Proteína G12 na Invasão do Câncer de Próstata

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Um papel para as proteínas G heterotriméricas da família das G12 na Invasão do Câncer de Próstata
Grupo:
Gisely Borges
Julio Cesar
Lucas Dalsenter
Lucas Gavazzoni
Marcelly Ribeiro
Marcelo Amaral
Mariana Guimaraes
Objetivo do estudo
Examinar o papel da proteína G12 na sinalização do câncer de próstata.
Qual a relação entre a proteína G12 e a proliferação de células cancerosas?
Como isso acontece?
Importância
- O artigo mostra uma estimativa de que mais de 230.000 novos casos de câncer de próstata serão diagnosticados nos EUA no ano de sua publicação (2006).
- 234.460 casos foram diagnosticados nesse ano sendo 27.350 óbitos.
Desenvolvimento de estratégias para tratar pacientes com câncer de próstata avançado.
 Isso requer um melhor entendimento dos mecanismos moleculares de regulação da invasão das células do câncer de próstata.
Conclusões de estudos anteriores citados no artigo:
- Ativação da PAR-1 aumenta a resistência das células ao estímulo apoptótico, estimula a expressão de fatores angiogênicos e promove a invasão das células do câncer de próstata.
- Câncer de mama: a proteína G12 promove a metástase através do estímulo da invasão das células cancerosas e não do crescimento das células.
Receptores Acoplados a Proteína G (GPCRs)
Controlam processos fisiológicos e fisiopatológicos
GPCRs para tromboxano, bradicinina, ácido lipofosfatídico e SDF-1 implicam na invasão das células cancerosas.
As vias pelas quais os GPCRs afetam as células cancerosas não são completamente entendidas.
Proteína G
Envolvida da transdução de sinais celulares
Heterotrímero formado pelas subunidades α, β e γ
Os tipos de proteína G tratados no artigo são: Gα12 e Gα13
Procedimentos Experimentais
1. Anticorpos e Reagentes
 Anticorpos para RhoA e G
 Peptídeo de bloqueio para G
 Anti-soro policlonal para RGS2
 Trombina humana recombinante
2. Linhagens Celulares
 PC3, DU145 e LNCaP
 PrEC (Células epiteliais da próstata)
3. Infecções por Adenovírus
- Rho cinase de adenovírus negativa dominante
- Outros adenovírus recombinantes construídos através da subclonagem humana de Gq(Q209L), G12(Q231L), G13(Q226L) e HA-RGS2
- DNA resultante transfectado para células HEK 293
Os vírus foram amplificados e purificados
Eficiência de infecção das células: entre 80% e 100%. Baseado na expressão de GFP.
4. Produção de Retrovírus
Retrovírus recombinantes construídos a partir da subclonagem de G12(Q231L), G13(Q226L) e HA-RGS2.
Esses vírus foram transferidos para GP2-293 (linhagem de células de empacotamento retroviral baseado HEK-293)
Recolhimento dos sobrenadantes virais, filtração e ultracentrifugação.
O concentrado de vírus foram utilizados para infectar as células.
5. Ensaio de Invasão Celular
Filtros da câmara transwell foram recobertos com GFR (fator de crescimento reduzido)
Depois da infecção com adenovírus, as células foram colocadas em meio contendo 0,1% de albumina de soro bovino
As células foram, então, colocadas na parte superior da câmara com ou sem agonistas
Uma parte das células foi tratada com toxina C3 e unidades hemolíticas de tetalosina e a outra parte com trombina ou U-46619 (análogo estável de endoperóxido de prostaglandina)
- As células da parte superior foram removidas com cotonete
As membranas foram coradas e as células foram contadas por meio de microscopia de contraste de fase
Foram selecionados 5 campos aleatórios para cada membrana
6. Preparação de Proteínas de Fusão GST
Glutationa S-transferase é uma enzima de função tradicionalmente associada a desintoxicação
Novos estudos sugerem que pelo menos um tipo atue na inibição de cinases e demonstram que as GSTs estão presentes em carcinomas de células basais
7. Imuno-histoquímica
As secções passaram por uma série de processos envolvendo inúmeras substâncias, entre elas anti-soro para G12
As amostras foram analisadas por meio de testes, como Dunn’s multiple comparison.
8. Miscelânia de Metódos
Níveis de Rho ativada foram determinados utilizando ensaios com uma fusão de GST
Bio-Rad Protein Assay
Western Blotting
Resultados
As proteínas G12 são altamente expressas em linhagens celulares de câncer de próstata invasivos e tumorígenos
Linhagens celulares de câncer de próstata DU145 E PC3, mais invasivas e tumorígenas, apresentam elevada expressão de Ga12 e Ga13, sugerindo associação entre a sinalização dessas proteínas e a característica dessas linhagens. 
A proteína Ga12 é altamente expressa em adenocarcinoma de próstata
Adenocarcinoma:
O adenocarcinoma é um tumor maligno, que deriva de células glandulares epiteliais secretoras, sendo normalmente de alta agressividade.
O adenocarcinoma de próstata é uma das neoplasias malignas mais frequentes em homens, de forma que em termos de mortalidade, corresponde à segunda neoplasia mais importante, comprometendo as regiões posterior e lateral da zona periférica da próstata.
A proteína Ga12 é altamente expressa em adenocarcinoma de próstata
Análises por imunohistoquímica demonstram maior expressão de Ga12 em células cancerígenas, em relação à células epiteliais não cancerígenas no mesmo tecido.
Para se verificar a especificidade da Ga12, uma análise em relação à expressão de Gaq não revelou alterações de expressão, entre os dois tipos celulares.
A sinalização pela proteína Ga12 não promove crescimento de células cancerígenas ou formação de tumores
Experimentos demonstraram que:
.Expressão In Vitro de Ga12 e Ga13 variantes não afetaram o crescimento de células cancerígenas;
. A inibição da sinalização de G12, pela expressão do domínio RGS, não afetou o crescimento celular no câncer de próstata;
.Não se verificou qualquer efeito sobre a geração de tumores com a adição de Ga12 variante ou inibição de sua sinalização.
Logo, os resultados demonstraram que Ga12 interfere em crescimento de células cancerígenas ou formação de tumores.
Sinalização de G₁₂ promove a invasão de células do câncer de próstata 
A expressão da forma ativa das proteínas G₁₂ e G₁₃ nas linhagens de células PC3 e DU145 aumenta a capacidade de invasão destas células, por migração, uma barreira reconstituída de matriz Matrigel revestindo uma câmara transwell. 
A expressão da forma ativa da proteína Gαq não promoveu a invasão de células cancerosas em nenhuma das duas linhagens (PC3 e DU145), mostrando que a capacidade de promover a invasão celular do câncer de próstata é específica da família de proteínas G₁₂.
 
 
 Linhagens de células PC3 	 Linhagens de células DU145
Sinalização de G₁₂ promove a invasão de células do câncer de próstata através de uma via dependente de Rho 
A expressão da forma ativa de Gα₁₂ induz um aumento significativo dos níveis das proteínas RhoA tanto nas linhagens de células PC3, quanto nas DU145. Por outro lado, a expressão da forma ativa de Gαq induziu pouco ou não induziu os níveis de RhoA. Assim, conclui-se que as proteínas G₁₂ são capazes de estimular a atividade das proteínas Rho nas células de câncer de próstata. 
 
 Linhagens de células PC3 	 	 Linhagens de células DU145
Tratou-se as linhagens de células PC3 e DU145 com a toxina C3 – um inibidor específico das proteínas Rho GTPases –, o que provocou um bloqueio da invasão de células cancerosas induzida pela proteína G₁₂. 
Fez-se outro tratamento, dessas mesmas linhagens de células, com o inibidor da Rho quinase denominado Y29632. Observou-se, também, uma significativa redução do efeito da proteína G₁₂ na invasão das células do câncer.
A expressão da forma Rho quinase DN-ROK nas linhagens também bloqueou a ação da proteína G₁₂ na invasão das células, nesse caso, em torno de 50%.
 Linhagens de células PC3 Linhagens de células DU145
A inativação induzida pelo G12 de E-caderina não é suficiente para promover a invasão de
células do câncer de próstata
Foram realizados testes com o mutante 244-249 de G12. Uma forma mutante de G12 que não se liga a família de RhoGEFs descrito acima, mas retém a capacidade de interagir com a cauda citoplasmática de E-caderina.
No teste, células DU145 mutantes e selvagens para a proteína G12 foram tripsinizadas em na presença de 10 mM de Ca2 para manter a integridade da caderina. O ensaio foi dissociado e deixou-se agregar durante 1 h na presença 1 mM de Ca2. Tamanho e número de agregados foram, então, medidos em função da caderina. 
A inclusão do Ca2 EGTA quelante no ensaio de formação de agregado foi completamente interrompido, confirmando que as interações célula-célula foram observados mediante caderinas.
Ainda, a tanto a expressão de G12 quanto G12(244-249) diminuiu significativamente a capacidade das células DU145 de se agregar, sugerindo que a sinalização de G12 é capaz de inativar a E-caderina nesta linha celular. Finalmente, constatou- se que a inativação induzida pelo G12 de E-caderina foi capaz de promover a invasão celular DU145 de ativação independente de Rho.
