
A500 
C 
Figura 12 – Reta obtida na determinação 
experimental do coeficiente de extinção. 
7 
 
A partir dos valores da tabela, determina-se o Coeficiente de Extinção (E) com a relação: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
O Coeficiente de Extinção pode ser determinado em qualquer unidade de concentração e 
no valor de comprimento de onda mais adequado para a substância, em temperatura e cubeta de 
trajeto óptico constantes, tendo por isso, no nosso exemplo, o valor 0,1 (M-1 cm-1).Para facilitar, o 
coeficiente de extinção é indicado com a unidade de concentração e com o comprimento de onda que 
foi determinado: 
E = 0,1 (M-1 cm-1) 
 
Outro exemplo: E coeficiente de extinção determinado em milimolar e em 280nm 
 
Quando se usa a concentração molar, o E se denomina Coeficiente de Extinção Molar. 
A fórmula final para se obter a concentração de soluções desconhecidas a partir da 
absorbância, conhecida como Lei de Lambert-Beer, fica então: 
 
A = E C 
#observar sempre  em cm e C na mesma unidade de E. 
 
A espectrofotometria é metodologia que permite a identificação de substâncias (método 
qualitativo), uma vez que as mesmas interagem de forma específica com a luz. Para tanto, é 
realizada Curva de Absorção Espectral: a solução da substância pura é colocada na cubeta e faz-se 
uma varredura das absorbâncias nos diferentes comprimentos de onda. Na Figura 13 tem-se o 
espectro de absorção da clorofila a; observe que ela apresenta dois picos de absorção: um na faixa do 
azul e outro no vermelho. Na Figura 14 têm-se os Espectros de Absorção dos Pigmentos 
Fotossintéticos, determinados separadamente e sobrepostos para comparação; observe em azul claro, 
o perfil da clorofila a. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
M 
500 
mM 
280 
Figura 14 - Espectros de Absorção dos Pigmentos 
Fotossintéticos determinados separadamente e sobrepostos 
para comparação: todas as vezes que se encontrar o 
espectro da linha azul claro, pode-se afirmar que a 
substância analisada é a clorofila a 
(http://www.colegiosaofrancisco.com.br/alfa/fotossintese/fot
ossintese-e-sua-importancia.php). 
Figura 13 – Espectro de absorção da 
clorofila a, em metanol. Nessas 
condições, essa substância apresenta dois 
picos de absorção: no azul e no vermelho 
(http://www.steve.gb.com/science/photos
ynthesis.html). 
 
 
8 
A espectrofotometria é também um método 
quantitativo. Para tanto, é necessário ter a substância 
isolada e purificada. Com ela, a partir de soluções de 
concentrações conhecidas determina-se uma curva 
padrão (Absorbância x Concentração). Um valor de 
absorbância desconhecido pode ser colocado sobre essa 
curva, construída em papel milimetrado, e então, 
determina-se a concentração experimental (Figura 15). 
Se a representação da Lei de Lambert-Beer for uma 
reta perfeita, na variação de concentração utilizada, 
como na Figura 15, pode-se também determinar uma 
relação entre a Concentração e a Absorbância 
denominada Fator de Calibração (f): 
 
 
 
f = 
 
 
A concentração desconhecida de uma solução pode então ser encontrada com a fórmula, 
a partir da absorbância do desconhecido, obtida no mesmo comprimento de onda: 
 
C = A x f 
 
Quando a substância não apresenta linearidade na Curva-padrão, diz-se que não segue a 
Lei de Lambert-Beer (Figura 16). 
Essa não linearidade pode ocorrer em 
soluções mais concentradas ou muito diluídas e, 
nesse caso, utiliza-se o Fator de Calibração apenas 
para a faixa linear. 
Nesse caso, também se pode 
determinar a concentração desconhecida como foi 
descrito para a curva-padrão: por interpolação. 
O espectrofotômetro é um aparelho 
que pode ler amostras nas faixas do ultravioleta 
(UV), visível (Vis) e infravermelho próximo (IV), 
conforme especificações do fabricante; os 
aparelhos vêm indicados como UV-Vis (mais 
comuns) ou UV-Vis-IV. 
As cubetas podem ser colocadas em 
carrossel com local para o branco e 5 amostras 
experimentais, ou podem ser colocados apenas o 
branco e uma cubeta amostral. 
 
O tubo branco possui uma solução com todas as substâncias contidas na amostra, menos 
o que se quer avaliar na mesma. 
O tubo branco é utilizado para levar a escala do aparelho ao zero, para poder ter o valor 
exato da medida. Esse procedimento é denominado de “zerar”. Assim, as leituras sempre são feitas 
zerando inicialmente o aparelho com o branco. 
As cubetas devem ser feitas de material totalmente transparente; geralmente utiliza-se o 
quartzo ou sílica fundida para leituras em UV e vidro ou plástico para leituras na faixa do visível. Esse 
é um detalhe importante porque a radiação UV não atravessa o vidro, interferindo na leitura. Podem 
ter diferentes valores de trajeto óptico, sendo considerado o valor de 1 cm como o padrão. Sua 
capacidade também varia: 5 ml, 1 ml, 0,5 ml, etc., sendo que, para amostras biológicas, as mais 
empregadas são aquelas de pequena capacidade (0,1 ml) e trajeto óptico de 0,5 cm. 
Figura 15 – Curva-padrão de uma substância. Nas 
condições ideais, sempre resulta em retas, podendo-
se obter a equação do tipo y = ax + b. Neste caso, 
ela vale y = 0,136x + 0,001. Um valor experimental 
de absorbância (0,4) resulta em 3% de concentração 
(v/v), como pode ser visto pelas linhas vermelhas 
(www.bio.txstate.edu/~fxbio/lab2_files/image004.gif) 
Concentração do padrão 
Absorbância do padrão 
Figura 16 – Com este tipo de curva, diz-se 
que a substância não segue a Lei de 
Lambert-Beer, para valores de concentração 
mais altos (http://plato.if.usp.br/1-
2004/fap0181d/Lei%20de%20Beer_files/be
ersdev.gif). 
9 
 
A espectrofotometria pode ser empregada então, para a quantificação de qualquer 
substância que apresente interação específica com a luz, fato que a identificará, sendo por isso, 
metodologia quantitativa e qualitativa. 
Até o momento, foram descritos os procedimentos para a avaliação de uma determinada 
substância pura. Ocorre que, na maioria das soluções biológicas, essa situação nem sempre 
acontece: tem-se, na verdade, uma solução com mais de uma substância. Essa situação cria um 
grande problema, pois, a curva resultante será a soma de seus componentes, prejudicando a 
identificação da substância (Figura 17). 
 
Nem sempre a curva resultante é 
exatamente a soma: vai depender das 
características das substâncias envolvidas. 
 
 
 
Figura 17 – Soma de absorbâncias de soluções mistas 
(http://www.scielo.cl/fbpe/img/jcchems/v50n2/img04-
01.jpg). 
 
 
 
 
III.1.b. COLORIMETRIA e FOTOCOLORIMETRIA 
São metodologias fundamentadas nos mesmos princípios da espectrofotometria; a 
diferenciação se faz pela sensibilidade dos equipamentos: o colorímetro e o fotocolorímetro são 
equipamentos que somente avaliam a absorbância na faixa da luz visível, sendo que o branco é lido 
juntamente com a cubeta da amostra. O sistema óptico subdivide o sinal que é enviado às cubetas 
paralelamente. 
Há equipamentos que permitem a leitura de tubos de vidro, quando a reação pode ser 
lida no mesmo recipiente em que ocorre (tubos de ensaio). 
A variação de comprimentos de onda nestes equipamentos é mais ampla (de 50 em 
50nm), enquanto que no espectrofotômetro, é possível a varredura de 1 em 1nm. 
O colorímetro não é capaz de realizar uma curva de absorção espectral, pois apresenta 
oferta de estreita faixa de comprimento de onda; alguns fotocolorímetros, por sua vez, podem obtê-
la. Esses equipamentos são ideais para rotina, quando se use apenas ondas na faixa do visível. O 
espectrofotômetro é um equipamento mais adequado para laboratórios de pesquisa e para o 
desenvolvimento de novas rotinas 
 
