Diagnóstico sorológico hiv - teste confirmatório

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Ministério da Saúde 
Carlos César Silva Albuquerque 
Ministro de Estado da Saúde 
Antonio Joaquim Werneck 
Secretário de Assistência à Saúde 
Pedro José Novais Chequer 
Coordenador Geral do Programa Nacional de DST/AIDS-MS 
Miriam Franchini 
Coordenadora Geral do projeto TELELAB 
Autores: 
Antônio Gomes Pinto Ferreira 
Cláudia Renata Fernandes Martins 
José Antônio Pinto de Sá Ferreira 
Luiz Alberto Peregrino Ferreira 
Luiz Fernando de Goes Siqueira 
Maria Luíza Bazzo 
Miriam Franchini 
Oscar Jorge Berro 
Silvio Valle 
Assessoria Pedagógica: 
Maria Lúcia Ricciotti Ribinik 
Maristela Arantes Marteleto
Diagnóstico sorológico do HIV - Testes confirmatórios. – 
Brasília: Ministério da Saúde, Programa Nacional de
Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS. 1997. 
67p, il. (Série TELELAB) 
1. HIV I. Programa Nacional de Doenças Sexualmente
Transmissíveis e AIDS (Brasil). 
II. Serie TELELAB. 
Os responsáveis pela implantação do 
TELELAB empenharam toda sua capacidade 
profissional para tornar este projeto digno da 
qualidade técnica e científica e da eficiência 
que nossa coordenadora geral sempre imprimiu 
às realizações do Programa Nacional de DST/AIDS 
do Ministério da Saúde. 
À Drª. Lair Guerra de Macedo Rodrigues,
exemplo de coragem e liderança, dedicamos 
este trabalho. 
APRESENTAÇÃO____________________________________________04
INTRODUÇÃO ______________________________________________09
fluxograma ________________________________________________ 10
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA PARA HIV-1 ________________13
material necessário para a reação de IFI ____________________ 14
estoque e conservação dos materiais _______________________ 16
titulação do conjugado ____________________________________ 17
realização da reação de IFI para para HIV-1_________________ 23
leitura e interpretação de IFI para HIV-1 _____________________ 26
WESTERN BLOT PARA HIV-1 __________________________________29
seqüência da reação de WB para HIV-1_____________________ 29
material necessário para a reação de WB ___________________ 31
realização da reação de WB para HIV-1_____________________ 32
leitura e interpretação da reação de WB para HIV-1 _________ 34
amostras para investigação de HIV-2________________________ 36
CONTROLE DE QUALIDADE__________________________________39
importância do protocolo e controle de qualidade internos __ 39
obtenção dos soros-controle e programa de avaliação 
externa da qualidade ______________________________________ 40
FÓRMULAS _________________________________________________43
ANEXOS ___________________________________________________47
BIOSSEGURANÇA____________________________________ I - XIV 
CONSIDERAÇÕES FINAIS _____________________________ a – g 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios
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Sexualmente Transmissíveis/AIDS do Ministério da Saúde PN-DST/AIDS - 
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Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
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deverá acertar no mínimo 80% do 
teste. Depois da correção do seu 
teste pelo PN-DST/AIDS, você 
receberá o certificado 
Ao final deste curso você será capaz 
de: 
x� identificar os fundamentos dos 
testes e os procedimentos para 
execução recomendados pelo 
PN-DST/AIDS-MS para o 
diagnóstico sorológico do HIV-1 
na fase confirmatória; e 
x� executar o diagnóstico 
sorológico do HIV-1, obedecendo 
aos critérios técnicos, critérios de 
controle de qualidade e cuidados 
de biossegurança recomendados. 
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios
Introdução
Você já viu, no curso TELELAB, diagnóstico sorológico do HIV - 
Testes de Triagem, que, em algumas situações, é necessário realizar 
testes confirmatórios. 
O uso de testes confirmatórios tem como principal objetivo 
assegurar que uma amostra reagente na triagem seja verdadeiramente 
positiva. 
O Ministério da Saúde, por meio do PN-DST/AIDS, recomenda, 
como testes confirmatórios, a imunofluorescência indireta - IFI e o 
Western Blot – WB. Esses testes possuem sensibilidade e especificidade 
adequadas para caracterizar as amostras inicialmente reagentes. 
Para a definição dos resultados, as amostras com resultados 
reagentes nos dois testes de triagem, ou com resultados contraditórios, 
ou indeterminados, devem ser submetidas a IFI. Nos casos em que a IFI 
não caracterizar a amostra, você deverá utilizar o WB. 
Confira no fluxograma os procedimentos para caracterizar as 
amostras através dos testes confirmatórios. 
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PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios 
FLUXOGRAMA PARA O DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DO HIV 
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Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
O que é uma reação de IFI para HIV-1? 
A IFI é uma reação que utiliza, como fase sólida, lâminas de vidro com 
12 demarcações. Cada demarcação contém, como antígeno, células 
da linhagem K37-3, de origem linfocitária, infectadas pelo HIV-1 (Etapa 1). 
Todas as células estão infectadas, mas aproximadamente 25 a 35% das 
células possuem antígenos virais capazes de serem detectados em sua 
superfície. 
A reação entre o antígeno fixado e o anticorpo presente nas amostras
(Etapa 2) é evidenciada após a adição de anti-imunoglobulina humana 
(IgG) conjugada ao isotiocianato de fluoresceína (Etapa 3). Para a leitura 
da reação, é necessário utilizar microscópio de fluorescência.
Figura 1: seqüência de uma reação de imunofluorescência indireta para 
HIV-1
13
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios 
Qual o material necessário para executar uma reação de IFI para HIV-1? 
O Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos Bio-Manguinhos/FIOCRUZ/ 
MS fornece os seguintes materiais: 
 lâminas de imunofluorescência, contendo células da linhagem K37-3 
infectadas experimentalmente pelo HIV-1; 
anti-imunoglobulina humana (IgG) conjugada ao isotiocianato de 
fluoresceina; 
 glicerina tamponada pH 9,0 ± 0,5; 
 azul de Evans a 0,1%; 
 soro-controle positivo com titulo conhecido; e 
 soro-controle negativo. 
 Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos 
 Bio-Manguinhos/FIOCRUZ/MS 
 Endereço: Av. Brasil, 4365 - Rio de Janeiro/RJ 
 CEP: 21.045-900 
 Telefones: (021) 598.4284/ (021) 260.2344 
 Fax: (021) 260.4727 
14
Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
Outros materiais necessários não fornecidos: 
pipetas automáticas com volumes variáveis de 5 a 50Pl, 50 a 200PI e 
de 200 a 1.000PI;
ponteiras para pipetas automáticas; 
tubos de ensaio para diluição de amostras e controles; 
estante para tubos de ensaio; 
câmara úmida; 
 cubas para lavagem de lâminas (tipo Koplin); 
 lamínulas 24 x 50 mm; 
 microscópio para fluorescência; 
 provetas de 1.000 ml; 
 béquer de 2.000 ml; 
 balança semi-analítica e acessórios para pesagem; 
 agitador magnético; 
 agitador rotatório tipo Kline; 
 barra magnética; 
 luvas de látex descartáveis; 
 água destilada; 
 tampão fosfato PBS pH 7,2 (vide Fórmulas); 
 recipiente de paredes rígidas, boca larga e tampa, contendo 
hipoclorito de sódio a 2%; 
 estufa a 37°C; e 
 protocolo (vide Anexos). 
15
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios 
Como estocar e conservar os materiais fornecidos por Bio-Manguinhos? 
Manter a -20°C: 
Os controles positivo e negativo e as lâminas devem ser retirados 
da caixa térmica de transporte e colocados em saco plástico ou em 
caixa plástica com tampa. Estes materiais devem ser conservados em 
congelador. 
Manter entre 2 e 8°C: 
anti-imunoglobulina humana (IgG) conjugada ao isotiocianato de 
fluoresceína; 
glicerina tamponada pH 9,0 ± 0,5; e 
azul de Evans a 0,1 %. 
Atenção 
Manipular todos os controles, lâminas e amostras como material
potencialmente infectante. 
Certifique-se de que os produtos estão dentro do prazo de 
validade.
16
Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
É necessário titular o conjugado antes de realizar a reação de IFI para 
HIV-1? 
Sim. Mesmo que o fabricante indique o seu título, a titulação do 
conjugado deve ser feita a cada novo lote e sempre que o seu controle 
positivo acusar perda de reatividade. É fundamental que você faça a 
adequação do late à sua realidade, porque existem variações lote a 
lote na qualidade dos reagentes e também na capacidade de 
resolução dos diferentes microscópios de fluorescência. 
Como realizar a titulação do conjugado? 
Para realizar a titulação do conjugado, utilize o soro-controle 
positivo, com título conhecido, e o soro-controle negativo, fornecidos 
por Bio-Manguinhos/FIOCRUZ/MS. 
1. Leia atentamente todas as instruções do fabricante; 
2. retire os soros-controle positivo e negativo e os demais materiais da 
geladeira. Deixe-os atingir a temperatura ambiente; 
3. retire uma lâmina do congelador e deixe-a descongelar até atingir a 
temperatura ambiente. Coloque-a em estufa a 37°C até sua 
completa secagem; 
4. identifique a lâmina; 
Atenção 
Evite atrito na parte superior da lâmina onde se encontram fixadas
as células infectadas. 
Lembre-se de que a temperatura ambiente em laboratórios deve
estar entre 20 e 26°C. 
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PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios 
5. prepare um protocolo de trabalho, indicando a posição do Controle 
Positivo (CP) e do Controle Negativo (CN), conforme mostrado a 
seguir: 
6. dilua o soro-controle negativo (CN) a 1/8. Para realizar esta diluição, 
coloque em um tubo 20 µl de soro e adicione 140 µl de PBS pH 7,2. 
Homogeneíze suavemente, evitando a formação de bolhas; 
7. dilua o soro-controle positivo (CP) até o título descrito no rótulo do 
frasco. Utilize o esquema de diluições seriadas que segue: 
Atenção
Homogeneíze o conteúdo de cada tubo antes de transferir 160µI para 
o tubo seguinte. 
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Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
8. pipete, de acordo com seu protocolo, 10 µl do controle negativo 
diluído a 1/8, nas demarcações correspondentes da lâmina; 
9. seguindo seu protocolo de trabalho, pipete, nas demarcações da 
lâmina, 10 µl da diluição correspondente ao título do controle 
positivo, descrito pelo fabricante; 
10. coloque a lâmina em câmara úmida e incube em estufa a 37°C, 
durante 30 minutos; 
11. mergulhe rapidamente a lâmina em um recipiente contendo PBS 
pH 7,2, para retirar o excesso de reagentes; 
12. coloque a lâmina na cuba tipo Koplin e adicione PBS pH 7,2, até 
cobri-la completamente; 
13. coloque a cuba em agitação durante 5 minutos. Caso você não 
tenha um agitador do tipo Kline, faça sucessivas e cuidadosas 
agitações manuais pelo mesmo período; 
14. repita os passos 12 e 13 mais duos vezes, trocando o PBS em cada 
uma delas; 
15. lave rapidamente a lâmina em água destilada; 
Atenção 
Não deixe que a ponteira da pipeta toque ou raspe a superfície
da lâmina, para não remover as células. Tome cuidado para que
o conteúdo das diferentes demarcações não se misture. Utilize
ponteiras diferentes para os controles positivo e negativo. 
19
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios 
16. coloque a lâmina em estufa a 37°C, para a completa secagem, 
por aproxidamente 10 minutos; 
17. prepare uma solução PBS - azul de Evans (PBS-AE) a 0,004%, 
colocando em um tubo 40 µl da solução azul de Evans a 0,1 % e 
adicionando 960 µl de PBS pH 7, 2. Homogeneíze suavemente, 
evitando a formação de bolhas; 
18. diluição do conjugado: 
x� dilua o conjugado a 1/50, colocando em um tubo, previamente 
identificado 10 µl do conjugado e 490µ de PBS -AE: 
Atenção 
Prepare a solução PBS-AE a 0,004% imediatamente antes da
diluição do conjugado. 
20
Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
x� pegue 6 tubos, previamente identificados, e faça as outras 
diluições do conjugado, a partir da diluição de 1/50, conforme 
descrito a seguir: 
TUBO
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PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios 
19. pipete 15µl de cada diluição do conjugado nas demarcações, 
conforme o modelo abaixo: 
20. incube, lave e seque a lâmina, conforme procedimentos descritos 
anteriormente nos itens 10 a 16; 
21. prepare a lâmina para leitura, aplicando sobre a mesma duas a 
três gotas da glicerina tamponada pH 9,0±0,5. Cubra a lâmina com 
uma lamínula 24 x 50mm, evitando a formação de bolhas. 
Mantenha a lâmina ao abrigo da luz e em local seco até a leitura; 
22. faça a leitura da reação em microscópio de fluorescência, 
utilizando objetiva de 40 X. Anote em seu protocolo os resultados 
observados. 
O titulo do conjugado será igual à primeira diluição, na qual 25 a 
35% das células apresentarem intensa fluorescência na demarcação 
com controle positivo e ausência de fluorescência na demarcação 
com controle negativo. 
Atenção 
Não esqueça de que somente 25 a 35% das células possuem 
antígenos virais capazes de serem detectados. Repita a 
titulação do conjugado caso não seja observado, no controle 
positivo, o percentual indicado de células fluorescentes. 
