6 - Caracteristicas de Fitobacterias

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
FACULDADE DE AGRONOMIA "ELISEU MACIEL"
DEPARTAMENTO DE FITOSSANIDADE
DISCIPLINA DE FITOPATOLOGIA
BACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS
 1
 Ronei de Almeida Douglas
1. INTRODUÇÃO
Pesquisadores do passado, não admitiam a possibilidade de bactérias agirem como fitopatógenos, e sim como uma contaminação natural ou um desenvolvimento "post mortem".
Segundo De Bary a baixa temperatura dos vegetais, as reações ácidas de seus sucos, era considerada como fatores que impediam a vida bacteriana.
A frequência, porém das bactérias nos tecidos dos vegetais, levou os investigadores à suspeita de que as mesmas os habitassem normalmente. No entanto, diversos trabalhos provaram que, os tecidos normais das plantas, estavam isentos de bactérias.
Diversos ensaios posteriores, provaram que o julgamento impedinte, 
não era verdadeiro, e que certas bactérias inoculadas em plantas, podiam
desenvolver-se perfeitamente.
Segundo Heald, o aparecimento e isolamento das primeiras bactérias fitopatogênicas, deu-se quase simultaneamente nos Estados Unidos, França e Holanda.
Cronologicamente, a primeira bactéria fitopatogênica, foi descoberta por J. Burril em 1878. Burril observando a doença denominada "Fire Blight" que 
causa sérios prejuízos em plantações de pereiras e macieiras, principalmente, descobriu e provou ser a mesma causada por uma bactéria, que denominou Micrococcus amylovorus e que presentemente denomina-se Erwinia amylovora (Burril) Wilson et al. 
Em 1879, segundo Delacroix e Maublanc, Prillieux, isola uma bactéria de uma cultivar de trigo (Micrococcus tritici) e na Holanda Wakker em 1883, descobre que a clorose dos jacintos era devido a uma bactéria que denominou Bacterium hyacinthii e que corresponde atualmente a Xanthomonas hyacinthi (Wakker) Dye.
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1
 Professor Adjunto, Mestre em Fitopatologia. Depto. de Fitossanidade - FAEM-UFPel. 
Após estes eventos, grande é o incremento que toma a bacteriologia vegetal, e pesquisadores de diversas nacionalidades como L. Savastano na Itália (1886), Van Hall (1892) na Holanda, E. F. Smith e Pierce (1893) nos Estados Unidos e Apple (1903) na Alemanha dedicaram-se devotadamente à pesquisa das bactérias fitopatogênicas. 
 A Erwin F. Smith, cabe a gloria de ser considerado o fundador da bacteriologia vegetal, funcionário do Federal Department of Agriculture dos Estados Unidos , devotou toda a sua vida ao estudo das bactérias fitopatogênicas. 
No início do século XX já era grande o número de trabalhos científicos comprovando serem as bactérias importantes patógenos de plantas.
Os trabalhos de F. M. Draenert, na Bahia, com uma doença bacteriana da cana-de-açúcar e o de Gregorio Bondar, sobre a ocorrência da bacteriose da mandioca, são citados como pioneiros em nosso país. 
Tecnicamente, há que se reconhecer que fazer pesquisa com bactérias é tarefa mais difícil que com outros microrganismos fitopatogênicos. Bactérias são microrganismos diminutos, apenas visualizáveis ao microscópio comum, sem ser possível usar critérios morfológicos consistentes, como rotina para identificação e taxonomia, além de serem altamente mutáveis e carregarem consigo alto grau de diversidade fisiológica. Do profissional interessado em 
trabalhar com fitobactérias espera-se uma sólida base em microbiologia, bioquímica, genética de microrganismos, biologia e fisiologia celular, ecologia microbiana, etc. Além disso, a pesquisa com fitobactérias pressupõe a disponibilidade contínua e quase ilimitada de equipamentos e reagentes caros e sofisticados. Apesar de tudo isso, a bacteriologia de plantas no Brasil tem evoluído, porém, ainda ressente de recursos humanos.
2. IMPORTÂNCIA ECONÔMICA DAS FITOBACTERIOSES
Bactérias constituem-se em importantes patógenos de plantas não só pela gravidade com que atacam culturas de valor econômico bem como pela facilidade com que se disseminam e pelas dificuldades encontradas para o controle das doenças por elas incitadas. Em regiões de clima favorável a ocorrência de fitobacterioses pode vir a condicionar a exploração econômica de certas culturas.
No Brasil praticamente inexistem dados que ilustrem a magnitude dos prejuízos econômicos causados por bactérias fitopatogênicas.
3. CONCEITO
Bactérias são seres unicelulares procariotos, baciliformes, de pequeno tamanho sendo que a maioria mede ao redor de 0.5 a 1.0 ( por 2.0 a 5.0 (, possuem parede celular, crescem em meios artificiais de cultura, não contém clorofila e que se multiplicam por fissão binária transversa ou cissiparidade.
4. À CÉLULA BACTÉRIANA
 
A célula procariótica (Fig. 1), constitui a unidade estrutural das bactérias. Uma célula bacteriana completa possui os seguintes elementos: núcleo, citoplasma, plasmídeo, membrana citoplasmatica, mesossomo, parede celular, cápsula, pílis ou fímbrias e flagelo (s). 
Fig. 1. Esquema de uma célula bacteriana típica mostrando seus componentes
O NÚCLEO nunca é separado do citoplasma por membrana nuclear. Devido ao pequeno tamanho da maioria das células procarióticas, essa característica fundamental de distinção não pode ser estabelecida a microscopia de 
uso comum, mas é evidente em microfotografia eletrônica de secções ultrafinas. O genoma bacteriano consiste de um fio extremamente longo (cerca de 1 mm de extensão) de DNA, circular, e fechado sobre si mesmo.
O CITOPLASMA é constituído pela justaposição de grânulos minúsculos de ácido ribonúcleico (RNA). Encontram-se ainda, no seio do citoplasma, elementos como ribossomos (responsáveis pela síntese de proteínas), genoma, plasmídeo e, certos tipos de inclusões (amido, glicogênio, carboidratos, etc.). Possui, ainda, afinidade por vários corantes. 
A MEMBRANA CITOPLASMÁTICA aderente à parede celular, separando-a do citoplasma, esta a membrana citoplasmática. Que é uma membrana semipermeável, seletiva, preside às trocas nutritivas entre a bactéria e o meio – Fenômeno conhecido genericamente como “transporte” – Muitas proteínas estão presentes na membrana, já que todos esses mecanismos reguladores de transporte são de alguma forma, mediados por moléculas protéicas. Em verdade, a membrana citoplasmática contém de 10 a 20% em peso total de toda a proteína da célula.
		O modelo da estrutura da membrana citoplasmática mais aceito é o de SINGER & NICHOLSON (1975). Em conformidade com este modelo (Fig. 2), a membrana citoplasmática seria formada por uma camada dupla de fosfolipídios, na qual se embeberiam proteínas estruturais envolvidas no transporte.
 Fig.2. Esquema da estrutura da membrana citoplasmática 
 de bactérias, conforme modelo de SINGER &
 NICHOLSON 
 
		A membrana sofre invaginações, ditas MESOSSOMOS, que substituem em parte os mitocôndrios ausentes na célula procariótica. Assim nos mesossomos estão localizados todos os complexos enzimáticos responsáveis pelas rotas bioquímicas de geração de ATP como respiração, ciclo de Krebs, etc.. 
A PAREDE CELULAR representa de 20 a 35% do peso seco da célula . Considera-se que o único composto macromolecular presente em todas as paredes das bactérias, seja o peptoglicano, responsável pela rigidez da parede. 
No tocante à composição química e permeabilidade da parede celular as bactérias, a grosso modo, podem ser classificadas em Gram positivas (parede celular com uma camada) e Gram negativas (parede celular constituída de pelo menos duas camadas).
Avanços recentes em citologia bacteriana e modernas técnicas de investigação têm demonstrado a existência de um espaço entre a parede celular e a membrana citoplasmática, denominado “espaço periplásmico”. Aparentemente, este espaçonão é vazio, mas preenchido com um gel – o gel periplásmico -, onde estariam às chamadas proteínas periplásmicas. 