 
III.1.c. TURBIDIMETRIA E NEFELOMETRIA 
O princípio geral da absorção da luz, realizada nos fotômetros descritos até o item 
anterior, somente realizam medidas de soluções em que seus componentes estejam totalmente 
dissolvidos. Entretanto, a redução da transparência da água que ocorre em vários sistemas biológicos 
e no tratamento da água relacionada ao consumo humano, introduziu a necessidade de se avaliar 
coleções aquosas com material particulado ou coloidal em suspensão. Essa medida denomina-se de 
turbidez. O turbidímetro e o nefelômetro são equipamentosadaptados ao conceito da fotometria, mas 
não avaliam absorbância e sim a interrupção da passagem da luz ou a sua dispersão, 
respectivamente. 
Basicamente ambos possuem uma fonte de luz branca que não necessita ser 
monocromatizada, que passa pelo colimador (para tornar seus raios paralelos) e em seguida, incide 
sobre a amostra. 
Para pouco material disperso em suspensão (de aqüicultura, rios, lagos, etc.), determina-
se a turbidez com o turbidímetro, que possui o detector na mesma linha seqüencial do feixe de luz e, 
por isso, mede a luz que conseguiu atravessar por entre as partículas em suspensão. Quando se 
Espectro de absorção 
da solução de A + B 
Espectro de absorção 
da solução B 
Espectro de absorção 
da solução A 
 
 
10 
revolve o sedimento de fundo e se quer avaliar o particulado, é mais adequado utilizar o nefelômetro, 
pois este possui o detector em ângulo de 45 ou 90º, avaliando a luz dispersa pela amostra (Figura 
18); em outras palavras, o turbidímetro avalia misturas mais “diluídas” e o nefelômetro, determina 
misturas mais “concentradas”. 
A unidade de medida da turbidez depende do padrão utilizado para calibrar o aparelho. A 
mais utilizada é unidade de turbidez nefelométrica (NTU ou FTU) cujo padrão é um polímero de 
formazina. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 18 – Turbidímetro à esquerda e Nefelômetro à direita. Observar que o primeiro avalia a luz que consegue 
atravessar a amostra e o segundo, determina o espalhamento da luz por uma suspensão contendo mais 
particulados (http://www.brquimica.com.br/turbi/news_turbi.php?id=1105204758). 
A utilização destas metodologias volta-se mais para a avaliação físico-química da água no 
ambiente doméstico, tanto potável como de esgotos, águas industriais, tanto efluentes como de 
refrigeração e de produção aqüícola, controle de qualidade nos processos de fabricação de bebidas, 
cosméticos, plásticos e outros, estudos de impacto ambiental, análises de derramamentos perigosos, 
águas oriundas de irrigações, qualidade das águas para consumo humano (lagos, rios e riachos), etc. 
Para microrganismos é possível estabelecer uma relação entre turbidez e concentração de 
células, tanto para bactério como para fitoplâncton, tornando-se mais fácil a construção de curvas de 
crescimento (Figura 19). 
Assim, tanto a turbidimetria 
como a nefelometria são métodos 
quantitativos, mas, ressalta-se que eles 
não determinam a concentração no 
sentido químico da palavra, mas 
estabelecem uma relação mensurável 
que pode ser utilizada em avaliações 
comparativas. 
 
 
 
 
 
III.1.d. FOTOMETRIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA 
Esta metodologia explora uma característica dos metais: eles absorvem e emitem o 
mesmo comprimento de onda. Assim, uma solução metálica vaporizada recebe um feixe colimado 
proveniente de uma lâmpada confeccionada com o próprio metal que está sendo avaliado. Em outras 
palavras, uma solução contendo magnésio é avaliada por um feixe de luz colimado proveniente de 
uma lâmpada de magnésio. 
A precisão alcançada é muito expressiva, atingindo a determinação de “partes por trilhão” 
do elemento metálico em solução. É metodologia importante em laboratórios de toxicologia, impacto 
ambiental, fisiologia, bioquímica, etc., enfim, todos aqueles que necessitam determinar metais 
poluentes ou fisiológicos em solução. 
Figura 19 – Curva de crescimento típica de 
bactérias, determinada com a turbidimetria 
(http://pathmicro.med.sc.edu/fox/growth_c.jpg). 
11 
 
As lâmpadas são conhecidas por “catodo oco”, onde, por questões econômicas, esse 
eletrodo é confeccionado nessas condições para reduzir custos (Figura 20). 
Esta metodologia é qualitativa a partir do momento que identifica o metal por ele 
absorver a luz de comprimento de onda esperado, ou seja, se a luz emitida por uma lâmpada de cobre 
incidir sobre a amostra e ocorrer absorbância, podemos concluir que na amostra há esse metal em 
solução. Além disso, é metodologia quantitativa, pois, a partir de uma curva-padrão, pode-se 
determinar a concentração desconhecida de uma solução, como visto na espectrofotometria, por 
interpolação ou pela obtenção do fator de calibração. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Atualmente, são também fabricadas lâmpadas mistas ou multi-elemento, contendo mais 
de uma substância metálica (2-4 metais, formando uma liga). Esses aparelhos podem então realizar 
espectros de absorção e, por isso, passaram a ser denominados espectrofotômetros ou 
espectrômetros de absorção atômica. As leituras obtidas com lâmpadas puras são mais precisas e 
indicadas quando esse requisito é primordial. As lâmpadas mistas são ideais para determinações de 
rotina por facilitarem também as leituras. 
 
Para o uso de lâmpadas 
mistas, o equipamento precisa vir 
montado com um monocromatizador 
que é colocado após a passagem 
pela amostra (Figura 21). 
Além disso, alguns 
elementos metálicos não podem ser 
vaporizados pelo calor por formarem 
amálgama, como é o caso do 
mercúrio. As determinações desse 
metal devem ser realizadas em 
equipamentos que obtêm a 
vaporização ou por redução da 
pressão ou através de uma reação 
química. Nesse caso, o vapor de 
mercúrio é fruto da reação química. 
 
 
III.2. MÉTODOS DE MEDIDA DA EMISSÃO DA LUZ 
Algumas substâncias absorvem radiações eletromagnéticas, raios catódicos ou X, e 
retornam ao estado fundamental emitindo luz de comprimento de onda na faixa do visível. São as 
substâncias fluorescentes, que, por apresentarem de forma característica a radiação de excitação e a 
de emissão, podem ser mensuradas pelos métodos fotométricos de emissão. 
 
 
III.2.a. ESPECTROFLUORIMETRIA 
No espectrofluorímetro, a amostra também é colocada em uma cubeta transparente, de 
trajeto óptico padronizado e a medida é a da emissão de luz da substância excitada. 
Figura 20 – Esquema à esquerda e foto à direita de uma lâmpada de catodo oco 
(http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/1/1e/Hollow_Cathode_Lamp.png e 
http://www.labhut.com/products/lamps/hollow_cathode/index.php?gclid=CO_p4_qnl5UCFQOuFQod3AbJfg). 
Figura 21 – Esquema de um espectrofotômetro de absorção 
atômica com a vaporização por calor 
(http://www.resonancepub.com/atomicspec.htm). 
 
 
12 
O equipamento possui dois canhões: o excitador (anterior à cubeta) e o analisador 
colocado depois da amostra. Ambos possuem espelhos, colimador e monocromatizador, e no 
analisador localiza-se a célula fotoelétrica, fotomultiplicador e galvanômetro. Nesta configuração, o 
registro no galvanômetro é o da luz emitida que será proporcional à concentração da amostra. 
Geralmente, os canhões ficam em ângulo de 90º para não haver interferência da luz de 
excitação (Figuras 22 e 23). A substância poderá ser caracterizada tanto pelo seu espectro de 
absorção como pelo espectro de emissão, sendo ambos gerados pelo mesmo equipamento (Figura 
24). O fluorímetro é um aparelho que não pode realizar espectro de absorção, sendo indicado para 
rotinas laboratoriais da medida de fluorescência. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Através da construção dos espectros de absorção e emissão pode-se assim identificar uma 
substância, caracterizando então essa metodologia, como qualitativa. A construção de uma curva-
padrão permitirá a determinação da concentração desconhecida de soluções amostrais, caracterizando 
a espectrofluorimetria como metodologia quantitativa. 
A espectrofluorimetria é muito utilizada na caracterização de compostos orgânicos 
fluorescentes como neurotransmissores e vitaminas, principalmente. 
 