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Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
Como realizar a reação de IFI para HIV-1? 
1. Leia atentamente todas as instruções do fabricante antes de iniciar a 
reação;
2. retire os soros-controle do congelador e deixe-os atingir a 
temperatura ambiente. Pegue as amostras a serem testadas e deixe-
as, também, atingirem a temperatura ambiente; 
3. retire da geladeira a anti-imunoglobulina humana conjugada ao 
isotiocianato de fluoresceína, a glicerina tamponada e o azul de 
Evans e deixe-os atingir a temperatura ambiente; 
4. faça o protocolo de trabalho (vide Anexos). Lembre-se de que os 
soros-controle positivo e negativo devem estar presentes em todas as 
lâminas para comparação no momento da leitura; 
5. retire do congelador o número necessário de lâminas e deixe-as 
descongelar até atingirema temperatura ambiente. Depois coloque-
as em estufa a 37°C, até sua completa secagem; 
6. dilua as amostras a serem testadas e os soros-controle, positivo e 
negativo, a 1/8 em PBS. Para realizar esta diluição, coloque em um 
tubo 10 µl de soro-controle ou de cada amostra e adicione 70 µl de 
PBS pH7,2. Homogeneíze suavemente, evitando a formação de 
bolhas;
7. pipete, em cada demarcação da lâmina, 10 µl das diluições dos 
soros-controle (CP e CN) e das amostras, de acordo com seu 
protocolo de trabalho; 
Atenção 
Não deixe que a ponteira da pipeta toque ou raspe a superfície 
da lâmina, para não remover as células. Tome cuidado para que 
o conteúdo das diferentes demarcações não se misture. Utilize 
uma ponteira para cada soro-controle e para cada amostra 
aplicada. 
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PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios 
8. coloque a(s) lâmina(s) em camara úmida e incube, em estufa a 
37°C, durante 30 minutos; 
9. mergulhe rapidamente a(s) lâmina(s) em um recipiente contendo 
PBS pH 7,2, para retirar o excesso de reagentes; 
10. coloque a(s) lâmina(s) na cuba tipo Koplin e adicione PBS pH 7,2, 
até cobri-la(s) completamente; 
11. coloque a cuba em agitação durante 5 minutos. Caso você não 
tenha um agitador do tipo Kline, faça sucessivas e cuidadosas 
agitações manuais pelo mesmo período; 
12. repita os passos 10 e 11 mais duas vezes, trocando o PBS em cada 
uma delas; 
13. lave rap8idamente a(s) lâmina(s) em água destilada; 
14. coloque a(s) lâmina(s) em estufa a 37°C, para a completa 
secagem, por aproxidamente 10 minutos; 
15. prepare uma solução PBS - Azul de Evans (PBS-AE) a 0,004%. Para 
isso, dilua 25 vezes a solução Azul de Evans a 0,1 % em PBS pH7,2. 
Prepare somente o volume necessário para diluir o conjugado 
Veja, no quadro a seguir, exemplos de volumes que podem ser 
preparados, em função do número de lâminas utilizadas; 
Volume Número 
de
lâminas PBS pH 7,2 Azul de Evans 0,1% 
1 a 2 480 µl 20 µl 
3 a 4 960 µl 40 µl 
5 a 6 1440 µl 60 µl 
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Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
16. dilua o conjugado (anti-imunoglobulina humana-isotiocianato de 
fluoresceína), previamente titulado, na soluço PBS-AE a 0,004%; 
17. pipete 15µI do conjugado diluído em cada demarcação da(s) 
lâmina(s); 
18. incube, lave e seque a(s) lâmina(s), segundo os procedimentos 
descritos anteriormente nos itens 8 a 14; 
19. prepare a(s) lâmina(s) para leitura, aplicando duas a três gotas de 
glicerina tamponada pH 9,0±0,5 sobre elas. Cubra cada lâmina 
com uma lamínula 24 x 50 mm, evitando a formação de bolhas. 
Mantenha a(s) lâmina(s) ao abrigo da luz e em local seco até a 
leitura; 
20. faça a leitura da reação em microscópio de fluorescência, 
utilizando objetiva de 40 X. Anote, em seu protocolo, os resultados 
observados. 
Atenção 
O conjugado deve ser previamente titulado, para se determinar a
diluição correta a ser utilizada. 
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PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios 
Como fazer a leitura e a interpretação da reação de IFI para HIV-1? 
Inicie a leitura pela demarcação que corresponde ao controle 
positivo. Em seguida, leia a demarcação que corresponde ao controle 
negativo. 
A interpretação dos resultados deve obedecer aos padrões 
descritos no quadro a seguir: 
Quadro 1: Leitura e Interpretação de uma reação de IFI para HIV-1 
Leitura Interpretação
Ausência de fluorescência em todas as células 
que apresentam, em geral, coloração "verme- 
lho-tijolo" 
Amostra não reagente 
Cerca de 25 35% das células apresentam 
fluorescência na membrana e em outras partes 
da célula, sendo que as demais apresentam, em 
geral, coloração "vermelho tijolo". 
Algumas amostras podem apresentar reatividade 
menos intensa, porém, sempre que observada a 
fluorescência no percentual indicado, a amostra 
será reagente. 
Amostra reagente 
Qualquer padrão diferente dos descritos 
anteriormente. 
Na maioria das vezes, pode-se observar reação 
fluorescente em quase todas as células. 
Amostra indeterminada 
Atenção 
No caso de resultados indeterminados, repita a reação de IFI.
Persistindo o resultado, submeta a amostra a outra metodologia
confirmatória. 
Em todas as lâminas, os controles devem funcionar adequada-
mente, apresentando características padrão reagente e não
reagente. Caso contrário, repita a reação.
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Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
O que é uma reação de "Western Blot" - WB para HIV-1? 
O WB é uma reação que utiliza membrana de nitrocelulose como 
fase sólida. As proteínas e glicoproteínas virais que atuam como 
antígeno são separadas eletroforeticamente, em gel de poliacrilamida, 
segundo seus pesos moleculares e transferidas ("blotted") para a 
membrana (Etapa 1). A reação entre o antígeno adsorvido à 
membrana e os anticorpos da amostra (Etapa 2) é revelada por um 
processo enzimático. Adiciona-se o conjugado 1, composto por uma 
anti-imunoglobulina humana conjugado com biotina (Etapa 3). e o 
conjugado 2, que é composto de avidina ligada a uma enzima (Etapa 
4). A degradação do substrato origina um produto insolúvel e corado 
(Etapa 5) que permite, a olho nu, a visualização da reação sobre a fita. 
Alguns conjuntos de WB para HIV-1 utilizam outros sistemas no lugar
da avidina e da biotina, para revelação da reação. 
