BIOLOGIA MOLECULAR - PCR, ENZIMAS DE RESTRIÇÃO E SATÉLITES

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REAÇÃO DA POLIMERASE EM CADEIA- PCR
ROGERIA GREGIO
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HISTÓRICO
PCR descrito por Kary Mullis no final da década de 1980 e em 1993, recebeu o Prémio Nobel da Química pelo seu trabalho. 
Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou este processo. 
1976: Thomas D. Brock descobriu a DNA polimerase termoestável de Thermus aquaticus
1984 - PCR foi apresentada pela primeira em um encontro científico
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THOMAS D. BROCK NO LAGO DO “YELLOWSTONE NATIONALPARK” DE ONDE FOI ISOLADO O THERMUS AQUATICUS - 1976
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Reação em cadeia da polimerase (em inglês Polymerase Chain Reaction - PCR) é um método de amplificação (de criação de múltiplas cópias) de DNA (ácido desoxirribonucleico) sem o uso de um organismo vivo, por exemplo, Escherichia coli (bactéria) ou leveduras.
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 No diagnóstico de doenças hereditárias e infecciosas; 
 Na identificação de "impressões digitais" genéticas;
 Na construção de árvores filogenéticas; 
 No seqüênciamento de genomas; 
 Na expressão de genes em sistemas recombinantes; 
 No estudo de genética molecular; 
 Em testes de paternidade; 
 Na medicina forense.
O MÉTODO DE PCR É USADO HABITUALMENTE: 
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O PROCESSO DE PCR OCORRE EM TRÊS ETAPAS:
1 – Desnaturação: o DNA que se quer amplificar é aquecido a 94-96°C a fim separar as dupla-fitas. 
2 – Anelamento: a temperatura é diminuída, a 60ºC, assim, os primers podem unir-se às fitas-simples do DNA.
3 – Extensão: a DNA-Polimerase produz a fita complementar do DNA molde, a uma temperatura de aproximadamente 72ºC.
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COMPONENTES
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Toda PCR requer:
■ Um par de oligonucleotídeos para iniciar a síntese de DNA
■ Desoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs)
■ DNA polimerase termoestável
■ Tampão para manter o pH (TBE)
■ Amostra de DNA
Tampão da Taq:
■ toda DNA pol. requer cátion divalente, usualmente MgCl - cofator
 ■ (KCl) como tampão.
	
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Resultado:
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POSIÇÃO DA AMPLIFICAÇÃO
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CINÉTICA DO PCR
As causas do platô são várias:
Perda da atividade da enzima;
Todas as enzimas disponíveis estão ocupadas com a síntese de DNA;
Acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si, em detrimento do pareamento com os “primers”. Aumenta possibilidade de amplificação de produtos inespecíficos;
Gasto dos reagentes, especialmente inativação da DNA polimerase;
Competição com outros produtos que vinham sendo amplificados com eficiência menor mas também foram se acumulando
Etc…
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TIPOS DE PCRS:
■ RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction)
■ RAPD (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA)
■ Real time PCR
Multiplex PCR
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PCR EM TEMPO REAL
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SISTEMAS DE DETECÇÃO - PCR EM TEMPO REAL
Principais métodos para detecção da fluorescência:
 Agentes ligantes de DNA (SYBR Green*)
 Sondas de hidrólise (Taqman*, Lux*, Beacons*, Scorpions)
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Multiplex PCR 
PCR com dois ou mais conjuntos de primers, para amplificação de diferentes fragmentos de uma mesma amostra
Objetivos: 
 - identificação de vários vírus
 - identificação de deleções em genes em doenças degenerativas (Distrofia muscular de Duchenne)
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Nested PCR 
É uma variação da PCR convencional, na qual são utilizados dois pares de primers (ao invés de um) para amplificar um mesmo fragmento
Duas PCR: primeira com a fita parental, em seguida em uma segunda PCR com a fita menor
Aumenta a especificidade!
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ENZIMAS DE RESTRIÇÃO E SATÉLITES
ROGERIA GREGIO
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Nota Histórica
1940
1950
~1940 – Experiências com bacteriófagos
~1950 – Diferentes eficácias de infecções por parte dos bacteriófagos. Variações entre estirpes bacterianas. 