Muitas bactérias apresentam envolvendo a parede celular a CÁPSULA. Nem todas as bactérias fitopatogênicas produzem uma cápsula detectável, e o tamanho dessa cápsula é influenciado pelo ambiente, principalmente o substrato onde a bactéria é cultivada. 
As bactérias produzem muitas substâncias capsulares químicamente diferentes, sendo a mais comum constituída de polissacarídeos, formados a partir de açúcares simples, aminoácidos ou misturas destas subunidades. 
Múltiplas funções tem sido atribuídas à cápsula, e a aderência parece ser a mais comum delas. Assim, a cápsula facilitaria a aderência da célula bacteriana a superfícies e a substratos.
KIRALY et al. (1970) consideram que a principal função biológica da cápsula é proteger a célula bacteriana contra condições adversas do meio ambiente, tais como dessecação, choques bruscos de temperatura, radiações, certos produtos químicos, alguns antibióticos, etc. Pode também sob certas 
condições ser usada como alimento de reserva, podendo ser redigerida pelo organismo quando outro alimento estiver em falta. 
Os PÍLIS ou FÍMBRIAS são formações mais curtas que os flagelos, demonstráveis tanto em bactérias móveis como imóveis. Geralmente há várias centenas de pílis em cada célula. São compostos inteiramente de proteínas, falando de um modo geral, os pílis são organelas de fixação (no processo de recombinação genética chamado conjugação).
As bactérias móveis são providas de organelas especiais de locomoção com 120 Angstrom de espessura e 4 ou 5 SYMBOL 109 \f "Symbol" de comprimento que são chamados de FLAGELOS. Análises de flagelos purificados mostram que eles contem apenas proteínas e, na verdade, apenas um único tipo de proteína, chamado flagelina.
Sob o ponto de vista fitopatológico, há interesse no estudo dos flagelos por múltiplas razões.
Primeiramente, sua presença e, ou, tipo de inserção (Fig. 3) possui importância na taxonomia. Como regra geral, espécies de Erwinia são geralmente peritríquias, de Xanthomonas monotríquias, de Pseudomonas lofotríquias e de Clavibacter atríquias. Isso é uma boa indicação quando se está identificando uma fitobactéria ou descrevendo uma nova doença, como critério auxiliar.
 Fig.3. Principais tipos de inserção de flagelos em fitobactérias.
Algumas bactérias fitopatogênicas podem possuir além do material genético um ou mais pequenos segmentos circulares de DNA denominados PLASMÍDEOS. Os plasmídeos diferem do material genético principal pelo tamanho (são menores), e pela essencialidade (não são essenciais) e pelo tipo de informação genética que carregam. Os plasmídeos podem eventualmente incorporarem-se ao material genético principal. Podem também serem transferidos, total ou parcialmente, de uma célula para outra, no processo de recombinação genética chamado de conjugação.
5. SISTEMÁTICA
Desde os primórdios da bacteriologia, o posicionamento das bactérias no mundo dos seres vivos revestiu-se de caráter polêmico. A sistemática das bactérias está muito longe de atingir a fase dos animais e das plantas superiores.
Esse fato se explica, em parte, pela circunstância de que a maioria dos bacteriologistas, mais interessa o estudo do comportamento das bactérias do que a sua classificação, sob o ponto de vista sistemático. Por outro lado, deve-se considerar uma série de dificuldades intrínsecas que embaraçam a distinção em bacteriologia e, consequentemente a taxonomia bacteriana.
Usualmente, ao se comentar sobre taxonomia de bactérias, toma-se como referência o manual do Bergey. Esse manual foi editado pela primeira vez em agosto de 1923. A elaboração do manual foi uma necessidade sentida de organizar e sistematizar, de forma lógica e em termos taxonômicos, os conhecimentos, os dados e as informações que vinham se acumulando desde o século XIX sobre as bactérias. Pela primeira vez editou-se de forma ordenada um compêndio em que as bactérias eram sistematizadas em classes, ordens, famílias, gêneros e espécies. O manual oferece subsídios para estudantes e profissionais da área no que tange á identificação de bactérias. Hoje, sua finalidade é básicamente a mesma, além de ser obra de referência de uso internacional, em virtude da riqueza de informações nele contido. Com o passar dos anos, o manual foi sendo reeditado, periodicamente e seu conteúdo atualizado em função dos novos conhecimentos que acumulavam-se ao longo dos anos sobre bactérias de modo geral.
		Quando surgiu a 8ª. Edição do Bergey, esta gerou um descontentamento profundo entre os fitopatologistas e bacteriologistas do mundo inteiro. Uma vez que o manual só considerou provas bioquímicas para separar as espécies, não considerou patogenicidade como critério, reduziu drasticamente o número de espécies no caso de Peudomonas e Xanthomonas e os membros do corpo editorial não eram fitopatologistas.
Esse impasse cientifico durou até 1978, quando um grupo internacional de bacteriologistas de plantas apresentou uma alternativa aceitável sem contradizer o manual do Bergey, para a sistemática bacteriana, que conciliou, dentro de certos limites, as disposições da oitava edição do manual do Bergey com a validade dos argumentos dos fitopatologistas. Essa proposição constitui-se essencialmente na criação do termo PATOVAR (PV).
Esse termo serve para diferenciar bactérias que não podem ser distinguidas por testes bioquímicos tradicionais, mas que possuem uma gama de hospedeiros distinta, isto é, variam quanto á patogenicidade. É um termo mais ou menos equivalente a "formae specialis" empregada na nomenclatura de fungos. Assim, segundo essa proposição, a bactéria causadora da bacteriose do maracujá passaria a chamar-se X. campestris pv. passiflorae. O têrmo patovar implica, pois que X. passiflorae passaria a pertencer a espécie X. campestris, não como sinonímia ou variante, mas como um patovar.
Desse modo, a espécie mais antiga do gênero conserva seu nome (X. campestris pv. campestris). As outras espécies que dela não podem ser distinguidas por testes bioquímicos rotineiros , mas que possuem uma gama de hospedeiros diferentes ou que diferem quanto a patogenicidade seriam consideradas patovares de X. campestris, por exemplo, X. campestris pv. passiflorae (ex X. passiflorae), X. campestris pv. fici (ex X. fici), X. campestris pv. sesami (ex X. sesami), etc...
A 9ª. Edição do manual aceitou a proposição do grupo internacional
de bacteriologistas e já passou a utilizar a subcategoria “Patovar” para as fitobactérias.
		Porem, a taxonomia de bactérias vem sofrendo mudanças radicais e rápidas em virtude da incorporação sistemática de métodos de caracterização molecular dos ácidos nucléicos para a classificação.
		Devido á rapidez com que estas mudanças vêm sendo operadas, por conseguinte, as bibliografias relativamente recentes sobre a classificação de bactérias fitopatogênicas estão se tornando obsoletas, a situação se caracteriza como de um verdadeiro período de transição, da era da classificação fenotípica para a de genética molecular.
		Diante desse quadro não existe ainda uma classificação oficial de bactérias. As decisões em incluir neste ou noutro grupo taxonômico vem sendo tomadas arbitrariamente e homologadas pela aceitação ampla da comunidade de microbiologistas.
		A lista e a nomenclatura, aqui adotada, são de nomes de bactérias fitopatogênicas aprovadas pelo Sub-Comitê de Taxonomia de Bactérias Fitopatogênicas da ISPP – International Society for Plant Pathology (Tabela 1).
6. FISIOLOGIA 
6.1. NUTRIÇÃO – a nutrição nada mais é que a detenção 
de energia, efetuada pela retirada do meio e incorporação ao citoplasma bacteriano das substâncias necessárias a sua manutenção. Sendo geralmente desprovidas de clorofila, não podem as bactérias captar a energia solar e 
transformá-la em energia química (fotossíntese).Necessitam, ao invés, de oxidar um substrato orgânico ou inorgânico e utilizar as calorias desprendidas de tais oxidações para seus processos sintéticos (quimiossíntese).