29
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios 
Figura 1: seqüência esquemática de uma reação de WB para HIV-1 
30
Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
Quando deve ser realizada uma reação de WB para HIV-1? 
A reação de WB para HIV-1 deve ser realizada somente nos casos 
em que a IFI para HIV-1 não puder caracterizar as amostras triadas na 
primeira etapa ou apresentar resultado indeterminado. 
Em caso de dúvida, consulte o fluxograma apresentado neste 
manual. 
Qual o material necessário para executar uma reação de WB para HIV-1? 
Material geralmente fornecido pelo fabricante: 
tiras de nitrocelulose (0,4 mm x 10 cm) adsorvidas com proteínas do 
HIV-1;
soro-controle não reativo; 
soro-controle reativo forte; 
soro-controle reativo fraco; 
 solução tampão para diluição das amostras e do conjugado; 
 solução tampão para lavagem das tiras; 
 conjugados; 
 substrato; 
 solução proteica, usualmente leite em pó desnatado, para eliminar 
reatividade inespecífica; 
 placas plásticas com tampa contendo canaletas para colocação 
das tiras; e 
 pinça plástica para manipulação das fitas de nitrocelulose. 
31
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios 
Material necessário, mas não fornecido: 
agitador orbital; 
 sistema de aspiração de líquidos; 
 pipetas automáticas com volumes variáveis de 5 a 50µI e de 50 a 
200µl; 
 ponteira para pipetas automáticas; 
 béquer de 1.000 ml; 
 proveta de 1.000 ml, 500 ml e 100 ml; 
 balão de fundo chato de 1.000 ml; 
 bastão de vidro; 
 pipeta de vidro de 5 ml, 10 ml e 20 ml; 
 adaptador de borracha ou plástico para pipetas de vidro; e 
 recipiente de paredes rígidas, boca larga e tampa contendo 
hipoclorito de sódio a 2%. 
Como realizar uma reação de WB para HIV-1? 
Os procedimentos variam de acordo com o fabricante do 
conjunto diagnóstico. 
Seja qual for o conjunto utilizado, alguns procedimentos gerais 
devem ser observados: 
1. leia atentamente as instruções do conjunto de diagnóstico antes de 
iniciar a reação; 
2. confira todos os componentes, materiais e reagentes desse conjunto 
e providencie os outros materiais não fornecidos, necessários à 
realização do teste; 
3. siga rigorosamente as instruções de cada fabricante. Observeo 
preparo dos tampões, reagentes, conjugados e substratos. Utilize 
exatamente os volumes indicados. Não faça qualquer alteração 
com o intuito de economizar tempo ou reagentes; 
32
Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
4. faça um protocolo de trabalho (vide Anexos), relacionando os 
controles e o registro das amostras com o número existente em 
cada tira de nitrocelulose; 
5. deixe as amostras e os reagentes atingirem a temperatura 
ambiente antes de iniciar a reação; 
6. utilize pinças plásticas para manipular as tiras de nitrocelulose a 
serem utilizadas na reação; 
7. coloque cada uma das tiras dentro de uma canaleta, mantendo a 
face numerada voltada para cima; 
8. tampe as placas plásticas para evitar a mistura dos conteúdos de 
diferentes canaletas; 
9. observe rigorosamente todos os volumes, os tempos e as formas de 
agitação e incubação recomendados pelo fabricante; 
10. descarte em solução de hipoclorito de sódio a 2%, todos os 
produtos e insumos, incluindo os utilizados nos processos de 
lavagem. 
Atenção 
Siga passo a passo todas as instruções do fabricante, pois
qualquer alteração ou variação na execução do WB para HIV-1
poderá produzir resultados errôneos ou duvidosos. 
33
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios 
Além disso, para garantir a qualidade dos resultados é importante que 
você: 
não use reagentes com prazo de validade vencido. Verifique se os 
reagentes encontram-se dentro dos especificações, sem turvação, 
precipitados ou com coloração alterada; 
não misture controles, conjugados, tampões, reagentes e tiras de 
diferentes lotes e/ou fabricantes; 
armazene os conjuntos para diagnóstico de acordo com as 
recomendações do fabricante; 
não exponha o substrato à luz durante a estocagem ou incubação, 
pois poderá ocorrer a fotodecomposição do mesmo; 
 não coloque o substrato em contato com substâncias oxidantes ou 
metais, para evitar a precipitação, que torna o produto impróprio 
para o uso; 
 faça a limpeza e a manutenção periódica dos equipamentos 
utilizados na reação. 
Como fazer a leitura e interpretação dos resultados de um teste de WB 
para HIV-1? 
A leitura é realizada por observação visual, sem a necessidade de 
uso de qualquer tipo de aparelho. 
Para interpretação dos resultados, o PN-DST/AIDS-MS recomenda 
os critérios estabelecidos pelo Centro de Controle de Doenças e 
Prevenção (CDC), de Atlanta, nos Estados Unidos, apresentados no 
quadro a seguir: 
34
Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
Critérios para interpretação dos resultados de WB para HIV-1 
 Amostra negativa: ausência total de bandas. 
 Amostra positiva: presença de pelo menos duas das 
bandas gp 160/120, gp41 e p24, 
acompanhadas ou não de outras 
bandas. 
 Amostra indeterminada: qualquer outro padrão diferente dos 
descritos anteriormente. 
Figura 2: representação esquemática da 
posição das proteínas e glicoproteínas do 
HIV-1 em uma tira de nitrocelulose.
35
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios 
Que amostras devem ser investigadas para HIV-2 após a realização dos 
testes confirmatórios para HIV-1? 
Devem ser investigadas para HIV-2 as seguintes amostras: 
as amostras que apresentarem resultados contraditórios na triagem e 
reação negativa de IFI para HIV-1; 
as amostras reagentes nos dois testes de triagem e com IFI e WB para 
HIV-1 negativos ou indeterminados. 
Para a investigação de HIV-2, as amostras deverão ser enviadas 
ao Laboratório de Suporte Técnico do PN-DST/AIDS-MS: 
Atenção 
No caso do WB para HIV-1, a maioria dos fabricantes possui fitas 
com as seguintes proteínas virais: gp160/120, p66, p55, p51, gp41, 
p31, p24 e p17. 
Entretanto, existem variações entre produtos de diferentes 
fabricantes e entre lotes de um mesmo conjunto. Por isso, a 
presença, a concentração e, principalmente, a posição das 
proteínas podem variar em cada lote. 
Observe que é fundamental a presença de pelo menos duas das 
bandas pg160/120, gp41 e p24 para a caracterização de uma 
amostra positiva. 
Laboratório Avançado de Saúde Pública 
LASP-BA/FIOCRUZ-MS 
Endereço: Rua Waldemar Falcão, 123 – Brotas – Salvador/BA 
Fax: (071) 356.2255 Telefone (071) 356.8822 
36
Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
Qual a importância de um protocolo de trabalho no realização de um 
teste? 