 
III.2.b. FOTOMETRIA DE CHAMA 
Esta metodologia avalia a radiação emitida por substâncias quando excitadas por umachama, 
sendo metais alcalinos ou alcalinos terrosos. São especialmente usados para a determinação e 
identificação de sódio, potássio, lítio e cálcio. 
A fluorescência de substâncias excitadas pela chama é direcionada por espelhos, colimada e 
selecionada por filtros e fendas, incidindo sobre a célula fotoelétrica e, finalmente, quantificada pelo 
galvanômetro (Figura 25). 
Figura 22 – Princípio geral da medida da fluorescência 
(www.chemicool.com/img1/graphics/fluor-
schematic.gif). 
Figura 23 – Espectrofluorímetro 
(www.jobinyvon.es/Fluorescence). 
Figura 24 – Espectro de excitação (à esquerda) e de emissão (à direita) de várias substâncias indicadas nas 
curvas (http://www.bio.unc.edu/faculty/jones/lab/2010Project/background.htm). 
13 
 
Essa fluorescência é típica da 
substância, identificando-a. 
Fazendo uma curva-padrão do 
elemento de interesse, é possível 
quantificá-lo, tornando essa 
metodologia de grande importância na 
determinação dos metais alcalinos mais 
abundantes nos organismos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS DE BAIXA PRESSÃO 
Os métodos cromatográficos permitem a separação (fracionamento) de componentes de 
amostras biológicas em geral. A identificação ou a quantificação de substâncias não fazem parte dos 
seus objetivos principais. A separação é efetuada em sistemas bifásicos, onde os componentes da 
amostra são colocados para interagir com a fase fixa (onde o processo ocorrerá) e acelerados pela 
fase móvel (Figura 26). 
 
 
 
 
 
 
 
A cromatografia pode ser feita de vários modos. Os mais comuns utilizam as Colunas e as 
Placas. As primeiras são tubos rígidos (geralmente de vidro) de diversas alturas e diâmetros (Figura 
27) que irão conter a fase fixa. As placas são retângulos de papel especial (cromatográfico) ou de 
material sintético polimerizado sobre um suporte de vidro (sílica, poliacrilamida) (Figura 28). O papel 
cromatográfico tem a aparência do papel de filtro, mas, é mais puro que este, para impedir a 
interferência de impurezas na migração dos componentes da amostra. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 25 – Esquema do fotômetro de chama 
(http://www.resonancepub.com/images/section701.gif). 
Fase fixa, 
suporte 
ou matriz 
 
Sólido ou gel Fase móvel, 
solvente ou 
eluente 
 
Líquido Figura 26 – Esquema geral 
da cromatografia de baixa 
pressão. 
Figura 27 – Diversos modelos de 
colunas cromatográficas 
(http://www.buchi.com/typo3t
emp/pics/Glass_column_progra
m_2051a1e6e3.jpg). 
Figura 28 – Placa cromatográfica 
indicando a fase móvel (eluent) 
(http://www.instructables.com/file
s/deriv/FWZ/46WE/F4S6BR39/FW
Z46WEF4S6BR39.MEDIUM.jpg) 
 
 
14 
Nos dois casos, a amostra é arrastada pela fase móvel e os seus componentes são retardados 
seletivamente na fase fixa, podendo ou não haver ligação entre ambos, definindo dois grandes grupos 
de métodos cromatográficos: com e sem aderência. De acordo com as forças atuantes nesse 
retardamento, essa metodologia pode ser agrupados em 5 classes: 
a) Com aderência: obrigatoriamente ocorre uma ligação entre componentes da amostra e da fase 
fixa: adsorção, afinidade e troca-iônica; 
 
b) Sem aderência: não há ligação entre componentes da amostra e da fase fixa: partição e 
filtração 
 
As colunas podem ser adquiridas pré-fabricadas, ou podem ser manufaturadas pelo próprio 
pesquisador. As colunas são fixadas em suportes comuns de laboratório e conectadas ao reservatório 
da fase móvel, com uma torneira para controlar o fluxo. Esse reservatório deve estar em nível 
superior ao da coluna para que se estabeleça o fluxo apenas pela ação da gravidade. Na saída da 
coluna é colocada uma torneira para auxiliar no controle do fluxo da fase móvel. Abaixo da coluna, 
são colocados vários tubos que receberão as frações obtidas. O conteúdo das frações será avaliado 
para completar as informações necessárias através de métodos qualitativos e/ou quantitativos. 
O fluxo que atravessa a coluna obedece à força da gravidade (dada pela diferença de altura 
entre o reservatório e a coluna), e é influenciado pelos diâmetros das tubulações, conexões, coluna, 
torneiras, além da viscosidade das soluções (Figura 29). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
I. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS COM ADERÊNCIA 
 
I.a. ADSORÇÃO 
Na adsorção, ocorrem ligações inespecíficas e superficiais, em diferentes graus, entre os 
componentes da fase fixa e os constituintes da amostra, mantidas por pontes de hidrogênio, forças de 
Van der Waals, dipolo e outras. O número de pontes formado por molécula resulta na força de 
ligação, em diferentes graus: o separando com mais pontos de ligação estará mais fortemente ligado. 
Esta metodologia é muito empregada para fracionar substâncias orgânicas, mas 
principalmente para remover corantes em solução, naquelas determinações em que a cor pode 
interferir nos resultados (urina, meios de cultivo celular, etc.) além de odores desagradáveis em 
coleções de água e ambientes úmidos. 
As matrizes mais usadas são: carvão ativado, sílica, celulose, caolim, hidroxiapatita, etc., 
sendo a primeira, a mais vantajosa quanto ao custo-benefício. Suas qualidades se resumem em alta 
eficiência, não repasse da poluição (odor em águas) e baixo custo operacional. O carvão ativado 
(Figura 30) é obtido através de pirólise (carbonização) controlada de materiais carbonáceos de origem 
vegetal, animal ou mineral com posterior ativação termoquímica. A pirólise controlada propicia a 
cristalização do carbono, formando poros dentro do carvão comum. A porosidade aumenta 
Figura 29 – Esquema geral da cromatografia de baixa pressão 
em coluna; observar que o fluxo pode ser determinado pela 
diferença de altura entre o reservatório e a coluna, pelos 
diâmetros dos tubos, conexões, coluna e torneira, além da 
viscosidade da solução (http://www.chembook.co.uk/fig23-
6.jpg). 
15 
 
significativamente a área de interação entre a fase fixa (carvão ativado) e os componentes da 
amostra. 
A fase móvel é geralmente a solução-tampão onde estão dissolvidas as substâncias a serem 
fracionadas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A forma mais simples de realizar a cromatografia de adsorção no laboratório é a remoção de 
corantes em solução. Nesse caso, não se deseja utilizar o corante e, por isso, não se utiliza a coluna 
(Figura 31). Faz-se da seguinte forma: em um recipiente, coloca-se a solução colorida e o carvão 
ativado; após um tempo variável, a solução estará transparente e poderá ser vertida sobre papel de 
filtro, restando a solução desejada. 
 
A fase fixa pode ser montada em coluna 
para fracionamento mais completo. Sai 
primeiro o menos fortemente ligado, removido 
simplesmente pela força de arrasto da fase 
móvel (fluxo), ou podem ser retirados 
seletivamente por solventes especiais. Na 
Figura 31 encontra-se a seqüência para o 
fracionamento da mistura de 3 sustâncias, 
usando coluna cromatográfica e carvão ativado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 T 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
T: tempo para as ligações ocorrerem 
Figura 30 – Carvão ativado em diferentes ampliações; observar à direita, a grande quantidade de 
poros, que aumentam a superfície de interação (http://aguapurificada.kit.net/info-produtos.htm), 
tempo 
Figura 30 – Remoção de corantes por adsorção. O 
carvão ativado é colocado dentro do recipiente da 
solução; após um tempo variável, a solução estará 
transparente. 
faz 3 pontes 
inespecíficas 
faz 1 ponte 
inespecífica 
não faz ponte inespecífica 
1 
Fase 
Móvel 
2 
Fase 
Móvel 
3 
Fase 
MóvelLENTO MÉDIO RÁPIDO FLUXOS: 
 
 
16 
I.b. AFINIDADE 
 
Princípio: ligação superficial, mas específica, que ocorre entre a fase fixa e os componentes da 
amostra, baseada em forças de atração e repulsão de cargas elétricas fracas, mas numerosas, 
formando complexos estáveis. 
 