1953
1953 – Estrutura do DNA (Watson Crick)
1956
1956 – Isolamento da DNA polimerase (Kornberg)
1966
1966 – Isolamento da DNA ligase (Weiss & Richardson)
1970
1970 – Purifica-se a primeira enzima de restrição tipo II: o Hind II (Smith & Wilcox)
1972
2006
1972 – Primeiras experiências com DNA recombinante (Berg & Boyer) 
1978
1978 – Isolamento e caracterização de mais de 200 enzimas de restrição
 Prémio Nobel – W. Arber, H. Smith e D. Nathans
in educar.sc.usp.br
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Enzima de restrição
Enzimas produzidas por bactérias para restringir a proliferação de vírus invasores
Diferentes tipos de enzimas clivam diferentes sequências de bases de DNA
Ajuda a detectar a presença de diferentes formas de determinados genes
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Proteínas que reconhecem e clivam o DNA em pontos específicos, geralmente em sequências de 4, 6 e 8 bases - palíndromas
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Nomenclatura
As enzimas de restrição são chamadas de acordo com a bactéria que a produziu
RY 13
Exemplo: EcoR I
Escherichia
coli
1º enzima a ser descoberta nesta bactéria
Género
Estirpe
Espécie
Ordem de descoberta 
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EcoRI 	Escherichia coli
BamHI	Bacillus amyloliquefaciens RH
BglII		Bacillus globigii
PvuII		Proteus vulgaris
HindIII	Haemophilus influenzae Rd
HinfI		Haemophilus influenzae Rf
Sau3A	Staphylococcus aureus
AluI		Arthrobacter luteus
TaqI		Thermus aquaticus
HaeIII		Haemophilus aegyptius
NotI		Nocardia otitidis-caviarum
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UTILIDADE
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Sequências de reconhecimento
 Não ambíguas 
 Exemplo:
	BamHI - só reconhece a sequência GGATCC
					 CCTAGG
 Ambíguas
 Exemplo:
 HInf I - reconhece sequências de 5bp começadas por GA e que terminem em TC
					
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Tipos de enzimas de restrição
Tipo I
 3 subunidades:
 1 subunidade de restrição (“R”)
 1 subunidade de metilação (“M”)
 1 subunidade de reconhecimento (“S”)
 Sequência de reconhecimento é assimétrica
 Local de hidrólise não é específico e ocorre a mais de 1000 bp de distância
 Hidrólise é sempre num local diferente e necessita de ATP 
Impede o seu uso em engenheira genética
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Tipo III
 2 subunidades:
 1 subunidade de restrição (“R”)
 1 subunidade de metilação e reconhecimento (“MS”)
 Sequência de reconhecimento é assimétrica (5-7 bp)
 Dupla cadeia de DNA hemimetilada
 Local de hidrólise a mais de 24-26 bp de distância
 Hidrólise é sempre num local diferente e necessita de ATP
Impede o seu uso em engenheira genética
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Tipo II
 Duas enzimas:
 1 enzima de restrição (Endonuclease)
 1 enzima de metilação (Metilase)
 Estrutura com 4 folhas β e 1 hélice α
 Sequência de reconhecimento é palindrómica 4-8nts
 Hidrólise ocorre dentro ou nas extremidades da sequência reconhecida
 Não necessita de ATP, apenas Mg2+
Importantes na recombinação genética e na elaboração de mapas de restrição (especificidade de corte)
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Izosquizômeros
 Diferentes enzimas de restrição que possuem a mesma sequência de reconhecimento
 Diferem nas condições ótimas de reação, na estabilidade
Exemplo:
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Enzimas compatíveis
 Produzem extremidades protuberantes compatíveis
 Sobreposição parcial de sequências de reconhecimento
 DNA recombinado com sequência híbrida
Exemplo:
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Factores que influenciam a atividade das enzimas de restrição:
Composição do tampão
Diferem na força iónica (concentração de sal)
Diferem no catião principal (Na+ ou K+)
Solução: Manter o pH da reacção (geralmente em 8.0)
 Digestão com múltiplas enzimas
 Influência da metilação no DNA
 Existe algumas endonucleases de restrição que não clivam DNA metilado