O protocolo é um documento laboratorial de registro das 
amostras com valor legal. Ele estabelece a ordem das amostras a serem 
testadas, de forma que qualquer pessoa possa interpretar os resultados. 
Alguns métodos utilizam equipamentos para imprimir os resultados e o 
material impresso deve ser guardado junto com o protocolo. 
Veja, no título Anexos deste manual, exemplos de protocolo para 
IFI e WB. 
Que outras medidas podem ser adotadas para assegurar resultados 
confiáveis? 
Para assegurar que os resultados finais sejam confiáveis é 
fundamental: 
utilizar soros para controle de qualidade interno; 
participar de um programa que forneça os soros-controle; 
participar de um programa de avaliação externa da qualidade. 
O que é controle de qualidade interno? 
Controle de qualidade interno de um ensaio corresponde ao uso 
de amostras positivas e negativas, obrigatoriamente incluídas em cada 
ensaio. Essas amostras são fornecidas pelos fabricantes e podem, 
também, ser preparadas em seu Iaboratório. 
O preparo ou uso de soros-controle próprios constitui um 
excelente mecanismo de análise de possíveis variações lote a lote. Os 
controles também podem ser utilizados para avaliação da 
reprodutibilidade dos testes, em um mesmo ensaio (intra-ensaio) ou 
ensaios diferentes (inter-ensaio), de um mesmo lote. 
39
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios 
Como obter soros-controle? 
Podem ser adquiridos de diversas instituições que possuem soros 
controles para a venda. O PN-DST/AIDS-MS desenvolveu um projeto de 
distribuição de soro-controle. Informações podem ser obtidas pelo 
telefax gratuito 0800-612436, do TELELAB.
O que é um programa de avaliação externa de qualidade? 
Um programa de avaliação externa da qualidade envolve um 
mecanismo de análise, no qual o laboratório recebe um painel de 
amostras que são incluídas na sua rotina. Os resultados obtidos são 
enviados a um Centro de Referência e analisados, possibilitando a 
avaliação confidencial do desempenho de cada laboratório. 
Porque adotar medidas de controle e participar de avaliação externa 
da qualidade? 
A adoção das medidas de controle descritas e a participação em 
um programa de avaliação externa da qualidade permitem ao 
laboratório garantir a qualidade dos procedimentos utilizados e 
conseqüentemente a confiabilidade dos resultados. 
40
Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
Fórmula para preparo de Tampão de Fosfato (PBS) pH 7,2 
Sais Quantidade 
Cloreto de sódio (NaCI) PA (0,15M) 8,77 g 
Fosfato de sódio dibásico anidro (Na2HPO4) PA (0,01M) 1,02 g 
Fosfato ácido de sódio anidro (Na H2P O4) PA (0,01M) 0,34 g 
Água destilada – quantidade suficiente para (qsp) 1.000 ml 
OBS: 
Após a completa dissolução dos sais, verifique se o pH encontra-se na 
faixa indicada pH 7,2±0,2 solução final. Caso contrário, prepare nova 
solução.
Atenção 
Os sais descritos acima quando não utilizados na forma anidra 
deverão ter suas quantidades recalculadas em função das 
moléculas de água presentes. Verifique sempre no rótulo dos 
produtos a composição e o peso molecular dos sais. 
43
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatóriosExemplo de correção de peso para sais na forma hidratada 
Fosfato de sódio dibásico anidro (Na2 HPO4) PA (0,01M) 
Peso molecular: 142___________________________________ pesar 1,02g 
Fosfato de sódio dibásico hidratado (Na2HPO4. 12 H2O) PA (0,01M) 
Peso molecular: 359___________________________________ pesar X g 
Cálculo 
Neste exemplo, onde o Fosfato de sódio dibásico hidratado 
contém 12 moléculas de água, deve-se pesar 2,57g para preparar o PBS 
pH7,2. Para correção do peso de qualquer sal hidratado, utilize uma 
regra de três simples, relacionando o peso molecular e a quantidade a 
ser pesada, como demonstrado. 
Atenção 
Antes de pesar qualquer sal, verifique sempre na embalagem sua
composição e seu peso molecular. 
142 X = 1,02 X 359 
X = 1,02 x 359
142
X = 2,57g 
44
Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
47
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios 
Teste de Western Blot para HIV-1 
Protocolo
Fabricante____________________ Lote: ____________ Validade:___________ 
Data de realização _____/ _____/ _____ Técnico responsável: _____________ 
Observações: ______________________________________________________________ 
48
Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
Para cuidar da sua segurança, da segurança de 
seus colegas de trabalho e do meio ambiente, 
obedeça aos procedimentos básicos de 
biossegurança em laboratórios: 
Figura 1. Símbolo de risco biológico 
I
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança 
Todo cuidado é pouco na manipulação de materiais biológicos, 
tais como soro, sangue ou secreções, fluidos orgânicos, tecidos, etc. 
Redobre suas precauções, pois esses materiais são potencialmente 
infectantes e muitas vezes estão contaminados com agentes etiológicos 
diferentes do que se está pesquisando, ou ainda desconhecidos. Nunca 
pipete com a boca e jamais cheire placas de cultura. 
A inativação do soro em banho-maria a 56 °C por 30 minutos não 
elimina o potencial infectante da amostra. 
Lembre-se de que, com a automação, aumentou muito o número 
de amostras processadas em laboratório e, conseqüentemente, 
aumentou também o risco de contaminação. Como você sabe, é difícil 
afirmar que um profissional se contaminou, de fato, em serviço. Isso faz 
com que as doenças infecto-contagiosas causadas por acidentes de 
trabalho não sejam devidamente notificadas; em conseqüência, as 
medidas de segurança envolvendo o biorrisco acabam não sendo 
implementadas. 
II
Biossegurança PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
Use sempre Equipamento de Proteção Individual (EPI): avental ou 
jaleco longo de mangas compridas e punho retrátil, luvas descartáveis, 
óculos de proteção, pipetadores manuais ou automáticos e, quando for 
o caso, protetor facial. 
Os EPI são regulamentados pelo Ministério do Trabalho e seu uso 
visa a minimizar a exposição do técnico aos riscos e evitar possíveis 
acidentes nos laboratórios. Note que, às vezes, os profissionais de 
laboratório precisam de um tempo para se adaptar ao uso dos 
equipamentos na sua rotina. O importante é que você se adapte e 
incorpore a utilização dos EPI à sua prática profissional. O uso indevido 
dos EPI, ao invés de proteger, poderá ocasionar acidentes. 
Figura 2. Ilustração dos principais equipamentos de proteção individual 
(EPI) 
III
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança 
Evite a formação e dispersão de aerossóis. 