Mecanismo: a fase fixa é preparada previamente, recebendo substâncias a ela ligadas 
covalentemente (ligação estável e duradoura) que serão capazes de reconhecer um dos 
componentes da amostra. As ligações que ocorrerem entre a fase fixa e o separando serão do 
mesmo grau. 
Aplicação: quando se quer isolar um dos componentes de reações específicas, como: Enzima - 
Substrato; Anticorpo - Antígeno e Receptor – Mensageiro (complexos mantidos por forças 
fracas como pontes de H, forças de van der Waals, etc.) 
 
Matriz: atualmente, há vários tipos, mas, a técnica foi descrita para a SEPHAROSE (Amersham - 
Pharmacia). Todas fundamentam-se na agarose polimerizada em condições especiais. 
 
 
A matriz é preparada em condições laboratoriais, 
onde se coloca o ligante adequado para o 
experimento. Por ex.: se pretende-se isolar 
anticorpos a partir de soro imune, o antígeno será o 
ligante; se pretende-se isolar uma enzima, o seu 
substrato será o ligante. Essas moléculas 
substituirão o R indicado na figura ao lado, via 
ligação covalente. 
 
 
 
Procedimento: uso obrigatório de coluna antes ou depois da seleção. A matriz contendo o ligante 
pode ser colocada em contato com a amostra dentro ou fora da coluna. O ligante 
selecionará a sua molécula complementar contida na amostra. Após lavar bem para 
remover os não selecionados faz-se a eluição por competição. No final, ligante e 
selecionado estarão unidos e será necessária outra metodologia para separá-los. Veja 
abaixo o esquema da seqüência do procedimento. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 T 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
T: tempo para as reações ocorrerem 
 
 
Fase 
Móvel 
Fase 
Móvel 
 
anticorpo 
antígeno 
outras substâncias 
17 
 
I.c. TROCA-IÔNICA 
 
Princípio: ligação superficial entre as fases fixa e móvel sustentada por cargas elétricas opostas. 
 
Mecanismo: as partículas da fase fixa chamam-se RESINAS e podem ser ANIÔNICAS (retém e 
trocam ânions e são positivas), CATIÔNICAS (retém e trocam cátions e são negativas) e 
MISTAS (retém e trocam ânions e cátions). Poderão coexistir diferentes graus de 
interação, dependentes dos valores da carga elétrica das substâncias em solução. 
 
Aplicação: produção de água deionizada (ou desionizada) e separação de qualquer mistura que 
contenha proteínas e seus constituintes (aminoácidos e polipeptídeos), pois são substâncias 
anfóteras: mudam a carga conforme o pH. 
 
pH < pI: proteína tem carga positiva 
 
pI: pH onde a proteína está neutra 
 
pH > pI: proteína tem carga negativa 
 
 
Para a produção de água deionizada, a água 
destilada passa pela coluna de resina mista e tem seus 
íons removidos: há retirada de todas as substâncias 
carregadas eletricamente (essa resina retém cátions e 
ânions). 
Para separação protéica e seus constituintes, 
escolhe-se resina catiônica ou aniônica. 
 
Procedimento: preenche-se uma coluna com a resina apropriada; coloca-se a solução e deixa-se 
interagir por algum tempo; lava-se com tampão de pH apropriado (fase móvel); elui-se 
com outro tampão de pH apropriado. Veja o esquema abaixo e a descrição a seguir: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 T 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
T: tempo para as reações ocorrerem 
pH 4,0 
ovoalbumina 
hemoglobina 
citocromo c 
 
Fase 
Móvel 
pH 4,6 
 
Fase 
Móvel 
pH 6,8 
 
Fase 
Móvel 
pH 10,7 pH4,0 
 
 
 
18 
Para melhor entender o procedimento, supor a mistura de proteínas contendo: ovoalbumina (pI 4,6), 
hemoglobina (pI 6,8) e citocromo c (pI 10,7) em solução tampão pH 4,0 (inicial ou de trabalho). 
Nesse valor de pH, todas as proteínas da mistura estarão com carga positiva (abaixo do pI), sendo 
que a mais carregada é a citocromo c e a menos carregada é a ovoalbumina. Usando resina catiônica, 
todas as proteínas ficarão aderidas à fase fixa. A primeira eluição é feita com tampão no pH 4,6, 
quando a ovoalbumina estará neutra e se soltará da resina. A segunda eluição é feita com tampão no 
pH 6,8, quando a hemoglobina estará neutra e se soltará na resina. A terceira eluição será realizada 
em pH 10,7 quando a citocromo c se solta por estar neutra. 
 
 
II. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS COM ADERÊNCIA 
II.a. PARTIÇÃO 
Princípio: explora o fato de que as substâncias em solução apresentam diferentes Coeficientes de 
Partilha (Solubilidade) em solventes orgânicos ou não. Na cromatografia de baixa pressão, 
a partição é realizada em placas. É o único método cromatográfico de baixa pressão que é 
qualitativo, quantitativo, além de ser fracionário. 
 
Mecanismo: uma mistura de substâncias com diferentes solubilidades em determinado solvente é 
aplicada em uma placa (papel cromatográfico ou gel, que é a fase fixa) e depois é 
arrastada de forma diferenciada pela fase móvel (o solvente faz parte dessa fase). Os 
componentes irão se distribuir assimetricamente na fase fixa, segundo sua solubilidade. A 
substância mais solúvel migrará mais e o opsto se dá com a menos solúvel. A presença do 
separando é identificada pela revelação que é feita por uma substância que, ao interagir 
com o separando, dá origem a uma nova substância que é colorida e identifica o 
separando, por ser uma reação específica. Além disso, a determinação do Rf (Relação à 
frente) confirma a qualificação da substância, pois é único para cada separando. A Rf é 
calculada pela relação: 
 
Rf = 
 
A quantificação do separando é realizada pela determinação da área da mancha, em um 
analisador de imagens, comparando-se os valores obtidos com uma curva padrão. 
 
Aplicação: identificação e quantificação de pequenos compostos, particularmente carboidratos. 
 
Matrizes mais usadas: papel, sílica e poliacrilamida. 
 
Procedimento: a placa, após a aplicação da amostra, é fixada em um suporte e, sua porção inferior 
é mergulhada na solução eluente/fase móvel (sem cobrir a origem). Na mistura A + B + 
C, A se posiciona mais embaixo que B e este mais abaixo de C, se a solubilidade de C for 
maior que a de B e esta maior que A. A origem (onde se aplica a amostra) e a linha limite 
da migração da fase móvel deverão ser marcadas a lápis. Depois da corrida, a placa deve 
ser secada e revelada. O Rf é calculado a partir das medidas obtidas de migração da fase 
móvel e do separando. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
O Rf da substância B valerá 0,5 pois: 
Rf = 
 
 
O Rf de B valerá sempre 0,5 nas mesmas condições experimentais e o identificará. 
5 
10 
Distância percorrida pela substância 
Distância percorrida pela fase móvel 
 
 5 cm 
10 cm 
Origem 
19 
 
 
 
 
 
A figura ao lado mostra uma situação bastante 
freqüente: se a amostra for muito complexa, contendo 
várias substâncias, pode ser necessário fazer duas corridas 
cromatográficas, uma perpendicular à outra. 
 
Assim aplica-se a amostra no canto inferior direito 
(a), faz-se a corrida (b) e, antes de secar, faz-se outra 
corrida, girando 900 o papel (c). Nesse caso, o Rf é 
calculado ao final da segunda corrida. 
 
Em determinações quantitativas, faz-se uma relação 
entre área da mancha e concentração de um padrão puro da 
substância de interesse (curva-padrão). 
 
A quantificação da área da mancha pode ser obtida 
pelo densitômetro. Nesse aparelho,um feixe de luz 
atravessa a preparação e cria uma curva proporcional à 
intensidade de cor das frações impregnadas de corante (ou 
substância reveladora). 
 
 
 
 
 
 
II. b. FILTRAÇÃO OU FILTRAÇÃO EM GEL 
 
Princípio: a separação se dá por diferenças na massa e volume molecular. 
 