No que concerne ás fontes de C e N as bactérias fitopatogênicas com poucas exceções, são heterotróficas, isto é, obtém seus alimentos como parasitas de outros seres vivos, ou também como saprófitas alimentando-se de substâncias orgânicas mortas. Absorvem os nutrientes através das paredes celulares. Algumas poucas (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum e Xanthomonas axonopodis pv. begoniae) se comportam como microrganismos autotróficos, pois crescem em um meio basal de sais e cuja única fonte de carbono é aparentemente o anidro carbônico do ar.
6.2. RESPIRAÇÃO - as bactérias podem ser classificadas em dois grupos conforme o seu comportamento em relação ao oxigênio livre.
6.2.1. AERÓBICAS - as que só crescem em presença de oxigênio livre.
6.2.1. ANAERÓBICAS FACULTATIVAS - as que, embora cresçam, melhor em aerobiose, também o fazem em anaerobiose.
Essas bactérias devem seu comportamento ao "efeito Pasteur", segundo o qual a fermentação é inibida em presença de oxigênio livre e nestas condições bactérias que são capazes de crescer na presença, como na ausência de oxigênio livre, vegetam mais abundantemente em aerobiose pelo fato do metabolismo respiratório fornecer quantidades de energia consideravelmente maior que o metabolismo fermentativo.
6.3. TEMPERATURA o calor é um dos meios mais práticos e eficientes para a destruição de bactérias.
O efeito letal produzido pelo calor sobre as bactérias resultam de um processo de desnaturação e subsequente coagulação das proteínas citoplasmáticas e depende (além do pH, da idade da cultura, da concentração da suspensão bacteriana, da resistência própria da bactéria, etc.) de dois fatores seguintes: 
temperatura e tempo de exposição. Geralmente a 60SYMBOL 176 \f "Symbol"C durante 1/2 a 1 hora, morrem as bactérias não esporuladas. De um modo geral as bactérias fitopatogênicas têm um mínimo entre 5 a 10, um máximo entre 35 e 40 e um ótimo entre 25 e 30SYMBOL 176 \f "Symbol"C.
6.4. pH - as bactérias fitopatogênicas têm como preferência substratos alcalinos.
6.5. LUMINOSIDADE – as bactérias fitopatogênicas são indiferentes á luminosidade.
7. MODO DE PENETRAÇÃO
O processo de penetração na planta pela bactéria há que ser rápido, uma vez que bactérias fitopatogênicas não formam esporos e são sensíveis a dessecação, necessitando, na maioria das vezes, da existência de um filme de água para se locomoverem à procura de um local de penetração.
A capa externa das plantas está constituída por uma epiderme com uma cutícula mais ou menos espessa, segundo, os órgãos. As bactérias não podem atravessá-la diretamente, como fazem alguns fungos, pois não são capazes de romper mecânica ou enzimaticamente a cutícula ou a epiderme, criando sua própria porta de entrada. Portanto, para penetração necessitam aberturas naturais ou artificiais. Entre as primeiras podemos citar: estômatos, hidatódios, nectários, estigmas e lenticelas, e entre as segundas, os ferimentos (Fig. 4). 
ESTÔMATOS - estas aberturas naturais, que são abundantes nos órgãos verdes, constituem uma fácil porta de entrada. A forma de penetração é a seguinte uma bactéria chega, ajudada por uma película de água, no bordo de um estômato, sob condições ambientais adequadas, se reproduzem rapidamente, as novas bactérias resultantes, são arrastadas através do estômato aberto e chegam a câmara subestomática.
Continuam as divisões celulares e em um momento dado, toda essa massa bacteriana se introduz nos espaços intercelulares. O primeiro sintoma que se evidencia é a aparição de uma zona aquosa, transparente, ao redor do estômato. A ação posterior das bactérias, pode chegar a produzir necroses das células adjacentes, o que se manifesta pelo aparecimento de uma mancha bacteriana.
Algumas necessitam certas condições especiais quando inoculadas, apesar de penetrarem diretamente pelos estômatos. Assim, Pseudomonas syringae pv. tabaci requer um estado de saturação de água nos tecidos, enquanto Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum requer que a inoculação seja efetuada com certa pressão.
 
 Fig. 4. Penetração, colonização e expressão de sintomas
HIDATÓDIOS - estas estruturas se encontram agrupadas nos bordos de certas folhas, sobre todo o extremo das nervuras. Servem de entrada, dado que neles se acumulam líquidos provenientes de um retardamento na evaporação.
NECTÁRIOS - estes constituem uma excelente porta de entrada, pois estão formados por tecido granular não cutinizado e com abundantes substâncias açucaradas que resultam em meio de cultivo muito adequado.
LENTICELAS - as bactérias que penetram por esse meio, podem fazer também em geral, por feridas. Os casos mais conhecidos se referem a Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum, sobretudo quando esta ataca a batata.
ESTIGMAS - as bactérias chegam a eles ajudadas pelas chuvas; se reproduzem, invadem o estilete e chegam ao ovário, produzindo lesões nos frutos.
FERIDAS - podem ser de origem mecânica ou produzidas por insetos. Uma ferida mecânica rompe o tecido e a bactéria encontra então, no conteúdo protoplasmático, um excelente meio de cultura.
Algumas bactérias como Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas syringae pv. syrinage e Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, são exclusivamente parasitas de feridas.
8. LOCALIZAÇÃO E MULTIPLICAÇÃO NOS TECIDOS DOENTES
A localização e multiplicação, de fitobactérias, ocorre nos 
espaços intercelulares, como ocorre na maior parte das doenças parenquimatosas e intravascular, isto é, nos feixes vasculares (xilema ou floema), como o ocorre, nas doenças vasculares.
9. MECANISMOS DE PATOGÊNESE
Para que se manifeste a doença, após a penetração da bactéria, é necessário que entre esta e o hospedeiro, se estabeleça um complexo de inter-relação. Em tal efeito a bactéria elabora vários compostos.
Os produtos bacterianos, causadores de doenças nas plantas podem ser: toxinas, fatores de induzem hipertrofias e enzimas.
TOXINAS – podem ser consideradas como sendo substâncias produzidas pelo patógeno ou advindas de consequências da interação patógeno-hospedeiro, substâncias estas capazes de causar alterações mórbidas na planta, quer de natureza fisiológica, metabólica ou estrutural. 
FATÔRES QUE INDUZEM HIPERTROFIAS - nas doenças hiperplásticas tem-se demonstrado que as bactérias causais são capazes de sintetizar ácido-indol-acético o que contribui (embora não seja a única causa) para que as células normais do hospedeiro, se transformem em outras tumoríferas. O patógeno sintetiza, além disso, um princípio indutor do tumor, cuja natureza se desconhece ainda e que estimula a divisão anárquica e sem controle (hiperplasia e ou hipertrofia) dessas células.
ENZIMAS – O estudo da ação das enzimas em bactérias fitopatogênicas iniciou com os trabalhos clássicos de Jones (1909), que estabeleceu conceitos básicos sobre a causa de destruição dos tecidos, na podridão mole das hortaliças (P. carotovorum subsp. carotovorum). Seus trabalhos foram os primeiros que associaram a atividade enzimática com a patogenicidade dos microrganismos. Foi comprovado que as fitobactérias podem produzir as seguintes enzimas:
ENZIMAS PÉCTICAS – a parede celular e a laméla média das células dos tecidos vegetais, estão constituídas por protopectina, pectina e ácido péctico. As enzimas pécticas atuam sobre a cadeia de ácido péctico e dos pectatos 
correspondentes. Estas enzimas são, portanto, as responsáveis pela degradação das substâncias pécticas tissulares e a causa da desintegração dos tecidos em algumas doenças bacterianas. 
ENZIMAS CELULOLÍTICAS – A celulose é o componente principal e a base estrutural da parede celular das plantas superiores. Suas largas cadeias lineares podem ser hidrolisadaspor enzimas bacterianas, até chegar a glicose.
ENZIMAS PROTEOLÍTICAS – as proteínas do conteúdo celular são hidrolisadas deixando como resíduos aminoácidos.