Aerossóis são micropartículas sólidas e líquidas com dimensões 
aproximadas entre 0,1 e 50 micro que podem, caso contenham 
microorganismos, permanecer em suspensão e plenamente viáveis por 
várias horas. 
A pipetagem, flambagem de alças, abertura de frascos e 
ampolas, manipulação de seringas, agulhas, lancetas, lâminas e outros 
assemelhados podem gerar e propagar aerossóis.
Abertura de frascos, ampolas, tubos e garrafas de cultura requer 
cuidados especiais. Envolva a parte a ser aberta com um pedaço de 
gaze. Utilize um pedaço de gaze para cada material, prevenindo assim 
a contaminação cruzada. Descarte-a imediatamente em hipoclorito de 
sódio a 2%. 
Centrífugas, agitadores e maceradores, quando manipulados sem 
as precauções e abertos antes da total parada ou término da 
operação, igualmente podem contaminar o ambiente laboratorial. 
IV
Biossegurança PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
Jamais reencape agulhas. Esse procedimento é uma das 
principais causas da contaminação de profissionais de saúde por 
microorganismos, existentes no sangue e em outros fluidos orgânicos, 
como por exemplo, o vírus da hepatite B e o HIV. Após a coleta, você 
deve descartar esse material diretamente em recipiente de paredes 
rígidas com tampa, contendo hipoclorito de sódio a 2% em volume 
superior a metade do recipiente. 
Lembre-se: cada mililitro de sangue contaminado com o vírus da 
hepatite B contém 100.000.000 de partículas virais, que podem 
permanecer viáveis por até uma semana. Basta 1(uma) dessas 
partículas para contaminar uma pessoa. 
Figura 3. Ilustração do descarte de agulha em recipiente apropriado. 
V
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança 
Reduza ao máximo o manuseio de resíduos, em especial, os 
perfurocortantes. Descarte o rejeito perfurocortante diretamente em 
recipiente de paredes rígidas, contendo hipoclorito de sódio a 2%. Deixe 
em imersão total no mínimo por 24 horas e, em seguida, faça a 
autoclavação desse material. 
Esta é uma regra básica para diminuir os riscos de acidente nos 
Iaboratórios. É fundamental que os materiais perfurocortantes sejam 
autoclavados depois da imersão em hipoclorito de sódio a 2%. Só então 
esses materiais devem ser encaminhados ao lixo hospitalar. O 
acondicionamento dos resíduos de laboratório deve seguir a Norma 
Brasileira (NBR) 9190 da Associação Brasileira de Normas Técnicas - ABNT, 
que recomenda sacos brancos leitosos para os resíduos potencialmente 
infectantes e hospitalares e escuros para o lixo comum. 
Os profissionais responsáveis pela limpeza e conservação devem 
ser bem orientados e usar equipamentos de proteção. Todos os 
recipientes para descarte devem estar identificados. 
Lembre-se de que, pela legislação brasileira, quem gera o resíduo 
é o responsável pela sua eliminação e controle. 
No caso dos materiais reutilizáveis, como vidraria e utensílios, 
deposite-os em recipiente contendo o desinfetante próprio, pelo tempo 
de contato recomendado e, em seguida, fadiga a autoclavação. 
Depois, lave normalmente esses materiais e guarde-os para uso 
posterior. 
VI
Biossegurança PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
Identifique e sinalize os principais riscos presentes em seu 
laboratório. Produtos e áreas que oferecem risco devem ser marcados 
com os devidos símbolos internacionais em etiquetas auto-adesivas 
padrão. 
Veja, a seguir, os principais símbolos associados aos riscos em 
laboratórios. 
Figura 4. Símbolo de risco biológico para entrada de laboratórios.
VII
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança 
Figura 5. Principais símbolos internacionais associados aos riscos em 
Iaboratórios. 
VIII
Biossegurança PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
Verifique sempre as condições de funcionamento dos 
Equipamentos de Proteção Coletiva (EPC): extintores de incêndio, 
chuveiros de segurança, lava-olhos, pia para lavagem de mãos, caixa 
de areia e cabine de segurança biológica. 
Existem três tipos de cabines de segurança biológica disponíveis 
no mercado: as de classe I, classe II e classe III. São recomendadas para 
o uso em Iaboratórios clínicos as de classe II. Veja a figura 6, na página 
seguinte. 
Procedimentos que devem ser observados na cabine de 
segurança biológica: 
descontamine a superfície interior, antes e depoisdo uso, com gaze 
estéril embebida em desinfetante adequado; 
 ligue a cabine e a luz ultravioleta 20 minutos antes e deixe tudo 
ligado pelo mesmo tempo ao final de sua utilização; 
 use avental de mangas longas, luvas descartáveis e máscara; 
 não efetue movimentos rápidos ou bruscos dentro da cabine e evite 
operações que causem turbulência; 
 não use bico de Bunsen, pois pode acarretar danos ao filtro HEPA e 
causar desequilíbrio do fluxo de ar. Se necessário, use incinerador 
elétrico ou microqueimador automático; e 
mantenha as grelhas anteriores e posteriores da cabine 
desobstruídas. A cabine não e um depósito. Evite guardar 
equipamentos ou quaisquer outros objetos no seu interior. 
IX
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança 
Figura 6 : ilustração das cabines de segurança biológica - classes I, II e III. 
As cabines de classe I e II são consideradas como barreira de 
proteção parcial e a de classe III é uma barreira de proteção total. 
X
Biossegurança PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
Para descontaminação pessoal, de equipamentos e superfícies 
fixas, utilize desinfetantes eficientes e adequados. Use sempre produtos 
registrados no Ministério da Saúde. 
Não existe um desinfetante único que atenda a todas as 
necessidades. É fundamental conhecer os diversos agentes químicos e 
sua compatibilidade de use para evitar custos excessivos e utilização 
inadequada. 
Para a descontaminação de amostras biológicas na rotina dos 
Iaboratórios clínicos, recomendamos os compostos libertadores de 
cloro. O mais comumente utilizado é o hipoclorito de sódio a 2%. Sua 
forma mais ativa é o ácido hipocloroso (HOCI), que é formado em 
soluções com pH entre 5 e 8. A eficácia do cloro decresce com o 
aumento do pH e vice-versa. Cabe lembrar que a atividade desse 
ácido é diminuída na presença de matéria orgânica, fato que deve ser 
considerado quando aplicado em superfícies contendo sangue e outros 
líquidos corpóreos. Os hipocloritos têm sua estabilidade dependente de 
fatores como concentração, temperatura, pH, luz, metais e prazo de 
validade. 