Mecanismo: a fase fixa é formada por partículas que possuem cavidades de tamanho molecular, 
tendo o aspecto de esferas feitas de esponja. As moléculas maiores da amostra, não 
penetram nessas cavidades e saem primeiro da coluna. Dá-se o contrário de uma peneira. 
As partículas esféricas variam no 
diâmetro externo bem como quanto 
ao diâmetro dos poros (Ver quadro 
abaixo). A escolha de uma das 
várias combinações depende da 
amostra: grandes diferenças de PM 
(por ex: desde 5.000 até 100.000) 
ou não (por ex: de 5.000 a 7.000). 
No quadro abaixo, tem-se 
exemplos de géis para Cromatografia 
de Filtração que deverão ser 
escolhidos, conforme a necessidade: 
 
 
Produto Proteínas Globulares (PM) DNA 
Sephadex G-10 Até 7 x 102 --- 
Sephadex G-15 Até 1,5 x 103 --- 
Sephadex LH - 20 < 5 x 103 --- 
Sephacryl S-100HR 1 x 103 – 1 x 105 --- 
Sephacryl S – 400 HR 2 x 104 – 8 x 106 --- 
Sephacryl S – 200 HR --- 118 bp 
Sephacryl S – 1000 SF --- 20.000 bp 
 
 
Aplicações: o procedimento pode ser realizado apenas para a separação dos constituintes da 
amostra ou ainda, para a determinação da Massa Molecular de macromoléculas. 
 
 
 
20 
Procedimento: principalmente realizado em colunas, mas aplica-se também em placas de gel. 
Passos: preenche-se a coluna com o gel (fase denominada empacotamento); coloca-se a 
amostra; abre-se a torneira da coluna e a da fase móvel e, imediatamente começa-se a 
colher amostras de pequeno volume (0,1 - 1 mL, geralmente) em tubos individualizados; 
durante todo o processo o tampão eluente deve ocupar todo o volume da coluna. Caso se 
deseja obter o PM das substâncias, é necessário obter o coeficiente de partição médio (Kav), 
através da determinação do VOLUME MORTO (Vo) - com o auxílio do BLUE DEXTRAN - os 
VOLUMES DE ELUIÇÃO para cada componente de mistura (VE1, VE2, VE3...) e o VOLUME 
TOTAL, que é o volume da coluna de gel (equivale a um cilindro). O PM do Blue Dextran 
vale 2.000.000, a maior molécula conhecida, sendo azul e obtida por polimerização. Em 
todos os procedimentos em que se acrescentar o Blue Dextran, ele será sempre a primeira 
molécula a sair da coluna cromatográfica, justamente por ser maior. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
As frações obtidas e numeradas (no coletor de frações, 
como na foto ao lado) (nos dois casos) são lidas por 
espectrofotometria ou espectrofluorimetria, dependendo do 
caso. Assim, aquelas frações que tiverem valores 
significativos de absorbância ou de emissão, conterão uma 
das substâncias fracionadas. O percurso da substância de 
menor PM, será o maior (ela penetra no maior número de 
poros) e, por isso, ela será a última a sair da coluna. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ao lado, resultado típico dessa 
cromatografia. O primeiro pico (na figura 
ao lado, seria o da esquerda) corresponde 
ao Blue Dextran e o segundo pico (o da 
direita), seria a substância que se quer 
determinar o PM. 
 
 
 
 
 
21 
 
O V0 é calculado pelo número do tubo que saiu o Blue Dextran, vezes o valor de cada fração, em mL. 
 
Os VE serão calculados para cada substância, da mesma forma: o número do tubo vezes o valor de 
cada fração, em mL. 
 
O VT é calculado conforme a se calcula o volume de um cilindro: 
 
VC = VT = Ab x h =  r
2 x h 
Com esses valores, calculam-se os Kav para cada substância: 
 
Kav = 
 
 
A obtenção do PM será realizada ao se jogar o valor do Kav obtido em gráficos semelhantes 
ao abaixo, que utiliza um papel semi-log. Cada reta foi obtida com uma fase fixa diferente (G-25, G-
100, G-200, conforme quadro anterior, variando o diâmetro externo e o diâmetro do poro) e, por isso, 
deve-se utilizar a mesma em que realizamos o processo cromatográfico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
III. COMATOGRAFIA DE ALTA EFICIÊNCIA 
As tentativas para se tornar os procedimentos cromatográficos de baixa pressão mais 
rápidos, resultaram também em maior eficiência, pela introdução de uma bomba peristáltica, que cria 
um fluxo constante e contínuo, sem, no entanto, alterar a pressão. 
A bomba peristáltica possui uma peça triangular giratória que 
empurra quantidades padronizadas de líquido do interior do tubo (Figura 
ao lado http://img.photobucket.com/albums/v702/Pinatubo/ 
peristalticpump.jpg) 
 
 
 
O aparelho de alta eficiência já pode vir montado 
com o suporte, a coluna, a bomba, o coletor de frações, o 
detector, o analisador e o registrador (Foto ao lado); não há 
necessidade de se ter diferença de altura entre a coluna e o 
reservatório de fase móvel. 
(http://www.egr.msu.edu/pel/pictures/AKTAUPC100.jpg) 
VE – V0 
VT – V0 
 
 
 
22 
Abaixo, há um esquema das instalações de um cromatógrafo de alta eficiência 
(http://www.york.ac.uk/depts/biol/tf/images/AKTA_100_Path.jpg). 
 
Os princípios de separação são os mesmos que os anteriores com a exceção da partição, ou 
seja, todos os procedimentos que podem ser efetuados em coluna podem ser melhorados pela adição 
da bomba peristáltica. 
O computador acoplado em todos os sistemas criará um 
perfil para ser avaliado pelo pesquisador. Esse perfil é denominado 
cromatograma e, para se ter uma boa separação, deve-se ter uma 
boa resolução. Isso quer dizer que as substâncias foram bem 
separadas e deram origem a picos distintos. Na cromatografia de 
alta eficiência, há a tendência de se obter melhor resolução na 
separação do que na cromatografia de baixa pressão convencional. 
Ao lado, está um cromatograma de péssima resolução por ter os 
picos sobrepostos. 
Para melhorar a resolução, deve-se alterar de imediato o 
fluxo da fase móvel. Ao lado, há dois cromatogramas da mesma 
amostra, onde se variou o fluxo da fase móvel: à esquerda, fluxo 
mais rápido, e, à direita, fluxo mais lento. 
A situação ideal é quando se obtém um 
cromatograma como o da figura ao lado: os picos estão bem 
separados (há uma boa distância entre eles, permitindo a 
visualização de quando termina e quando começa a outra 
substância), além de todos terem uma base estreita (isso 
significa que a substância saiu em um número mínimo de tubos). 
A resolução é um parâmetro que depende também 
dos componentes da fase móvel e, por último, da composição da 
fase fixa e, nessa ordem, devem ser alterados para se melhorar 
a resolução. 
Se as frações não estiverem bem delimitadas, os 
componentes fracionados não estarão totalmente isolados e 
haverá contaminação de uma substância na fração da outra. 
Na cromatografia de alta eficiência, é possível a identificação da substância pelo período 
que ela demora em atravessar o sistema: é o tempo de retenção, que a caracteriza. Assim, essa 
metodologia se torna qualitativa. Se for construída uma curva com um padrão, será possível obter a 
concentração desconhecida de uma solução amostral, de forma semelhante ao que foi demonstrado 
para os métodos fotométricos (veja a seguir). 
 
23 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
(http://www.scielo.br/img/revistas/cta/v27n1/02f2.gif) 
 
Na figura da direita, tem-se o resultado experimental e, à esquerda, a curva-padrão. O 
próprio aparelho dá a altura dos picos obtidos (1, 2, 3, 4, 5 e 6) e, sendo de interesse o de número 4 
(correspondente ao licopeno), leva-se esse valor à curva-padrão e se obtém o valor em concentração. 
 