ENZIMAS AMILOLÍTICAS – o amido das células vegetais está constituído por amilosa e amilopectina; sua hidrólise é produzida pelas amilases. O resultado final do processo é a glicose.
10. SINTOMAS
Os sintomas incitados em plantas por bactérias fitopatogênicas podem, em muitos casos, ser confundidos com aqueles causados por outros fitopatógenos como fungos, nematóides, vírus, etc.. Contudo a exsudação de pús bacteriano e o congestionamento de água nos estágios iniciais da infecção são bastante comuns nas bacterioses de plantas.
A sintomatologia exibida pela planta infectada reveste-se de grande importância para o fito bacteriologista. São os sintomas que vai uma vez confirmada a natureza bacteriana da doença, fornecer os primeiros subsídios para a diagnose. Assim a constatação de tumores (hipertrofia) sugere a infecção por espécies de Agrobacterium sp., murchas vasculares podem indicar infecções por Pseudomonas sp., ao passo que podridões moles sempre evidenciam espécies de Pectobacterium sp., por exemplo. É conveniente notar, contudo, que um mesmo tipo de sintoma pode ser causado por diferentes espécies ao passo que uma mesma espécie pode causar diferentes tipos de sintomas na mesma planta.
As bactérias fitopatogênicas podem causar os seguintes tipos de sintomas:
LESÃO LOCAL - neste tipo de sintoma enquadram-se as manchas, necroses, queimas, etc., podem ocorrer tanto em folhas como em caules, frutos, órgãos de reserva, etc.. Geralmente a lesão local é uma conseqüência da colonização, pela bactéria, dos espaços intercelulares.
Lesões locais em folhas são às vezes designadas por nomes empíricos associados ao aspecto da lesão. Assim, manchas angulares designam lesões com o formato de um polígono irregular de muitos vértices quando a expansão da lesão é parcialmente limitada pelas nervuras do limbo foliar. Como exemplo de bactéria que causa este tipo de sintoma temos Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum. Quando um halo clorótico circunda a lesão foliar, esta lesão é chamada mancha aureolada ou mancha em halo. Esse halo clorótico é atribuído á produção, pela bactéria, de toxinas. Essas toxinas, ao se difundirem para a periferia da lesão, inibiriam a síntese de clorofila ou ativariam clorofilases (enzimas que degradam clorofila). Exemplo Pseudomonas syringae pv. garcae em folhas de cafeeiro. No sintoma de mancha zonada, a lesão, grosseiramente circular, tem o aspecto de círculos concêntricos. Aparentemente, isso é reflexo ou conseqüência do embate entre os mecanismos de ataque do patógeno e os mecanismos de defesa da planta, com vantagem para os primeiros. A bactéria penetra em algum ponto do limbo e inicia a colonização; como resposta, a planta sintetiza um anel de tecido corticoso, numa tentativa de restringir o patógeno e a expansão da lesão. O tecido corticoso, um mecanismo ativo de defesa de plantas contra patógenos, é uma barreira histológica mais difícil de ser ultrapassada que os tecidos vegetais normais. A bactéria consegue ultrapassar esta barreira de tecido corticoso, e a planta sintetiza outra, assim sucessivamente, resultando numa lesão formada de vários círculos concêntricos. É o caso de Pseudomonas syringae pv. tabaci em folhas de fumo. 
PODRIDÃO MOLE - esse tipo de sintoma, usualmente causado por espécies de Pectobacterium é mais comum em órgãos de reserva podendo, entretanto, ocorrer em outros órgãos. O tecido exibindo este tipo de sintoma apresenta-se flácido e desprende odor desagradável.
As células no tecido vegetal acham-se unidas uma ás outras pela laméla média, cujo componente principal são as substâncias pécticas.
Bactérias causadoras de podridões moles geralmente produzem enzimas pectinolíticas (que degradam pectinas) como poligalaturonase, pectinometilesterazes), etc.. Essas enzimas, ao atacarem as substâncias pécticas presentes na laméla média, fariam com que o tecido vegetal perdesse a rigidez, tornando-se flácido - daí o amolecimento. O odor desagradável advêm tanto de processos fermentativos induzidos por enzimas da própria bactéria como da invasão secundária por outros organismos saprófitas.
MURCHAS - este é o típico sintoma incitado por bactérias que preferencialmente colonizam o sistema vascular do hospedeiro. A consequência, no caso, é sempre a murcha. A murcha evidência estar ocorrendo na planta infectada um desbalanço hídrico ou porque a planta está a perder mais água que pode absorver ou porque o transporte de água do sistema radicular para a parte aérea está sendo de alguma forma perturbado ou prejudicado. Existem incontáveis teorias procurando explicar porque a planta murcha como consequência da infecção sistêmica, todas elas apresentando prós e contras.
Para alguns autores toxinas produzidas pelo patógeno acelerariam a transpiração por seus efeitos sobre os hábitos de abertura dos estômatos causando uma perda excessiva de água. Outros pesquisadores atribuem a murcha ocorrência de obstrução dos vasos condutores como consequência de infecção. Assim células bacterianas, aumentando em número no interior dos vasos, poderiam ocasionar uma obstrução mecânica desses vasos dificultando o transporte. Outra possibilidade seria a reação de substâncias produzidas pela 
bactéria como substâncias produzidas pela planta, formando complexos polímeros de alto peso molecular que contribuiriam para dificultar o transporte. Outra explicação reside no fato de que muitas plantas, como resposta à infecção, produzem gomas e tiloses numa tentativa de, reduzindo a velocidade de transporte, dificultar a disseminação de propágulos do patógeno em seu sistema vascular.
Possivelmente o desbalanço hídrico que chamamos murcha têm como causa não um mas inúmeros fatores atuando concomitantemente.
HIPERTROFIA - este tipo de sintoma denominado galha, galha em coroa, tumor, proliferação de tecido, etc., é incitado por espécies de Agrobacterium em um grande número de plantas hospedeiras. A formação de galha é mais comum no colo da planta embora possa ocorrer em outros órgãos.
A planta doente, normalmente mostra-se raquítica pois grande parte dos nutrientes é direcionada para o tumor.
Nos tumores, às células multiplicam-se desordenadamente. As causas desta proliferação anormal, permanecem ainda obscuros.
CANCRO - caracteriza-se por ser uma lesão com bordos elevados e centro deprimido. Embora o cancro seja mais comum em órgãos lenhosos, eles podem ocorrer também em folhas (ex: cancro cítrico) e, em frutos (exemplos cancro cítrico e cancro do tomateiro). No cancro a bactéria invade sistemicamente a planta e passa a se multiplicar nos feixes vasculares. Com o progresso da doença, a colonização se estende para o tecido parenquimatoso circunvizinho. Profundas alterações histológicas se sucedem, o parênquima é empurrado para fora, rachando o caule e expondo o cancro.
MORTE DOS PONTEIROS - também conhecido como morte das pontas ou "die back", este tipo de sintoma ocorre principalmente em galhos em brotação novas. Como o próprio nome está dizendo consiste na morte progressiva 
da ponta para a base dos ramos de árvores e arbustos. Exemplos Xanthomonas axonopodis pv. manihotis em mandioca e Erwinia psidii em goiabeira. 
GOMOSE - é a produção mórbida de goma, ou de líquidos de aspecto gomoso, proveniente das alterações da seiva ou da desintegração celular.
FASCIAÇÃO - consiste no achatamento de órgãos normalmente cilíndricos. As causas desse fenômeno permanecem ainda obscuros.
11. DISSEMINAÇÃO
O conhecimento dos fatos básicos atinentes às maneiras pelas quais as bacterioses de plantas se disseminam em condições de campo assume grande importância tanto para a recomendação de medidas de controle como para eventual prevenção de epidemias. Células viáveis e infectivas do patógeno em quantidades suficientes para causar infecção - disseminam-se graças a agentes que podemser tanto bióticos como abióticos. Os agentes bióticos seriam principalmente homem, insetos, animais, nematóides, etc., como agentes abióticos podem ser considerados os fatores climáticos, como: chuva, vento, enxurradas, etc. 