Os hipocloritos são corrosivos para metais. Objetos de prata, 
alumínio e até mesmo de aço inoxidável são atingidos, quando imersos 
em soluções rotineiramente utilizadas em laboratório. Hipoclorito de 
sódio é tóxico e causa irritação na pele e olhos. Se ingerido, provoca 
corrosão das membranas e mucosas e sua inalação causa irritação 
severa no trato respiratório. Jamais misture os hipocloritos com outras 
substâncias químicas, tais como desinfetante, álcool, soluções 
germicidas, etc. 
Após o tratamento por 24 horas com hipoclorito de sódio a 2%, os 
materiais devem ser autoclavados. A autoclavação é recomendada 
tendo em vista a possibilidade do hipoclorito não atingir as partes do 
material a ser esterilizado. Caso isso não seja possível, a alternativa é o 
método de fervura por período não inferior a 30 minutos. 
XI
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança 
Observe, na tabela abaixo, a indicação de alguns agentes químicos e 
seu espectro de ação antimicrobiana. 
Eficiência antimicrobiana de alguns agentes químicos desinfetantes 
frente a agentes microbianos 
Bactérias
Vírus 
lipofílicos
Vírus
hidrofílicos
Microbactérias Fungos
Esporos
bacterianos
Etanol + + - + V - 
Formaldeído + + + + + + 
Glutaraldeído + + + + + + 
Comp. Cloro + + + + + + 
Fenóis + + - + + - 
Quaternários 
de amônia 
+ + + - + - 
lodóforos + + + - + - 
(+) Atividade 
(-) Ausência de atividade 
(V) Variável de acordo com o microorganismo 
XII 
Biossegurança PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
Tenha muito cuidado com a manipulação e estocagem de 
substâncias químicas. Leia com atenção as informações contidas nos 
rótulos 
A estocagem de matéria-prima deve ser feita em armários 
apropriados, bem ventilados, ao abrigo da luz solar e calor. É 
importante observar a incompatibilidade entre as diferentes 
substâncias. 
Sempre que recomendado pelo fabricante, os agentes químicos 
devem ser manipulados em capelas de exaustão química devidamente 
instaladas. Atenção: não confunda capela de exaustão química com 
cabine de segurança biológica. 
Veja a seguir os riscos relacionados a cada categoria química: 
Categoria química e riscos relacionados 
Grupo Químico Risco
Ácidos Corrosão
Cianetos e Sulfetos Envenenamento
Líquidos Inflamáveis Incêndio
Sólido Inflamável Incêndio
XIII
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança 
Bases Corrosão
Seja sempre consciente da importância de suas ações na 
preservação da biossegurança em seu local de trabalho: 
lave as mãos antes e depois de qualquer procedimento laboratorial; 
nunca pipete com a boca; 
jamais cheire placas de cultura; 
 dentro do laboratório, não fume, não coma, não beba, não prepare 
refeições; 
 quando estiver usando luvas, não manuseie objetos de uso comum, 
como telefones, maçanetas de portas e janelas, jornais, revistas, etc.; 
 não guarde alimentos ou bebidas em geladeiras e congeladores 
para armazenagem de material biológico; e 
 vacine-se rotineiramente contra a hepatite B. 
Seguindo essas recomendações, você vai estar contribuindo para a 
diminuição de acidentes 
Se acontecer um acidente de trabalho em seu laboratório, notifique 
imediatamente a sua chefia. 
XIV
Biossegurança PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
Muitas das atividades aqui descritas já fazem parte do seu 
cotidiano. Faça uma reflexão sobre o que acabou de ler e verifique o 
que pode ser mantido, modificado e incorporado a seu trabalho e ao 
seu laboratório para que a sua prática profissional se desenvolva de 
acordo com os procedimentos técnicos e cuidados de biossegurança 
recomendados pelo Programa Nacional de Doenças Sexualmente 
Transmissíveis e AIDS, do Ministério da Saúde. As questões colocadas a 
seguir facilitarão essa reflexão. 
Considerações finais 
a
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança 
Condições gerais do laboratório 
As áreas de circulação estão desobstruídas? 
Qual a situação geral quanto ao aspecto de limpeza? 
Qual o estado de conservação e manutenção de pisos, escadas, 
paredes e tetos? 
 O local de trabalho está adequado para atividades envolvendo o 
risco biológico? 
 As bancadas e demais mobiliários do laboratório estão em 
condições de uso? 
 Existem bancadas apropriadas para trabalhos com solventes e 
demais substâncias químicas corrosivas? 
 Existe pia diferenciada para lavagem das mãos no Iaboratório? 
Existem mecanismos de contenção que previnam a entrada de 
insetos e roedores? 
Existem programas de manutenção preventiva de equipamentos? 
Estocagem
 Os produtos armazenados e a área de estocagem estão 
organizados com os devidos cuidados de segurança? 
 Existe o cuidado de se estocar materiais e/ou substâncias 
incompatíveis separadamente? 
b
Biossegurança PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
Local de higiene pessoal e de alimentação 
O local é mantido limpo e em condições de higiene? 
Existe água potável disponível? 
Existem sabão e toalha em condições de uso? 
Existe local para troca de roupa e guarda de objetos pessoais? 
Existe área para alimentação separada da área de laboratório? 
Existe adequada organização para coleta de lixo e demais rejeitos 
(não infecciosos)? 
Refrigeração e ventilação 
A temperatura de trabalho está entre 20 e 26°C? 
As janelas estão protegidas contra o excesso de luz solar? 
Existe ventilação adequada, especialmente nas salas com cabines 
de fluxo laminar? 
Iluminação 
A iluminação geral é adequada? 
Existe iluminação dirigida nas bancadas de trabalho? 
Serviços 
 O laboratório tem suficiente abastecimento de água, energia 
elétrica e gás? 
Existe adequada manutenção de fusíveis, lâmpadas e cabos 
elétricos? 
A limpeza e higienização das caixasd'água são realizadas com 
periodicidade recomendada? 
c
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança 
Segurança geral 
 O laboratório é devidamente fechado e seguro quando não está 
ocupado? 
 As portas e janelas são mantidas devidamente fechadas? 
 Os materiais tóxicos e equipamentos de risco são estocados em área 
segura?
Prevenção de incêndio 
Existe sistema de alarme? 
As passagens pelas portas de emergência estão desobstruídas? 
 O sistema de detecção de incêndio está em bom funcionamento e 
é regularmente testado? 
 Existe sinalização de emergência? 
 Existem extintores de incêndio para os diversos tipos de materiais e 
em quantidade suficiente? 
 Os extintores estão dentro do prazo de validade? 
 Existe sinal de "não fumar" na área de laboratório? 
 A equipe está treinada em combate a incêndio? 
Estocagem de líquidos inflamáveis 
O local está separado do prédio principal? 
 Existe ventilação suficiente para retirar vapores? 
 O local está devidamente sinalizado? 