 
MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS DE ALTA PRESSÃO 
Nos métodos cromatográficosde alta pressão (CAP) a separação ocorre mais rapidamente 
que nos de baixa pressão, por que o procedimento é acelerado pela passagem da fase móvel com 
maior pressão (acima da atmosférica). Essa elevação da pressão é obtida pela redução da seção de 
corte da coluna que se torna então bem fina associada à movimentação da fase móvel, que se 
estabelece com maior pressão, induzida pela ação de uma bomba compressora. 
Na grande maioria dos CAP, o fracionamento entretanto, não é destinado ao isolamento de 
substâncias e sim, para poder caracterizá-las (teste qualitativo) e quantificá-las (teste quantitativo), 
lacuna deixada pelos métodos cromatográficos de baixa pressão (CBP). A inviabilidade do seu uso 
como método fracionador ocorre por duas razões: 1) a fase móvel geralmente é constituída por 
solventes orgânicos e as substâncias analisadas acabam perdendo a sua atividade biológica e 2) o 
volume aplicado da amostra é pequeno (varia de 20 a 100 µL) gerando frações menores ainda. Por 
outro lado, já existem no mercado, aparelhos CAP que permitem o aproveitamento das frações 
obtidas a partir de amostras de maior volume, associadas a formulações de fases móveis que não 
inativem os constituintes moleculares. 
Dependendo do estado físico da fase móvel, a CAP pode ser cromatografia líquida de alta 
pressão (H.P.L.C. derivado do inglês: High Pressure Liquid Chromatography – esquema abaixo à 
esquerda) ou cromatografia gasosa de alta pressão (H.P.G.C. derivado do inglês: High Pressure Gas 
Chromatography – esquema abaixo à direita). A vazão da fase móvel se mantém constante com 
auxílio de uma bomba na HPLC, e na HPGC, a fase móvel estará pressurizada dentro de cilindros de 
aço. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A amostra hidro ou lipossolúvel deve ser aplicada bem diluída por que o método é muito 
sensível. Assim, não se deve usar essa metodologia para derivados totais, complexos, ainda por 
purificar. 
Concentração do padrão de 
licopeno 
Altura 
ou 
área 
do 
pico 
 
 
24 
FASE FIXA 
As colunas não podem ser produzidas no laboratório e já vêm empacotadas com a fase 
fixa. A coluna tem diâmetro médio máximo de 1cm e comprimento médio máximo de 40cm. A fase 
fixa pode separar a amostra por dois princípios: ADSORÇÃO e PARTIÇÃO. 
 
Mecanismos e separação: 
1) Partição: baseia-se na solubilidade diferente dos elementos da solução, tanto em relação à 
fase fixa, quanto em relação à fase móvel. Sairá primeiro aquele elemento menos solúvel na 
fase fixa e mais solúvel na fase móvel. Exemplos de fases fixas: 
a) Substâncias orgânicas ligadas quimicamente à sílica gel: octadecil sílica (ODS), octil sílica, 
alquilhidroxi sílica; 
b) Líquidos de baixa pressão de vapor e alta estabilidade química: esqualano, Carbowax 
1500, Carbowax 20M, siliconas, metilsiliconas. 
2) Adsorção: baseia-se nas ligações entre os elementos da solução e a fase fixa, que ocorrerão 
de forma inespecífica e em diferentes graus de intensidade. A fase móvel competirá por essas 
ligações, forçando a saída daquele elemento mais fracamente ligado e retardando a saída da 
molécula mais fortemente ligada. Podem ser materiais adsorventes sintéticos, como: carvão 
ativado, sílica gel, alumina ou polímeros porosos insolúveis nos solventes usuais e de alta 
área superficial, como: poli (estireno-codivinilbenzeno-co-cianovinilbenzeno), poli (estireno-
co-divinilbenzeno), poli (estireno-co-divinilbenzeno-co-etilvinilbenzeno). O tipo da ligação, 
sempre superficial, nomeará a cromatografia: 
a) Ligações iônicas: IEX Chromatography. 
b) Dipolo – Dipolo: Normal Phase, onde as porções de cargas opostas se atraem. 
c) Dipolo – Dipolo Induzido: (Normal Phase), quando um dipolo é induzido temporariamente 
em um dos componentes da amostra. 
d) Ligações Hidrofóbicas: Reversed Phase. 
e) Ligações Estereoespecíficas: Chiral. 
 
 
FASE MÓVEL 
Basicamente diferencia HPLC e HPGC. A composição da fase móvel líquida tem enorme 
influência na separação dos compostos, porém, na gasosa, pouco interfere. 
As CAP são complementares e suas ações podem ser vistas no quadro abaixo: 
 
HPLC HPGC Ambas 
Alguns gases Todos os gases Líquidos e sólidos voláteis 
Compostos de MM maior (30 até 2 x 
107) 
Compostos de MM menor (2 a 
8 x 102) 
 
Compostos não voláteis e iônicos 
 
 
 
TEMPO DE RETENÇÃO 
É o período de tempo (s ou min) que a substância gasta para atravessar a coluna. A 
primeira a sair é a mais solúvel na fase móvel e pouco solúvel na fase fixa (partição) ou então, é a 
mais fracamente ligada (adsorção). 
Ao saírem da coluna, as substâncias são analisadas por absorção ou emissão de luz, 
pois há sempre um fotômetro ou um fluorímetro, respectivamente, associados ao cromatógrafo, 
obtendo-se o cromatograma. Nele, cada substância terá um registro de tempo de saída da coluna 
(tempo de retenção) e seu pico associados. A aparência do cromatograma é o resultado, 
basicamente, da eficiência das fases fixa e móvel, e do sistema analisador e registrador, dando origem 
a figuras que podem ter boa ou má resolução. 
25 
 
A boa resolução permite a identificação de substâncias individualmente, ou seja, os picos 
de cada uma estão bem separados. Nos cromatogramas abaixo, observe que a boa resolução não 
depende somente da distância entre picos, mas da concentração da substância: 
Boa resolução para os dois picos. Se 
o objetivo for dosar o ácido acrílico, 
então, a amostra deverá ser mais 
diluída: observe que o pico 2 está 
“achatado” porque ultrapassou a 
escala do aparelho. 
Boa resolução para os picos números 
1, 2, 6 e 7. Má resolução para os 
picos números 3, 4 e 5. 
Em outras palavras, a coluna CGS 
2007.07 (à direita) é excelente para 
dosar noradrenalina, adrenalina, 
metadrenalina e metildopa. Para as 
outras substâncias (dopamina, 
normetadrenalina e L-dopa) deve-se 
tentar melhorar a resolução, para se 
obter uma avaliação quantitativa 
mais precisa. 
 
Para se melhorar a resolução, devemos seguir a seqüência: 
1º.) diminuir o fluxo da fase móvel: é conseguido diminuindo a pressão; 
2º.) alterar a fase móvel: tanto na proporção como nos seus constituintes, 
3º.) trocar a coluna: dentro do mesmo princípio (adsorção ou partição) inicialmente e depois 
princípios diferentes. 
O tempo de retenção é típico de cada substância e serve para identificá-la se as condições 
de corrida forem mantidas (fluxo, temperatura, fases fixa e móvel). Graças a ele que essa 
metodologia é qualitativa. 
O ideal é que se obtenha picos de base estreita e bem separados: compare o pico 1 do 
ácido acético (CGS 2162.07) e o pico 7 do metildopa (CGS 2007.07) nos cromatogramas acima. 
Nesse caso, o pico do ácido acético é melhor que o do metildopa. Isso ocorre porque alguns sistemas 
processadores de dados só informam a altura do pico, e, fica claro que, se o pico for muito alargado, a 
sua altura diminui muito. Entretanto, os sistemas mais modernos podem informar dois parâmetros 
relacionados à concentração da substância: a altura do pico e a área abaixo da curva (integral da 
curva). A medida da altura ou da área do pico permite a determinação da concentração da 
substância, tornando o método quantitativo. Para tanto, devemos ter o padrão da mesma, obtendo 
uma relação entre concentrações diferentes e alturas de picos ou áreas abaixo da curva. Veja a 
seguir (http://www.ijpr-online.com/Docs/20033/Image70.gif e 
http://www.brynmawr.edu/Acads/Chem/gchemlab/103/Expt2week2_files/image006.gif): 
 
Equação da reta obtida 
 
ÁREA ALTURA 
 
 
 
 
 
 
 
 
Com os valores obtidos nas determinações experimentais, é só jogar no gráfico e obter a 
concentração desconhecida (melhor usar papel milimetrado). Se forem muitas determinações, é 
possível obtera equação da reta para sistematizar as medidas. A partir do valor da altura ou área do 
pico (ordenada, Y), obtém-se o valor de X (abscissa). 
 