	PLANTA INFECTADA
↓
	AGENTES DE DISSEMINAÇÃO
↓
	PLANTA SADIA
Para efeito didático, a disseminação de fitobacterioses pode ser comentada segundo dois aspectos: disseminação a curta e longa distância.
DISSEMINAÇÃO A LONGA DISTÂNCIA
A disseminação a longa distância, de uma plantação para outra, de uma região para outra ou mesmo de um continente para outro ocorre, principalmente, pelo transporte de órgãos vegetais infectados como, sementes, tubérculos, frutos, etc.
DISSEMINAÇÃO A CURTA DISTÂNCIA
Neste caso estar-se-ia considerando, principalmente, a disseminação de uma planta para outra dentro da cultura. Dentre os muitos agentes de disseminação, pode-se mencionar:
a) CHUVA E VENTO
Lesões foliares devidas a fitobacterioses, por exemplo, contem em sua superfície um número muito grande de células bacterianas. Durante uma chuva, este inóculo pode ser redistribuído pela planta, originando novas lesões. Além disso, uma gota de chuva incidindo sobre uma lesão, fragmenta-se em inúmeras gotículas. Cada gotícula em suspensão no ar pode carregar em suspensão um número grande de células bacterianas. O vento então encarregar-se-ia de transportar essas gotículas contendo o inóculo para a superfície de plantas vizinhas sadias que seriam então infectadas.
b) VETORES
Insetos podem visitar uma planta infectada e transportar nas patas células bacterianas em quantidade suficiente para inocular uma planta sadia. Surtos epidêmicos de murcha da bananeira ocorridos na América Central foram atribuídos à disseminação por insetos.
Nematóides podem, também, atuar como efetivos agentes de inoculação e disseminação.
O próprio homem, através de tratos culturais, é um eficiente disseminador de bacterioses de plantas. Operações de poda , por exemplo, disseminam com facilidade fitobacterioses se cuidados não são tomados.
12. SOBREVIVÊNCIA
Como qualquer ser vivo, bactérias fitopatogênicas possuem seus 
próprios mecanismos de sobrevivência, quer em associação com o hospedeiro ou não. Bactérias fitopatogênicas não formam esporos.
Consequentemente elas possuem uma capacidade de sobrevivência bem menor que certas espécies esporogênicas como Bacillus sp., que podem, em certos casos, resistir mesmo a fervura.
Leben considera mais eficiente, em termos biológicos, a sobrevivência de bactérias fitopatogênicas em associação com a planta que dela dissociada. Em conformidade com o autor, no interior dos tecidos do hospedeiro, por exemplo, a célula da fitobactéria encontra-se no que ele chama de posição protegida, ao abrigo da maioria dos fatores adversos do meio ambiente.
12.1. SOBREVIVÊNCIA EM RESTOS DE CULTURAS E SOLO
O solo precisa ser entendido como uma comunidade biológica complexa, onde co-habitam os mais diferentes microrganismos, tanto eucarióticos como procarióticos, todos eles competindo entre sí por nichos ecológicos, nutrientes, água e, não raro, produzindo, uns contra os outros substâncias com propriedades antimicrobianas, como antibióticos, bacteriocinas, etc.
Certas espécies fitopatogênicas podem sobreviver em restos de cultura por tempo suficiente para infectarem plantas sadias no próximo plantio. Contudo, pesquisas têm demonstrado que o período de sobrevivência em restos de cultura é drásticamente diminuido se processado ao enterrio desses restos. Aparentemente a curta sobrevivência das bactérias fitopatogênicas causadoras de doenças na parte aérea de plantas quando os restos culturais são enterrados se deve ao antagonismo microbiano. A flora microbiana do solo contem incontáveis tipos de microrganismos (fungos, bactérias, bacteriófagos, etc.) que exercem forte antagonismo em relação à população de fitobactérias presentes nos restos culturais que foram enterrados, embora algumas espécies tenham melhor capacidade de sobrevivência como Rastonia solanacearum, Pectobacterium sp. (do grupo carotovorum), etc.
12.2. SOBREVIVÊNCIA EM ÓRGÃOS VEGETAIS INFECTADOS
Órgãos vegetais infectados são, indiscutivelmente, não só 
os locais onde fitobactérias mais eficientemente sobrevivem, como a principal fonte de inóculo.
Tanto assim que FERREIRA, trabalhando com Pseudomonas syringae pv. syringae, tinha problemas de preservação com a patogenicidade de seus 
isolamentos, os quais, após sucessivas repicagens em meio de cultura, tendiam a perder a patogenicidade. A solução encontrada foi inoculá-los em folhas de soja e, após expressão dos sintomas, coletarem as folhas e herborizá-las. Sempre que necessitava de um isolamento, bastava reisolá-lo da folha dessecada. Isolamentos assim mantidos permaneceram viáveis por vários anos, numa demonstração cabal da eficiência da sobrevivência de uma bactéria fitopatogênica em órgãos vegetais infectados. A sobrevivência de bactérias fitopatogênicas em órgãos vegetais infectados é fenômeno complexo e parece ter grande dependência das condições climáticas. Por exemplo P. savastanoi pv. Glycibea sobreviveu com bastante eficiência de uma estação de plantio para outra em restos culturais infectados, no campo, em regiões de clima temperado. Todavia o mesmo não aconteceu nas condições tropicais do Brasil. 
12.3. SOBREVIVÊNCIA EM EXSUDATO BACTERIANO
É comum, no caso de muitas doenças de plantas incitadas por 
bactérias, o órgão interno exibir rachaduras das quais exsudam células bacterianas em mistura com gomas e resinas da própria planta, formando exsudatos em forma de gotas visíveis a olho nú, de coloração e consistência variáveis. A sobrevivência de células bacterianas nesses exsudatos parece ser possível e efetiva.
12.4. SOBREVIVÊNCIA EM SEMENTES
Não há dúvidas de que fitobactérias são capazes de sobreviver 
associadas a sementes, tanto assim que a literatura mundial lista dezenas de casos de transmissão de bactérias por sementes. Embora sementes contaminadas não necessariamente transmitam as bactérias. Quanto a semente a bactéria pode
sobreviver interna ou externamente na mesma. Importante se faz saber onde a bactéria está situada (fig.5).
 Fig.5. Associação de fitobactérias com sementes
12.5. SOBREVIVÊNCIA EM HOSPEDEIROS ALTERNATIVOS
 (ERVAS DANINHAS)
 Bactérias com ampla gama de hospedeiros (R. solanacearum).
12.6. SOBREVIVÊNCIA EM ÓRGÃOS VEGETAIS SADIOS
Como população residente.
12.7. INSETOS
 
13. CICLO DE VIDA
As bactérias fitopatogênicas em seu ciclo de vida podem 
apresentar as seguintes fases (fig. 6):
Fig.6. Fases do ciclo de vida de uma bactéria
 fitopatogênica, em se tratando de
 possibilidades de sobrevivência do patógeno,
 segundo (LEBEN, 1981).
FASE PATOGÊNICA – fase na qual a bactéria encontra-se 
multiplicando-se ativamente no hospedeiro.
NA FASE SAPROFÍTICA - a bactéria sobrevive e ou
 multiplica-se em outros substratos que não os tecidos do suscetível.
NA FASE RESIDENTE – Bactérias nesta fase do ciclo de vida são denominadas “populações residentes”. Elas são capazes de se multiplicar na superfície de plantas sadias (cultura agrônomica ou erva daninha, planta hospedeira ou não-hospedeira) sem infectá-las, sendo fonte de inóculo na ausência de doença. Nutrientes disponíveis, nesse caso, seriam exsudatos do filoplano ou rizoplano. 
NA FASE LATENTE – a bactéria, está associada aos tecidos 
internos dos suscetíveis, em baixas populações, têm sua multiplicação reduzida e os sintomas não se evidenciam.
NA FASE HIPOBIÓTICA - a célula bacteriana poderá estar ou não associadaaos tecidos do hospedeiro, porém não está infectando-o por ter seu metabolismo reduzido ao mínimo, devido a condições adversas do meio.