 Existem lâmpadas seladas para proteção contra ignição nos 
vapores? 
 Existe advertência de "não fumar"? 
d
Biossegurança PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
Risco com eletricidade 
 As instalações estão de acordo com os padrões estabelecidos pela 
ABNT?
 Existe fio de terra? Os equipamentos estão devidamente aterrados? 
 Os equipamentos com potencial de risco de desligamento estão 
devidamente ligados a um circuito de emergência para os casos de 
queda ou interrupção de energia? 
 Os cabos de conexão aos diversos equipamentos estão em perfeito 
estado de manutenção? 
 Cada equipamento está ligado em uma tomada; evita-se o uso de 
benjamim? 
 Todas as tomadas têm sua voltagem identificada? 
 Você sabe onde fica o quadro-geral de força da sua unidade? 
Gases e líquidos comprimidos 
 Os diversos tipos de gases estão devidamente identificados? 
 Os cilindros possuem válvulas de segurança? 
 Existe advertência de não-utilização de óleo nas válvulas? 
 Os cilindros estão devidamente seguros contra quedas? 
 Existe ventilação suficiente para evitar a formação de bolsões de 
gases e explosões? 
Proteção pessoal 
 Existem em quantidade suficiente:l 
Lava-olhos? 
Chuveiros de emergência? 
Proteções contra radiações, incluindo os dozímetros? 
Máscara contra partículas? 
Luvas descartáveis? 
Pipetadores manuais e/ou automáticos? 
Óculos de proteção e outros? 
e
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança 
Segurança e saúde ocupacional 
 Existe serviço de saúde ocupacional? 
 Existe caixa com materiais para primeiros socorros? 
 Existem profissionais treinados em primeiros socorros? 
 Existem informações sobre como agir em caso de emergência, tais 
como: telefone de hospitais, pronto-socorros e bombeiros? 
 Existe um programa de vacinação atualizado? 
 Existe sinalização educativa para prevenir o risco? 
Equipamento de laboratório 
 Os equipamentos estão validados e certificados quanto a seu uso? 
 Existe procedimento de desinfecção de equipamentos antes de 
enviar-los à manutenção? 
 As cabines de segurança biológica e química são regularmente 
testadas? 
 As autoclaves estão validadas? 
 As centrífugas, rotores e frascos têm seus tempos de utilização 
devidamente anotados? 
 Vidrarias quebradas e trincadas são descartadas? 
 Existem recipientes adequados para descartar frascos quebrados e 
material perfurocortante? 
 As capelas de exaustão para manipulação estão devidamente 
sinalizadas? 
 Suas balanças estão certificadas pelo INMETRO? 
 Seus congeladores, geladeiras, fornos, estufas ou equipamentos 
termo-reguláveis possuem sinais de controle e registro de temperatura? 
f
Biossegurança PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
Material infeccioso, químico e radioativo 
 Os materiais biológicos são recebidos em condições de segurança? 
 Utilizam-se luvas descartáveis, quando se está manipulando material 
biológico? 
 As bancadas são desinfetadas com a devida freqüência? 
 Existe protocolo de descarte de material contaminado? 
 Os desinfetantes são apropriados e devidamente validados? 
 As substâncias estão devidamente etiquetadas? 
 Existe cartaz com os riscos e categorias toxicológicas das diversas 
substâncias? 
 O estoque de radioisótopos é devidamente controlado? 
 Existe procedimento de descarte de substâncias químicas e 
radioisótopos? 
 Existem procedimentos que visam a evitar contato entre substâncias 
químicas incompatíveis? 
Utilize este manual, junto com o vídeo, como fonte 
permanente de consulta. Mantenha este manual sempre ao 
seu alcance e faça dele um instrumento a mais de trabalho. 
Você tem comunicação direta e gratuita com o: 
TELELAB - PN-DST/AIDS – MS 
Telefax gratuito: 0800 - 61 – 2436 
g
PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
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aplicações. Rev. Bras. Pat. Clin. 25(2): 60-63, 1989. 
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TEIXEIRA, PEDRO & VALLE, SILVIO. Biossegurança - Uma abordagem 
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PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios
CURA, E. & WENDEL, S., 1994. Manual de Procedimentos de controle de 
Calidad para los laboratorios de Serologia de los Bancos de 
Sangre. Organización Panamericana de la Salud (OPS). 
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GRISHT, N.R., 1995. Manual de Segurança para Laboratório. Editora 
Santos, São Paulo, 133p. 
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COSTA, M.F., 1996. Segurança Química em Biotecnologia e Ambientes 
Hospitalares. Editora Santos, São Paulo, 99p. 
VALLE, S. 1996, Regulamentação da Biossegurança em Biotecnologia. 
Edição Curso de Biossegurança da FIOCRUZ, Rio de Janeiro, 80p. 
SIMONS, J. & SOTTY, P., 1991. Prévention el Laboratorie de Researche, 
Ëditions INSERM/CNRS/INRA/Institute Pasteur, Paris, 248p. 
Ministério da Saúde, 1994. Processamento de Artigos e superfícies em 
Estabelecimento de Saúde. 2ª edição, Brasília, 49p. 
Ministério da Saúde, 1995. Segurança no Ambiente Hospitalar. Brasília, 
196p. 
FLEMING, D.O. at al., 1995. Laboratory Safety: Principles and Practices, 
2nd. ed. American Society for Microbiology. Washington, DC, 406p. 
Diagnóstico sorológico do HIV – Testes confirmatórios PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde
Agradecimentos: Às equipes do: 
Instituto Nacional de Controle de 
Qualidade em Saúde – INCQS-FIOCRUZ; 
Instituto de Tecnologia em 
Imunobiológicos de BIO-Manguinhos- 
FIOCRUZ;
Laboratório Central de Saúde Pública 
Noel Nutels do Rio deJaneiro. LACNN – 
SES; e à Drª. Marisa Morgado 
Vídeo, projeto gráfico, arte final e impressão: 
	APRESENTAÇÃO
	INTRODUÇÃO
	fluxograma
	IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA PARA HIV-1
	material necessário para a reação de IFI
	estoque e conservação dos materiais
	titulação do conjugado
	realização da reação de IFI para para HIV-1
	leitura e interpretação de IFI para HIV-1
	WESTERN BLOT PARA HIV-1
	seqüência da reação de WB para HIV-1
	material necessário para a reação de WB
	realização da reação de WB para HIV-1
	leitura e interpretação da reação de WB para HIV-1
	amostras para investigação de HIV-2
	CONTROLE DE QUALIDADE
	importância do protocolo e controle de qualidade internos
	obtenção de soros-controle e programa de avaliação externa de qualidade
	FÓRMULAS
	ANEXOS
	BIOSSEGURANÇA
	CONSIDERAÇÕES FINAIS
	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS