Aula 09

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GENÉTICA
Prof. William Volino
Aula 9: Diagnóstico Molecular
GENÉTICA
Aula 9: Diagnóstico Molecular
Conteúdo programático
Definição de diagnóstico molecular
A técnica de PCR, suas etapas e aplicações da PCR
As análises utilizando enzimas de restrição
As técnicas de eletroforese de DNA
Relação das técnicas moleculares com sua utilização para o diagnóstico
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Aula 9: Diagnóstico Molecular
Introdução
	Qual a importância do Diagnóstico Molecular?
		Vamos assistir ao vídeo que se encontra no Conteúdo On line para responder!
	http://www.biosphera.com.br/hpv-cancer-de-colo-de-utero.asp
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Conceito:
	Utilização de técnicas moleculares para o diagnóstico de doenças, genéticas ou não genéticas.
	Nos dois casos será possível fazer o diagnóstico das doenças antes que se manifestem e fornecer informações importantes para a escolha do melhor tratamento e estabelecimento do prognóstico.
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Em doenças genéticas tem como objetivo:
	- Detectar mutações em genes;
	- Caracterizar mutações;
	- Estudar a ocorrência e frequência de mutações em determinadas populações;
	- Estudar características específicas do gene em questão;
	- Estudar o tipo de mutação (mutação pontual, grandes deleções, inserções, etc.), entre outras.
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Em doenças não genéticas tem como objetivo:
	- Diagnosticar doenças infecciosas;
	- Identificar o agente infeccioso (vírus, bactérias, protozoários, fungos) através da detecção do seu material genético;
	- Estudar o agente infeccioso em questão;
	- Avaliar a resposta ao tratamento.
	
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As técnicas moleculares incluem:
• Amplificação enzimática do DNA (PCR)
 
• Digestão da fita de DNA genômico ou produto de PCR com enzimas de restrição
 
• Separação eletroforética do DNA ou do produto de PCR
• Hibridação do DNA ou fragmentos de PCR com sondas oligonucleotídicas.
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Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
	Consiste na replicação do DNA in vitro.
	É uma técnica que revolucionou a genética molecular, permitindo muitos avanços na área, como a clonagem, a produção de alimentos transgênicos, e etc.
	É considerada uma técnica altamente sensível, por ser capaz de detectar e amplificar DNA a partir de uma pequena quantidade na amostra.
	Além disso, é altamente específica, pois é capaz de detectar sequencias específicas de DNA, que sejam o alvo do estudo.
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	Aplicações da PCR
Diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas;
Amplificação de genes para posterior clonagem e estudos de sua expressão; 
Determinação de variabilidade genética e identificação; 
Detecção de OGMs 
Sexagem e diagnóstico de doenças em embriões. 
	
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Preparo da reação de PCR
DNA polimerase (Taq - Thermus aquaticus)
Primers ou iniciadores
Nucleotídeos (A, T, G e C)
Tampão de pH
DNA (ou RNA)
Mg++	
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	A reação é feita por termocicladores, máquinas que realizam vários ciclos térmicos de acordo com a programação.
	
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A reação ocorre em três fases (ciclo)
Desnaturação – as duas fitas do DNA são separadas pela alta temperatura.
Anelamento – os primers se ligam à sequencia alvo, marcando o seu início e o seu fim.
Extensão – A Taq polimerase produz o novo DNA, complementar à sequencia alvo.
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 	A análise é feita por eletroforese, que separa os fragmentos de DNA em um gel de acordo com o seu tamanho.
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 	O gel é analisado num transiluminador UV e fotografado.
	O DNA amplificado emite fluorescência.
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 	Anemia falciforme
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 	Infecção pelo HPV
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Análise com enzimas de restrição e sondas de DNA
	
	
	
	As enzimas de restrição e as sondas de DNA também podem ser utilizadas na realização do diagnóstico molecular, pois permite que o DNA seja analisado de diferentes formas.
	Este tipo de diagnóstico pode ser empregado em estudos de identificação humana e criminalística. 
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	Enzimas de restrição
	
	
	
	São enzimas encontradas em bactérias, utilizadas para realizar cortes no DNA. 
	Cada enzima de restrição corta o material genético em um sítio específico, que são palíndromos. 
 
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	Os fragmentos gerados pelas enzimas de restrição são separados através de uma eletroforese em gel.
	A análise destes fragmentos se chama RFLP (Polimorfismo dos fragmentos gerados por enzimas de restrição). 
	Existe um padrão de tamanho dos vários fragmentos gerados, que depende da existência dos sítios de corte no genoma do indivíduo.
	
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	Após a corrida o DNA é transferido para uma membrana para posterior hibridização com sondas de DNA.
	Para identificação dos fragmentos são utilizadas sondas de DNA.
	A sonda consiste em um segmento de DNA produzido em laboratório que é complementar à sequencia alvo de DNA, que se liga (hibridiza) ao DNA e permite a sua identificação.
	
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	Teste de paternidade: 
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 	Teste de identificação de criminoso: 
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	“Impressão digital” de DNA: 
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	Nesta aula vimos:
Definição de diagnóstico molecular
A técnica de PCR, suas etapas e aplicações da PCR
As análises utilizando enzimas de restrição
As técnicas de eletroforese de DNA
Relação das técnicas moleculares com sua utilização para o diagnóstico