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13/04/2011 1 Aula Prática Técnicas de preparação de lâminas a fresco e semi-permanentes MICROSCOPIA: Inicialmente, examine o microscópio que lhe corresponde. Verifique as instruções do funcionamento e manuseio correto. Cuidados no uso do microscópio a) Nunca forçá-lo. Todas as conecções devem funcionar suavemente. b) As lentes da objetiva nunca devem tocar a lâmina. Portanto, nunca focalizar abaixando o canhão com o parafuso macrométrico olhando para a ocular. c) Não tocar as lentes. Se estiverem sujas, limpe-as com algodão ou com pano que serão fornecidos. e) Não esquecer a lâmina no microscópio após o uso; f) Manter a platina sempre limpa e seca. g) Não inclinar o microscópio. h) Quando o microscópio não estiver em uso, deverá ser guardado coberto . i) Habitue-se não deixar a fonte de luz acesa quando não estiver utilizando o microscópio. Uso do microscópio a) Com a amostra a ser examinada sempre na parte superior, colocar a lâmina sobre a platina, tomando o cuidado de que a parte a ser examinada esteja bem no centro; b) Ajustar a iluminação de forma a que passe maior quantidade possível de luz através da amostra; c) Colocar a objetiva de menor aumento e abaixar o canhão utilizando o parafuso micrométrico até que a lente esteja cerca de 0,5 cm da lâmina. Nunca efetuar esta operação olhando pela ocular; d) Olhar pela ocular e levantar levemente o canhão até obter uma focalização grosseira. e) Após focalizar grosseiramente, utilizar o parafuso micrométrico para uma focalização fina; f) Acertar a quantidade de luz, movimentando o diafragma. A iluminação deve ser adequada, nem fraca nem excessiva. h) Para utilizar a objetiva 100X, é necessária a colocação de uma gota de óleo sobre a lâmina. NÃO VISUALIZAR NESSA OBJETIVA!!!! i) Nunca tentar focalizar diretamente com as objetivas de maior aumento. INTRODUÇÃO AO ESTUDO PRÁTICO DE ANATOMIA VEGETAL MATERIAL VEGETAL • Coletado fresco, com a possibilidade de utilização de material herborizado após sua hidratação. • Conservação do material vegetal: soluções fixadoras → promovem a morte das células e sua preservação estrutural em estado próximo do material fresco. • As principais substâncias fixadoras são formol, o álcool, iodo, bicromato de potássio e os ácidos: acético, pícrico crômico e ósmico. • A escolha do uso de soluções depende dos objetivos do trabalho a ser realizado. • Para que a luz possa atravessar o tecido a ser estudado, os cortes feitos devem ser suficientemente finos e transparentes. •Micrótomo - obtenção de cortes finos, mas para realização dos cortes neste equipamento, o material vegetal deve estar devidamente desidratado e incluído em um suporte (mais comum: parafina). INTRODUÇÃO AO ESTUDO PRÁTICO DE ANATOMIA VEGETAL INTRODUÇÃO AO ESTUDO PRÁTICO DE ANATOMIA VEGETAL • Cortes à mão livre - auxílio de uma lâmina de barbear e um suporte (isopor, pecíolo de embaúba, medula do caule de sabugueiro). • O corte deve ser imediatamente transferido para um recipiente contendo água destilada. • Os cortes realizados devem ser mais finos o possível, possibilitando a observação das estruturas vegetais 13/04/2011 2 INTRODUÇÃO AO ESTUDO PRÁTICO DE ANATOMIA VEGETAL Tipos de cortes a. Transversal: Perpendicular ao maior eixo do órgão. b. Longitudinal: Paralelo ao maior eixo do órgão. Tangencial - tangente ao raio cilindro Radial - passando pelo diâmetro ou raio. c. Paradérmico: Paralelo à superfície do órgão. Tecidos de revestimento. • Provisórios, semipermanente ou permanentes. • Provisórios - líquido de inclusão utilizado é a água destilada • Semipermanentes - glicerina • Permanentes - Bálsamo do Canadá ou resinas sintéticas. INTRODUÇÃO AO ESTUDO PRÁTICO DE ANATOMIA VEGETAL Durabilidade dos cortes INTRODUÇÃO AO ESTUDO PRÁTICO DE ANATOMIA VEGETAL Clareamento dos cortes • A célula vegetal contém inúmeras substâncias que possuem cor, dentre elas os pigmentos. • O clareamento dos cortes é feito utilizando solução de hipoclorito de sódio comercial ou cloral hidratado. • O transporte dos cortes para a solução de hipoclorito deve ser feito com o auxílio de estilete e não com pincel, para não danificar suas cerdas. • Transferir os cortes em seguida para outro recipiente com água destilada e enxaguar abundantemente. • Com o objetivo de corrigir o pH para que não haja interferência na eficácia do corante, passar os cortes em solução de ácido acético diluído, enxaguando em água em seguida. INTRODUÇÃO AO ESTUDO PRÁTICO DE ANATOMIA VEGETAL Coloração dos cortes • O uso de corantes é necessário para evidenciar as estruturas celulares, resultando em maior facilidade para observação. • O corante que será mais utilizado é o safrablau ou safrablue = AZUL DE ASTRA + SAFRANINA • Azul de astra - cora paredes celulósicas em azul • Safranina - cora paredes lignificadas, suberificadas e cutinizadas em vermelho. • Substituto do azul de astra = o azul de alcião. Desenhos •Os desenhos devem ser simples e levar em consideração a forma do objeto e as proporções dos componentes dos cortes. •Reconhecer as estruturas desenhadas. a. Desenho detalhado: Tem o objetivo de representar a estrutura da maneira mais próxima ao material observado. Deve ser incluído o maior número possível de detalhes. b. Desenho esquemático: Fornece uma idéia global de forma simplificada do material em estudo. Leva em consideração a forma e a proporção dos diferentes componentes. Para este tipo de desenho, emprega-se usualmente a convenção de Metcalfe & Chalk para a representação de tecidos da seguinte maneira: c. Fotomicrografias 13/04/2011 3 Paredes celulares com lignina no esclerênquima e no xilema de folha da gramínea forrageira Brachiaria brizantha. Dicotiledôneas Monocotiledôneas Lugol Sudam IV Amido Lipídeos Roteiro para preparo das lâminas 1. Coloque os cortes em placa de Petri contendo a solução de hipoclorito de sódio até perderem completamente sua coloração; 2. Enxágüe os cortes em água durante 1 minuto e repita este procedimento 2 vezes, trocando a água de enxágüe; 3. Transfira os cortes para um vidro de relógio contendo ácido acético diluído 4. Enxágüe novamente durante 1 minuto; 5. Transfira os corte para um vidro de relógio contendo algumas gotas de safrablau durante 20-30 segundos; 6. Enxágüe abundantemente em água; 7. Transfira os cortes com o pincel para uma lâmina contendo uma gota de glicerina ou água; 8. Cubra com lamínula, evitando a formação de bolhas. Características de uma BOA lâmina 1. Não ter bolhas de ar, pois se apresentam escuras ao microscópio. 2. Não conter excesso de material, o que dificulta a focalização. 3. A lamínula não deve estar flutuando e o excesso de líquido retira-se com papel absorvente. 4. Nunca deve haver líquido sob a lâmina, para evitar que a platina fique molhada, dificultanto os movimentos de avanço do charriot, danificando o microscópio.
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