 
 
 
 
26 
TEMPERATURA 
É imprescindível que haja o controle da temperatura e sua padronização, pois, ela 
interfere na constante de equilíbrio das ligações e, conseqüentemente, nas interações entre fase fixa e 
substâncias da amostra, e entre fase móvel e substâncias da amostra. 
 
K = K0 x e
-∆H/RT K0, R e T são constantes químicas 
 ∆H: calor de dissociação ou adsorção 
 
Os equipamentos mantêm a coluna dentro de um compartimento cuja temperatura pode 
ser controlada. A maioria deles refrigera a coluna (temperaturas abaixo da ambiente), mas, os 
melhores, acertam e mantém a temperatura de trabalho, independente da ambiente. 
PRESSÃO 
Determina a velocidade do fluxo. Em geral, perde-se em eficiência (resolução) quando se 
aumenta demais a velocidade da fase móvel. 
Geralmente os aparelhos fornecem uma variação razoável de pressão: entre 100 a 500 
atm. Convém iniciar qualquer estudo, entretanto, padronizando a pressão para se obter um fluxo de 
1 ml/min. Para tanto, liga-se o equipamento, sem entretanto colocar a amostra. Na saída da fase 
móvel, proveniente da coluna, coloca-se uma proveta de 10 ml e deixa-se por 5 min. O fluxo estará 
ótimo se, ao final desse período, tivermos apenas 5 ml na proveta. 
 
 
SISTEMAS DE DETECÇÃO 
Os mais usados são os fotométricos (U.V., Vis, I.V.) de absorção e emissão, como já 
explicado. Mas, existem também sistemas que avaliam a condutividade elétrica e o índice de 
refração. O importante é que realizem o monitoramento contínuo dos efluentes da coluna. Essas 
medidas serão enviadas ao sistema de aquisição e processamento de dados (gerenciados por um 
computador), que fornecerá a altura e/ou a área do pico. 
A análise final é enviada à impressora que registra o cromatograma. 
 
 
CONSIDERAÇÕES FINAIS 
É imprescindível que a amostra esteja diluída e livre de particulados: a coluna, por suas 
características, fica obstruída com facilidade. Por isso, todo equipamento possui um filtro e, às vezes, 
um pré-filtro, para eliminar os particulados. A diluição deve ser aumentada sempre que o pico ficar 
achatado, por sair fora da área de plotagem. 
Para a HPLC, é importante que a fase móvel seja degaseificada por ultra-som: se uma 
bolha de ar permanecer dentro da coluna, sua eficiência estará comprometida. É claro que esse é um 
procedimento desnecessário para a HPGC. A remoção das bolhas por ultra-som ocorre porque as 
ondas mecânicas geradas pelo aparelho agitam fortemente o líquido promovendo a saída de gases. 
O volume morto é o menor possível, conseguido pela tecnologia de se aumentar ao 
máximo as superfícies de interação: de 3 a 8 µL. Como V0 é sempre constante para a mesma coluna 
de alta pressão, não há necessidade de ser calculado. 
Há autores que preferem o uso da sigla HPLC para High Performance Liquid 
Chromatography. Tome cuidado! 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fotômetro 
Fluorímetro 
Integralizador 
acoplado ao 
computador 
Recipiente que contém a 
coluna e mantém a 
temperatura constante 
Bomba compressora 
Recipiente da fase 
móvel 
27 
 
ELETROFORESE 
 
Introdução 
Essa técnica, amplamente utilizada na atualidade, foi o tema da tese de doutorado de Arne 
Tiselius, defendida em 1.930. Nessa oportunidade, um campo elétrico foi aplicado em uma solução, 
sem pista de separação, e, sete anos após, o autor descreveu a técnica como até hoje utilizamos, com 
pequenas modificações. Devido a grande repercussão conseguida e à aplicabilidade dessa 
metodologia, Tiselius recebeu o Prêmio Nobel de Química em 1.948. 
As diferentes e diversas variações introduzidas aos métodos eletroforéticos possuem o 
mesmo princípio geral descrito por Tiselius e auxiliam o desenvolvimento do conhecimento em várias 
áreas: da zoologia à genética, da bioquímica à imunologia, da embriologia à fisiologia, da taxonomia 
ao diagnóstico laboratorial, seja de material obtido de vegetais, animais ou humanos. 
Nas diversas áreas de aplicação, a eletroforese permite: 
 Determinar a mobilidade, o pI e quantidade de ânfions presentes na amostra; 
 Determinar a massa molecular, isolar e identificar os componentes de uma solução de substâncias 
que possuam carga; 
 Caracterizar quadros patológicos, auxiliando no diagnóstico clínico de patologias vegetais e 
animais, incluindo o ser humano. 
 
Definição 
Os métodos eletroforéticos baseiam-se na separação dos componentes de uma solução, 
através da aplicação de um campo elétrico. O local da aplicação é denominado origem e o 
fracionamento ocorre na pista de separação ou meio suporte. Antes da eletroforese, todas as 
moléculas estarão no ponto de aplicação (ou origem): 
 
 
 
 
 
 
 
Ao final da eletroforese, as substâncias terão migrado conforme a sua carga, atraídas pela 
carga oposta a sua e, aquelas sem carga livre, não migrarão, permanecendo na origem: 
 
 
 
 
 
 
 
 
Inicialmente, a origem era colocada no meio da pista de separação. Atualmente, procura-
se deixar todas as moléculas ou com carga negativa ou positiva, aumentando a extensão da pista de 
separação. 
 
Princípio Geral 
As moléculas a serem separadas devem ter carga elétrica nas condições de trabalho. Por 
isso, basicamente, a eletroforese presta-se para separação de proteínas e ácidos nucléicos, incluindo 
seus componentes menores (aminoácidos e nucleotídeos). 
PÓLO PÓLO 
MEIO SUPORTE 
AMOSTRA 
(CATÓDIO) (ANÓDIO) 
ORIGEM 
(ANÓDIO) (CATÓDIO) 
MEIO SUPORTE 
PÓLO PÓLO 
AMOSTRA 
ORIGEM 
 
 
28 
Segundo a Lei de Coulomb, cargas 
opostas se atraem movidas por forças proporcionais 
aos seus valores. Na eletroforese, as moléculas se 
movem em um meio líquido associado a uma 
substância sólida ou semi-sólida (meio suporte) 
obedecendo à corrente iônica gerada pelo campo 
elétrico externo ao sistema. 
O meio suporte deve ser inerte, não 
interferindo na migração. 
 
É possível até, calcular a velocidade de migração (V), cuja unidade é cms-1 e é constante 
para uma mesma substância, em condições padronizadas. Depende, basicamente, das características 
intrínsecas da molécula e do valor do campo elétrico aplicado. 
V =  E onde: 
 
E = ddp em Volts e  = mobilidade eletroforética 
 
A velocidade de migração (V) então é diretamente proporcional à mobilidade eletroforética 
() e ao campo aplicado (E), que são constantes para a mesma molécula. Na prática, a velocidade de 
migração pode ser obtida pela medição do espaço percorrido dividido pelo tempo decorrido, conforme 
as leis da Cinemática. 
Sabendo-se o valor de V, pode-se obter o valor da mobilidade eletroforética: 
 
Cálculo de    = = = sendo  = cm2 V-1 s-1 
 
As moléculas neutras apresentam  = 0 e V = 0. 
 