 Temperatura de incubação
 A maioria das enzimas cliva melhor a 37ºC
 Excepções: Bactérias termofílicas – clivam melhor entre 50 a 60ºC
	 Enzimas com tempo de meia vida pequeno a 37ºC, recomenda-se a 			incubação a 20ºC
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DNA recombinante TRANSGÊNITOS
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Microssatélites ou Sequencias Simples Repetitivas (SSR)
Sequence Tagged Microssatellites (STMS)
Single Sequence Length Polymorphisms (SSLP)
VNTRs mais utilizados
Repetições de 2, 3, ou 4 pares de bases
Próximo de 100 cópias aleatórias de cada
Altamente variável
Muitos loci diferentes de microssatélites em diferentes espécies
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VNTR: variable number tandem repeats
- SATÉLITES
Regiões não codificadoras
Podem ser constituídos de repetições de 2 a milhares de pb
Muitas cópias de uma mesma sequência no genoma
Alta taxa de variação entre indivíduos no número de cópias
2 a 6 micro, 7 a 100 mini, + q 100 satélites
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MICROSSATÉLITES, MINISSATÉLITES E SATÉLITES
São regiões onde ocorrem repetições em TANDEM. A classificação varia quanto ao número de bases nitrogenadas repetidas. 
Altamente polimorficas
Microssatélites : 2 a 6
Minissatélites: 7 a 100
Satélites: acima de 100
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Microssatélites
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CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM AS REPETIÇÕES
PERFEITAS – Sem Interrupções
IMPERFEITAS – Com uma ou mais Interrupções
COMPOSTOS – Repetiçõs adjacentes de uma sequência diferentes
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Polimorfismo devido a diferenças no número de repetições
Escorregamento da DNA polimerase durante a replicação
Crossing-over desigual entre cromátides irmãs
Codominantes
Normalmente locos simples e multi-alélico
Microssatélites (STR - Short Tandem Repeats) 
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Microssatélites (SSR)
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACACACACACACACACAC NNNNNNNNN NNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNNNN
Primer REV
Primer FOR
Repetição CA
acttcattaa tgtcttaggt ggcagaatac tttgatgcaa caatttcaag gggtgctgac attaagttgg ctgccaattg
gataatgggt gatattgctg cctatatgaa aaatgaaaag ctttctatta atgagatcaa acttatgcca gaagagctag
tagagctgat agcttccatt aaaggtggga ctatcagtgg aaagattgga aaggaggtaa gcatttgctt ctttnactga
tgccactttc atgttcaaac atttgttagt aatcctgtct atttattttc atggaagaat tttactagct attattctcc
actgtgtaga tgtgatttta tagtttgttt ggatatataa ttattgttcg tgtttttttt tttaatccaa actttataat
ctttccaagt gcttttctcc tccctgtctt tttcctctac cacacacaca cacacacaca cacactcata cagaaaaagg
aaaaaggaaa gaaagagaac aggagatata aaaacctttt ttctttatca attagataat tagttataaa agtttttctc
ctgcttctta tccctccgct aaatgcctga ttaactttct gctggtaaag atttaaaata acttgttaat tttggacatg
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Microssatélites Ancorados ISSR 
NNNNNNNNN CACACACACACACAC NNNNNNNNNNNN CACACACACACACAC NNNNN
NNNNNNNNNGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTG NNNNN
(CA) n NN
(CA) n NN
NNNNN (CA) n 
NNNNN (CA) n 
Repetição CA
ISSR
5’ ou 3’ancorado
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DNA fingerprint ou impressões digitais genéticas
No genoma humano existem sequências de DNA repetitivas que são reconhecidas e cortadas por determinadas enzimas de restrição. Estas enzimas dividem o DNA em fragmentos cujas dimensões e composição em nucleótidos variam de pessoa para pessoa e refletem as diferenças entre os alelos dos vários locus.
Diferentes fragmentos de DNA movimentam-se de modo diferente quando submetidos a eletroforese (determinadas moléculas são sujeitas a um campo elétrico num meio poroso) e o resultado é um padrão de bandas que difere de individuo para individuo.
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MINISSATÉLITES
(VNTR - Variable Numbers of Tandem Repeats) 
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