14. MEDIDAS GERAIS DE CONTROLE
Doenças de plantas incitadas por bactérias disseminam-se com grande facilidade. É também interessante observar que o potencial de inóculo aumenta muito rapidamente uma vez estabelecida a doença na cultura. Assim, o controle de fitobacterioses pode constituir-se em problema sério, e as vezes de 
difícil solução. Entre as medidas gerais possíveis de serem adotadas, podemos citar as seguintes:
14. 1. QUARENTENA
Pelas razões expostas anteriormente, a medida ideal de controle consiste exatamente em impedir a entrada do patógeno num local onde ele nunca 
existiu. Isto é conseguido por meio de quarentena e outras medidas de exclusão. Quase todos os países possuem suas normas de quarentena, sendo em alguns extremamente rígidas e em outros, não. Geralmente essas medidas são de caráter governamental. A adoção de medidas desta natureza, e sua aplicabilidade em termos de rigor e eficiência estão muito em função da infra-estrutura governamental do país em questão. 
 No Brasil é o CENARGEN (Centro Nacional de Recursos Genéticos), um órgão da EMBRAPA localizado em Brasília, quem se encarrega disso. Teoricamente, ninguém pode, nem mesmo pesquisadores, importar material vegetal de outros países sem permissão do CENARGEN, que deverá examinar o material e emitir ou não um certificado de sanidade.
Países desenvolvidos como os E.U.A., chegam a ter uma legislação tão rigorosa que não permitem a entrada de qualquer ser vivo dentro de suas fronteiras sem um exame cuidadoso da natureza do material.
 Medidas de quarentena, fiscalização eficiente e quaisquer outras medidas de exclusão são importantes, não só a nível internacional mas também regional, mormente num país de dimensões continentais como o Brasil.
14. 2. USO DE SEMENTES CERTIFICADAS
O uso de sementes certificadas é uma medida importantíssima sendo semente aqui entendida como qualquer órgão propagativo da planta como: sementes propriamente ditas, tubérculos, rizomas, bulbos, estacas, etc...
Muitos fungos associados a sementes podem ser erradicados por tratamento químico, mas o mesmo não acontece no caso de bactérias fitopatogênicas. Assim o método mais eficiente para evitar o surgimento de doenças bacterianas nas culturas é o plantio de sementes técnicamente sadias ou abaixo do nível de tolerância da doença no campo.
Em certificação sanitária de sementes, tolerância significa o grau máximo de infecção, em termos quantitativos, que as mesmas podem apresentar em relação a um patógeno em conformidade com a legislação ou com as normas vigentes. O principal fator para se estabelecer limites de tolerância deve ser a relação entre a quantidade de inóculo na semente e os danos que por ele podem ser ocasionados à cultura, após o plantio e a germinação. Os limites para bactérias são normalmente bem baixos, uma vez que elas apresentam tempo de geração curto e rápida disseminação. Há necessidade de se estabelecer padrão de tolerância para cada patógeno importante de cada cultura.
Na maioria dos países da América latina, assim como no Brasil a certificação de sementes, quando é feita, leva em conta a germinação, pureza e identidade genética das mesmas. A certificação para sanidade de um lote de sementes, se realizada, baseia-se apenas em inspeções visuais da cultura no campo ou das próprias sementes, o que não é suficiente para que uma semente seja considerada certificada. 
14.3. TRATOS CULTURAIS
Geralmente medidas de caráter paliativo. Visam, basicamente, a redução do potencial de inóculo.
a) Enterrar restos culturais infectados;
b) Queima de restos culturais infectados;
c) Poda - forma de erradicação que visa a redução do potencial de inóculo (á poda segue-se a queima dos órgãos podados). PONTOS IMPORTANTES: A poda ao provocar ferimentos, pode propiciar a penetração de organismos. O instrumento de poda pode se transformar em importante agente de disseminação.
14.4. CONTROLE DO VETOR
Muitas bacterioses de plantas são disseminadas por vetores como insetos, nematóides, etc. Neste caso, o controle do vetor, se viável, pode constituir-se em boa medida de controle.
14.5. TERMOTERAPIA
Engloba técnicas em que o calor é usado para o controle de bacterioses de plantas. 
14.5.1.TRATAMENTO COM ÁGUA QUENTE
É bom ter em mente que, dependendo do caso, pode haver redução do poder germinativo.
Exemplos:
- Brássicas - Xanthomonas campestris pv. campestris - tratamento de sementes a 50SYMBOL 176 \f "Symbol"C por 30 minutos;
- Tomates - Pseudomonas syringae pv. tomato - tratamento de sementes a 52SYMBOL 176 \f "Symbol"C por 60 minutos;
- Tomate - Pectobacterium carotovorum subsp carotovorum - a 50SYMBOL 176 \f "Symbol"C por 12 minutos;
- Cana-de-açúcar - raquitismo da soqueira - tratamento de toletes a 50,5SYMBOL 176 \f "Symbol"C por duas horas.
14.5.2. CALOR SECO OU AR QUENTE
As sementes são colocadas, num ambiente de temperatura elevada a seco, expostas a calor seco ou fluxo de ar quente.
14. 6. ERRADICAÇÃO
No sentido estrito do termo, erradicação englobaria todas as medidas que eliminassem o patógeno do ambiente, do solo ou de órgãos vegetais, tais como solarização, tratamento de sementes, esterilização do solo, destruição de plantas, etc.
Geralmente campanhas de erradicação, num país, são de caráter governamental (custo, aspectos legais).
No Brasil, no caso de bacteriologia de plantas, limita-se ao cancro cítrico. Tenta-se erradicar o cancro no Brasil desde sua constatação, na década de 50, em São Paulo. Existe um órgão do Ministério da Agricultura - CANEC (Campanha Nacional de erradicação do Cancro Cítrico) - criado para tal fim, conforme decreto No. 70.061 de 09/12/1974
Apesar dos esforços governamentais, quase 40 anos após a constatação da doença no Brasil, ainda não se conseguiu erradicá-la. Pelo contrário, ela disseminou-se para outros estados da federação. 
14.7. CONTROLE BIOLÓGICO
Ecologicamente recomendável por não poluir quimicamente o meio ambiente. Poucos exemplos estudados.
14.8. CULTIVARES RESISTENTES
Juntamente com o emprego de medidas de exclusão o uso de cultivares resistentes é a medida mais recomendável. Em muitos países já existe para o caso de muitas culturas, cultivares especialmente melhoradas para a resistência a certas bacterioses. No Brasil existe muito pouco neste sentido.
POSSIBILIDADES DO USO DE PRODUTOS QUÍMICOS NO CONTROLE DE BACTERIOSES DE PLANTAS
Geralmente são usados fungicidas cúpricos. O efeito é 
essencialmente preventivo. Quanto aos antibióticos, que são substâncias produzidas por microorganismos que, atuando em baixas concentrações, são capazes de inibir o crescimento ou inibir outros microrganismos, apresentam as seguintes restrições:
1. Viabilidade econômica: pelo fato de serem produtos químicos de custo elevado, sua utilização tem sido grandemente limitada.
2. Possibilidade de surgimento de populações resistentes como consequencia do uso continuado de um mesmo produto por muito tempo (específico).
3. Problemas éticos e sanitários concernentes a resíduos de antibióticos em órgãos vegetais destinados a alimentação.
15. IDENTIFICAÇÃO
A identificação das diversas espécies bacterianas fundamenta-se na observação de um complexo de caracteres. Para obter-se uma classificação exata, é necessário que se proceda desse modo, porque na maioria dos casos, muitas espécies distintas ostentam a mesma morfologia e caracteres químicos, 
tornando-se necessários que se esmiucem em particularidades, sem o que não se chega a determinação da espécie.
Quando se estuda uma bactéria, a fim de classificá-la, deve-se anotar as diversas características em fichas próprias,onde estejam tabulados os dados fundamentais. Há diversos desses fichários organizados em diferentes laboratórios, porém, deve-se destacar como dos mais completos e aconselháveis os sugeridos pela Sociedade Americana de Microbiologia.