Fatores que condicionam a mobilidade eletroforética 
a) carga livre da molécula: nas condições experimentais, a mobilidade é tanto maior quanto maior 
for a carga livre (  Q). Se for proteína ou seus constituintes (aminoácidos e polipeptídios), a 
carga dependente do pH, pela diferença até o valor do pI. Se o pH da solução é menor que o pI, a 
proteína tem carga positiva; se pH da solução é maior que o pI, a proteína tem carga negativa, 
sendo que o pI é o pH onde a proteína está neutra, ou seja, sem carga. Considerar ainda que 
quanto maior for a diferença entre pH e pI, maior será a carga líquida. Se for ácido nucléico 
depende do comprimento da fita, pois os radicais fosfato se ionizam em solução aquosa e conferem 
carga negativa à molécula: 
 
 
 Radicais fosfatoA carga dos ácidos nucléicos depende do seu 
próprio tamanho: os radicais fosfato em solução 
aquosa e pH neutro apresentam-se ionizados 
formando como que um esqueleto negativo que é 
o responsável pela carga da molécula. 
b) a ddp gerada para a corrida ou o campo eletroforético: nas condições experimentais, a 
mobilidade será tanto maior quanto maior for o campo elétrico (  E). O valor da ddp é crítico, 
pois, se pequena, favorece a difusão, e, se alta, induz aquecimento do meio suporte, pois, a força 
elétrica resultante que moverá a molécula no sentido do pólo oposto à sua carga, é também 
proporcional à carga e ao campo elétrico (Q e E). 
V’ V’’ V’’’ 
E’ E’’ E’’’ 
 
29 
 
c) força de atrito viscoso: é exercida pelo meio suporte; depende da viscosidade do meio, do 
tamanho e forma da molécula. Se a força elétrica for igual à força de atrito viscoso, não há 
movimento: 
 
 
 
 
  
 
d) eletromose: é o movimento da fase líquida (água) no sentido oposto ao da migração das 
moléculas em separação. Isso ocorre nos dois sentidos, pois, no meio líquido, há cátions e ânions 
que também migrarão para o pólo oposto e carrearão as moléculas de água (ela é um dipolo!). A 
eletrosmose se torna prejudicial quando se desloca contra a migração da amostra, e intensamente. 
A adição de substâncias não ionizáveis e coloridas permite visualizar esse fenômeno. A 
eletrosmose pode ser diminuída com a participação do meio suporte (ver adiante, em meios semi-
sólidos) e também pode ser favorável à separação das substâncias (ver Imunoeletroforese 
Cruzada, em Métodos Eletroforéticos Especiais). 
 
 
  
 
 
 
Na situação acima, haverá movimento de íons Cl- no mesmo sentido das proteínas e cátions (K+ e 
Na+ principalmente), no sentido inverso. Os dois movimentos carreiam água (eletrosmose) e, 
dependendo de qual seja o mais intenso, poderá prejudicar a migração das proteínas. 
e) efeito Joule: a diferença de potencial gerada cria uma corrente elétrica que, na solução onde 
ocorre a corrida, transforma-se em corrente iônica; uma parte da corrente iônica que passa pelo 
meio suporte é transformada em calor. Esse aquecimento induz a evaporação da água, que altera 
as condições de corrida e pode induzir resultados não confiáveis. A Potência térmica, dissipada, 
em Watts, pode ser calculada (P = Vi; onde V é a ddp aplicada e i representa a intensidade da 
corrente resultante). Quanto mais concentrado for o tampão (fase líquida), maior será a 
intensidade de corrente. Pode-se diminuir o efeito Joule colocando a aparelhagem sob 
refrigeração. 
f) adsorção: dependendo da pureza do material que constitui a matriz 
(meio suporte), resíduos aniônicos e/ou catiônicos podem se ligar às 
moléculas migrantes retardando-as. Ao se fazer a coloração para 
visualização das frações, serão observadas “caudas”. 
 
Separação com adsorção 
 
Separação sem adsorção 
 
 
g) força iônica: será a fonte de íons que constituirão a corrente iônica que auxiliará a movimentação 
dos constituintes da solução e fechará o circuito da ddp gerada pela fonte eletroforética (ver 
adiante); a força iônica pode ser calculada a partir da concentração iônica do tampão e das 
valências dos seus íons, pela fórmula: 
 
J = 
2
1


n
i 1
C1 Z1
2
 onde C é a concentração do íon e Z, a sua valência 
 
FORÇA DE ATRITO 
VISCOSO 
FORÇA ELÉTRICA 
(+QE) 
FORÇA DE ATRITO 
VISCOSO 
FORÇA ELÉTRICA 
(-QE) 
Q- 
 
 
 
Q+ 
ANÓDIO CATÓDIO 
 Na+ K+ 
 H2O K
+ Na+ 
Na+ H2O K
+ 
 Na+ K+ 
Cl- Cl- Cl- 
H2O H2O Cl
- 
Cl- Cl- Cl- 
Cl- H2O 
Prot
-
 
Prot
- Prot
-
 
Prot
-
 Prot
-
 
 
 
30 
Instrumental da Eletroforese 
a) Fonte de Voltagem e/ou Corrente Contínua: é necessário criar um campo contínuo para que 
as moléculas possam migrar em apenas um sentido. A fonte transforma a corrente alternada da 
rede, em corrente contínua. Há modelos de alta e baixa voltagem e/ou amperagem. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
b) Cuba Eletroforética: é onde se coloca o meio suporte e se cria 
condições de ocorrer a corrida eletroforética. Dependendo da 
posição do meio suporte, pode ser horizontal e vertical. Apresenta 
dois reservatórios que conterão a solução-tampão e os eletrodos 
de platina. A tampa deve ser feita de tal forma que impeça a 
evaporação e não permita que a água caia sobre a matriz, sendo 
geralmente, inclinada. Para cuba horizontal, muitas vezes é 
necessária a colocação de uma ponte (papel, tecido ou Perflex) 
que fecha o circuito de corrente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
c) Meios suporte: é onde a separação em frações ocorre, onde as moléculas podem se deslocar. 
Subdividem-se em sólidos (papel e acetato de celulose) e semi-sólidos ou géis (ágar, agarose, 
amido e poliacrilamida). O mesmo material, em matrizes diferentes, poderá apresentar número 
diferente de frações. 
 
SÓLIDOS 
Papel: foi introduzido na década de 50, proveniente da Cromatografia de partição, substituindo o 
papel de filtro comum. É barato, mas oferece pouca resolução e não impede a eletrosmose. 
Pode ser utilizado em cubas vertical ou horizontal. 
 
Acetato de Celulose: foi introduzida por Khohn em 1957. Ele 
esterificou os grupos hidroxila da celulose, por acetilação e, 
com isso, reduziu a adsorção e a eletrosmose. Permite 
análise densitométrica, porque é passível de sofrer 
diafanização. Esse procedimento permite que o 
eletroferograma (resultado da eletroforese) possa ser 
quantificado pela análise das frações. A diafanização ocorre 
quando o eletroferograma está sendo processado (coloração e 
descoloração – ver adiante). É muito usada no Laboratório 
Clínico permitindo a análise comparativa de amostras de 
pacientes 
http://www.hemoglobinopatias.com.br/d-falciforme/img03.jpg 
Cuba horizontal 
Fonte Cuba vertical 
Meio Suporte ou matriz 
Eletrodo 
Reservatório da 
solução-tampão 
31 
 
GÉIS 
Foram desenvolvidos para aplicação na cromatrografia de partição, mas o auge foi 
alcançado na eletroforese. Os géis são uma rede polimérica tridimensional, inerte, que pode ter sua 
malha mais larga, ou mais fina, dependendo da concentração do gel (quanto mais concentrado, menor 
o poro). A molécula migra por dentro do gel, e, por isso, há um novo fator para a separação: o 
tamanho molecular. Ex: 2 proteínas A e B, com o mesmo equilíbrio entre carga efetiva e massa 
molecular, sendo que a massa molecular de A é maior que B. Se a separação ocorresse em meio 
sólido: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Se a corrida ocorresse em gel de poliacrilamida: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Mesmo assim, amostras complexas separadas na poliacrilamida não terão sempre a 
correspondência 1 fração = 1 proteína. Nesse caso, podem ser realizadas várias corridas em 
diferentes pH e o poro do gel ou então, utilizar o Sódio Duodecil Sulfato, que será visto no próximo 
capítulo. 
Amido: foi desenvolvido por 
POULIK e SMITHIES em 
1958, sendo obtido da 
batata e do milho. É 
próprio para cuba 
horizontal e a amostra é 
aplicada em papel de 
filtro. O gel é espesso e, 
ao final da corrida, são 
tiradas fatias que se 
coram de forma 
diferenciada para revelar 
isoenzimas. É 
metodologia barata, de 
fácil manuseio, apresenta 
pouca eletrosmose, mas, 
baixa resolução para 
amostras complexas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Antes da eletroforese Depois da eletroforese 
 
 
32 
Agarose: foi introduzida nos anos 70, sendo um polímero linear