Notou-se que apenas a inativação de E-caderinas não é o suficiente para promover a invasão desse tipo de célula. Estudos têm demonstrado que a sinalização dos GPCRs (receptores acloplados a proteína G que alteram a função celular, principalmente por meio da ativação das formas heterotrimérica Gs, Gi, Gq e G12) através de fatores, tais como a trombina, tromboxano A2, bradicinina, e ácido lisofosfatídico e, assim, promovem invasão de células de cancro da próstata e metástases.
Sinalização de G12 estimulada por GPCRs é necessária para a invasão de células cancerosas da próstata. 
Decidiu-se determinar se a sinalização G12 via Rho está envolvido na invasão pela promoção da atividade destes GPCRs:
Transdução com adenovírus;
18 horas de jejum;
Lise das células;
Pull-down de ensaio (fusão GST dodomínio de ligação a Rho-A de rhotekin ativado);
Análise Rhoa-A de imunitransferência;
Níveis de RhoA total G12, L13, e GQ também foram determinados como controle.
*Para PC3, nas experiências com toxinas, as células foram tratadas com a toxina recombinante durante 1 h antes da colheita. Para as experiências com Y29632, inibidor (50M) foi adicionado no momento do plaqueamento para ambas as cavidades superiores e inferiores do aparelho Transwell. As experiências foram realizadas em várias vezes, e os resultados são apresentados.
A Expressão do G12QL induz PC3 (C) e células DU145 (D) na invasão através de uma via de Rho-dependentes. 
 A expressão da P115-RGS não teve efeito sobre a trombina induzida por Ca2 fundente, enquanto que a expressão de RGS2 significativamente diminuída induzida por trombina Ca2 em fluxo. Este mutante dos P115-RGS não se liga a funções como uma proteína de ativação de GTPase para as proteínas G12 e, assim, não afeta sinalização de G12 . Como mostrado, a expressão desta proteína não influenciou a ativação de RhoA, indicando que a indução por trombina inibidora efeitos de P115-RGS são o resultado da sua capacidade para se ligarem a e inativar as proteínas G12.
O tratamento do PC3 (A) ou as DU145 (B), com linhas de células com trombina resultou num aumento significativo no nível de RhoA ativada. Quando sinalização de G12 foi inibida usando o p115-RGS, esta ativação foi bloqueada. Uma vez que o receptor de trombina, PAR-1, também é conhecida por acoplar à família de Gq heterotrimérica, as proteínas G inibiram a sinalização Gq utilizando RGS2 como controle. A inibição da GQ com RGS2 não afetou Ativação RhoA que induz a formação da trombina (fig. A e B).
Discussão
A proteínas G12 são reguladas positivamente durante a carcinogênese da próstata. Possuem, por sua vez, um papel fundamental na progressão desse tipo de câncer.
 
No câncer de próstata, há o aumento da expressão de Ga12 e de Ga13 paralelamente ao aumento de expressão das RhoGTPases e de vários GPCRs.
Papel da sinalização G12 na migração de células têm-se centrado na capacidade de Ga12 e Ga13 para estimular Rho. Além disso, uma série de relatórios anteriores demonstraram que o aumento da atividade de RhoA / C pode promover a invasão de próstata e outros tipos de câncer.
Ga12 e Ga13 são capazes de inativar E-caderina e promover migração de celular. Curiosamente a inativação, induzida por G12, de E-caderina não foi suficiente para promover a invasão da linhagem celular DU145. 
A partir de um perspectiva clínica, os estudos sugerem que a inibição alvo da sinalização por G12 pode proporcionar terapias eficazes para retardar a invasão e reduzir a morbidade e mortalidade associadas com estes e possivelmente outros cânceres.
Bibliografia
POZZOBON, HELIO JORGE. "Perfil epidemiológico e fatores prognósticos no tratamento cirúrgico do adenocarcinoma de próstata clinicamente localizado." Rev. Col. Bras. Cir 36.4 (2009): 327-331.
Cambruzzi, Eduardo, et al. "Relação entre escore de Gleason e fatores prognósticos no adenocarcinoma acinar de próstata." J Bras Patol Med Lab 46.1 (2010): 61-68.
​
KAMOTO, T. et al. Association of a genetic polymorphism of the E-cadherin gene with prostate cancer in a japonese population. Japanese Journal of Clinical Oncology, v. 35, n. 3, p. 158-161, 2005. ​
​
POOKOT D, Li L-C, Tabatabai ZL. et al. The E-cadherin – 160 C/A polymorphism and prostate câncer risk in White and Black american men. The Journal of Orology, v.176, p. 793-796, agosto. 2006.