Recomenda-se quando se estuda uma bactéria, que se pretende classificar, examiná-la em todos os seus aspectos, isto é, morfológicos, bioquímicos, serológicos, ação patogênica, etc. No entanto nem sempre torna-se essencial, para fins práticos, que assim se proceda. Com efeito, para cada grupo bacteriano há, geralmente, dados que prevalecem em importância, com relação a outros para a separação das espécies.
15.1. DIAGNOSE (TESTES RÁPIDOS)
Antes do isolamento, deve-se ter uma certa segurança de que a doença, em questão, é causada por uma bactéria, para tanto podemos efetuar observações diretas, que são simples em seu mecanismo. Contudo, deve-se ter em mente que alguns desses testes rápidos, embora úteis para uma diagnose rápida, fornecem uma indicação e não uma certeza.
15.1.1. TESTE DE BEIRA DE COPO
PROCEDIMENTO:
- Destacar do material infectado fragmentos retangulares ou quadrangulares de mais ou menos 1 x 1 cm, aproximadamente (zona de transição);
- Colocar esse(s) fragmento(s) em um bequer ou copo contendo até sua metade água límpida (a parte infectada deverá entrar em contato com a superfície d'agua);
- Colocar o material sobre uma mesa e deixar em repouso;
- Após 5 a 10 minutos observar.
RESULTADO:
- Se a doença for causada por bactéria esta sairá do tecido indo para dentro d'agua. Ocorrendo então turbidez do líquido logo abaixo do tecido lesionado.
15.1.2. TESTE DE ESXUDAÇÃO EM GOTA
PROCEDIMENTO:
- Colocar no centro de uma lâmina uma gota de água estéril;
- Destacar fragmentos do tecido doente (como exposto no teste anterior) e colocar sôbre a gota;
- Colocar a laminula e observar a preparação ao microscópio (Fig. 8).
RESULTADO:
- Se a doença for causada por bactéria poderemos constatar células se difundindo do interior dos tecidos para o seio do líquido (fig. 9).
 Fig. 8. Esquema do procedimento para o teste de 
 esxudação em gota
 Fig. 9. Bactérias exsudando de fragmentos de 
 folha, visualizado ao microscópio comum 
15.1.3. TESTE DE CAMARA SUPER ÚMIDA
Este teste é bom para a diagnose de Ralstonia solanacearum, um patógeno que típicamente coloniza os tecidos vasculares. Processo, idealizado pelo bacteriologista Júlio Franco do Amaral (específico para murcha da batata, mas que pode ser utilizado para outras bacterioses que atacam o sistema vascular), provoca uma rápida exsudação do pús bacteriano, que evidencia o mal (fig. 10).
PROCEDIMENTO:
		- Colocar a planta arrancada e cortada transversalmente (caule seccionado 10 centímetros acima da região do colo) com as raízes (lavadas para retirar solo aderente) dentro de um recipiente com água;
- Recobrir a porção seccionada do caule (em bisel) com um tubo de ensaio (este deverá ter sua abertura dentro d'agua);
- Observar exsudação de pús bacteriano;
- Dependendo de uma série de fatôres essa exsudação pode demorar de alguns minutos a algumas horas para se manifestar;
- Após esse tempo, caso não ocorra exsudação, poderá a doença não ser causada por bactéria
 Fig. 10
15.2. ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS
Na grande maioria das vezes, para que se possa identificar com segurança o agente etiológico de uma doença, faz-se necessário dispor desse organismo, sob forma de cultura pura em meio artificial. Uma vez dispondo da cultura pura, estudos serão feitos sôbre sua patogenicidade, anatomia, fisiologia, ecologia, etc., facilitando sua identificação e caracterização. O isolamento de bactérias fitopatogênicas demanda especiais cuidados de assepsia pois o número de operações envolvidas é grande e bactérias saprófitas acham-se quase sempre presentes associada ao tecido doente, principalmente nas lesões mais velhas.
PROCEDIMENTO
O material deve ser coletado (órgão vegetal ou planta inteira) nos estágios iniciais da infecção. Lesões velhas devem ser evitadas, pois nelas abundam fungos e bactérias saprófitas que mascaram e comprometem o sucesso do isolamento. O transporte de material do campo para o laboratório deve ser rápido e em recipientes de papel. O uso de sacos plásticos proporciona um ambiente super-úmido, altamente favorável ao desenvolvimento de organismos saprófitas.
BDA, o meio universalmente utilizado em fitopatologia, presta-se bem a esta finalidade, embora outros meios, mais ricos e mais completos ofereçam melhores condições para bom desenvolvimento da bactéria isolada.
O meio que têm-se mostrado bom para crescimento da maioria das bactérias fitopatogênicas, é o meio 523 de Kado e Heskett cuja composição é a seguinte:
	Sacarose
	10,0 g
	Caseína ácida hidrolisada
	8,0 g
	Extrato de levedura
	4,0 g
	K2HPO4 (anidro)
	2,0 g
	MgSO4.7H2O
	0,3 g
	Agar
	5,0 g
	Água destilada
	1000 ml
15.2.1. ISOLAMENTO DE FOLHAS
 Fig. 11. esquema para o isolamento de bactérias em folhas
 
- Escolha lesões típicas e recentes. Destaque pequenos fragmentos do tecido lesionado (zona de transição), com o auxílio de uma tesoura, gillette ou bisturí. Coloque esses fragmentos dentro de um recipiente contendo etanol durante 30 segundos, a fim de evitar a formação de bolhas de ar em sua superfície quando tratadas pelo desinfetante; 
- Com o auxílio de uma pinça, passe-os a solução desinfetante (NaClO - 1%) durante 30 minutos, o tempo de desinfestação varia 
de acôrdo com a consistência e espessura do material. O volume de desinfetante deve ser pelo menos cinco vezes maior que o material a desinfestar;
- Decorrido o tempo para esterilização superficial dos tecidos, transfira os fragmentos (pinça flambada) para água destilada estéril (retirar o excesso de desinfetante), pelo menos 3 vezes (recipientes diferentes), após retire-os colocando os mesmos em placa de Petri (esterilizada) vazia; 
- Pegue lamina escavada e coloque uma gota de solução salina na cova. Retire um ou mais fragmentos da placa e coloque-os sôbre a cova, com o auxílio de uma pinça e bisturi corte os fragmentos em pedaços menores;
- Com um bastão de vidro, macere esses fragmentos que estão na lamina até formar uma suspensão bacteriana;
- Após a maceração, com bastão de vidro, transfira uma gota da suspensão para placa(s) de Petri com meio de cultura apropriado, pelo método de estrias ou risca;
- Etiquete a(s) placa(s), inverta-a(s) e incube-a(s) a 25 - 27SYMBOL 176 \f "Symbol"C;
- 24 a 48 horas após o semeio, repique colônias bem isoladas, para tubos de cultura. As colônias que surgem com 24 horas ou menos são geralmente, de bactérias saprófitas.
 
15.2.2. ISOLAMENTO DE SEMENTES 
- Colocar 100 sementes dentro de um recipiente contendo etanol 96% durante 30 minutos, após esse período, retirar as sementes e, colocá-las dentro de um bequer contendo o desinfetante (hipoclorito de sódio - 2%) por 10 minutos. Enxaguar as sementes pelo menos 3 vezes em água estéril;
- Dividir as sementes em grupos de 25 e colocá-las em 4 placas de Petri esterilizadas. Adicionar a cada placa 0,75 ml de solução salina;
- Incubar a 25 - 27SYMBOL 176 \f "Symbol"C durante 24 - 48 horas, para extrair as bactérias das sementes;
- Após este período, com o auxílio de um bastão de vidro, transfira uma gota, de cada placa, da suspensão bacteriana formada, para placas de Petri, contendo meio apropriado, pelo método de estrias;
- Etiquete as placas, inverta-as e incube-as a 25 - 27SYMBOL 176 \f "Symbol"C;
- 24 - 48 horas após o semeio, repique colônias bem isoladas para os tubos de cultura.
15.2.3. ISOLAMENTO DE SOLO 
- Preparar 10tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de solução salina;
- Pesar 1 grama de solo, peineirado, e colocar em um recipiente contendo 100 ml de solução salina. Agitar para perfeita homogeinização durante 5 minutos;
- Com uma pipeta esterilizada, transfira 1 ml desse recipiente para um dos tubos com 9 ml de solução salina. Agitar durante 1 minuto, desse último transferir, com pipeta esterilizada, para outro com 9 ml e assim sucessivamente até a diluição desejada;
- Após, transfira uma gota do tubo para placa(s) de Petri, contendo meio apropriado, pelo método de estrias;
- Etiquete a(s) placa(s), inverta-a(s) e incube-a(s) a 25 - 27SYMBOL 176 \f "Symbol"C;
- 24 a 48 horas após o semeio, repique colônias bem isoladas para os tubos de cultura.
OBS: Essa técnica têm o inconveniente de se formarem numerosas colônias de fungos e bactérias que vivem no solo e, na grande maioria não fitopatoparasitas. Por isso, para o isolamento de fitopatógenos que, vivendo no solo, infectam as plantas hospedeiras quando ainda na fase de muda, penetrando-
as através de suas partes hipógeas, poder-se-á empregar a técnica seguinte: semear em terra infectada, sementes sadias e desinfestadas, e aguardar o aparecimento de sintomas nas mudinhas e, isolar delas o patógeno.
15.2.4. ISOLAMENTO DE FEIXES VASCULARES
- Para este tipo de isolamento o método é o mesmo descrito para folhas. Porém, os fragmentos de tecidos infectados do caule devem ser de 3 a 4 cm.
15.2.5. ISOLAMENTO DE TUMORES
As bactérias indutoras de galhas podem ser fácilmente isoladas
 de lesões novas, ou provenientes de caules tenros, através do método descrito para folhas. Entretanto, o mesmo não ocorre quando os isolamentos são feitos apartir de galhas duras, ou, desenvolvidas em caules lenhosos. Para tal corta-se a galha em V e, inocula-se em plantas tenras, apartir dessa então executa-se o isolamento.
15.3. IDENTIFICAÇÃO DE GÊNEROS
15.3.1 COLORAÇÃO DE GRAM
O método têm como objetivo determinar se a bactéria, em questão é Gram positiva ou Gram negativa.
PROCEDIMENTO:
- Preparar esfregaço (dispor sôbre uma lâmina a suspensão bacteriana de forma retangular ou quadrangular);
- Fixar o esfregaço (deixar secar em meio ambiente);
- Cobrir o esfregaço fixado, com solução de cristal violeta, corante básico, durante 1 minuto;
- Lavar a lâmina com água e cobrir com solução de lugol, durante 1 minuto;
- Lavar a lâmina com água e, mantendo-a inclinada, pingar álcool (agente descorante) gota a gota até que não desprenda mais corante da preparação;
- Lavar a lâmina com água;
- Cobrir a preparação com solução de safranina e deixar por 15 a 30 segundos;
- Lavar com água e deixar secar a preparação;
- Observar a preparação ao microscópio com imersão.
RESULTADO:
Se as células ficarem coloridas de vermelho são Gram negativas, se violeta Gram positivas.
 
 Fig. 12. Bactérias Gram - Fig. 13 . Bactérias Gram + 
Para utilização do teste de Gram é essencial fazer a coloração em células oriundas de cultura jovem, uma vez que certas bactérias só são Gram positivas durante a fase de crescimento ativo e, perdem sua capacidade de reter o complexo cristal violeta-iodo quando cessa o crescimento ativo.
O fato de ser Gram positiva se deve as diferenças na composição química da parede celular. As paredes das células de bactérias Gram negativas além do composto macromolecular possuem alto teor de lipídios enquanto que as Gram positivas são constituídas, de quase, exclusivamente do composto macromolecular não contendo lipídios ou contendo muito pouco. Sabe-se que a sede de reação do Gram e na célula, no citoplasma, e não na parede. A célula bacteriana desprovida de parede celular, o protoplasma, é imediatamente descorado pela ação do álcool. Assim a parede na bactéria Gram positiva representa uma barreira que impede o acesso do descorante ao citoplasma, impedindo desta maneira a saída do complexo corante.
A falha na parede das Gram negativas em impedir o acesso do agente descorante ao citoplasma corado é uma consequencia de seu alto teor de lipídios. Os lipídios da parede são rapidamente dissolvidos por álcool ou acetona, podendo o solvente orgânico penetrar no citoplasma e fluir para o exterior o complexo corante. Analisando, pode-se dizer que a reação de Gram, pode servir 
como um método grosseiro para distinção de dois tipos, quimicamente diferente, de paredes celulares existentes nas bactérias.
Fig. 14. Esquema explicativo do método de coloração de Gram
CRISTAL VIOLETA COM OXALATO DE AMÔNIO (Hucker's)
SOLUÇÃO A
	Cristal violeta
	0,2 g
	Álcool etílico (95%)
	20 ml
SOLUÇÃO B
	Oxalato de amônio
	0,8 g
	Água destilada
	80 ml
Misturar as soluções A e B
SOLUÇÃO DE LUGOL
	Iodine
	0,1 g
	Iodeto de potássio
	0,2 g
	Água destilada
	100 ml
Dissolver o iodeto de potássio em uma certa porção de água, adicionar o iodine e completar o volume.
SOLUÇÃO DE SAFRANINA
	Safranina
	0,5 g
	Álcool etílico
	10 ml
	Água destilada
	100 ml
15.3.2. RELAÇÃO COM O OXIGÊNIO LIVRE
Existem muitos métodos para estudo desse aspecto. Dentre eles podemos citar o método do "Shake tubo".
PROCEDIMENTO:
- Preparar meio de cultura sólido que permita bom crescimento da bactéria. Distribuir o meio, não inclinado, em tubos. Semear o organismo em estudo no meio fundente (45 - 50SYMBOL 176 \f "Symbol"C) e misturar bem, agitando continua e severamente. Incubar a temperatura adequada .
RESULTADO:
- As bactérias aeróbicas crescem sómente na superfície da coluna do meio, as anaeróbicas facultativas em todo o meio .
 Fig. 15. Crescimento bacteriano em função do teor de 
 Oxigênio livre
15.3.3. CRESCIMENTO EM MEIO DE CLARA
Este meio é o empregado para verificar se a bactéria é capaz de utilizar asparagina como única fonte de carbono e nitrogênio. Nenhuma espécie de Xanthomonas é capaz de crescer neste meio. Se uma determinada cultura, supostamente de Xanthomonas, exibe crescimento em meio de Clara, ou a cultura não pertence a este gênero ou está impura.
MEIO DE CLARA
	Sulfato de magnésio
	0,5 g
	Fosfato de potássio dibásico
	0,5 g
	Asparagina
	5,0 g
	Água destilada
	100 ml
OBS: este teste deverá sempre ser feito com uma testemunha (tubo de ensaio contendo apenas meio de Clara, sem bactéria).
16. LITERATURA CONSULTADA
AGRIOS, G.N. Plant Pathology. Academic Press, New York. 1978. 703 p.
ARAUJO, E.Bacteriologia Geral. Livraria progresso Editora, Salvador, Bahia. 1959
965 p.
BERGEY'S MANUAL DETERMINATIVE BACTERIOLOGY. The Williams and Wilkins Company, Baltimore. 1975.1269 p.
BIER, O. Bacteriologia e Imunologia. Edição Melhoramentos, Editora da Universidade de São Paulo. 1975. 1056 p.
BRADBURY, J.F. Guide to Plant Pathogenic Bacteria. C.A.B. International 
Mycological Institute, England. 1986. 322 p.
CARVALHO, P.C.T., C.O.N. CARDOSO, e J.B. CARDOSO. Microbiologia, Caderno de Aulas Práticas USP-ESALQ, Piracicaba, S.P. 1978. 64 p.
CUPERTINO, F.P. História da Fitopatologia Brasileira. Revisão Anual de Patologia de Plantas. Gráfica Editora Pe. Berthier. Passo fundo, RS. Vol.1. p. 1-31. 1993. 
FAHY, P.C. e G.J. PERSLEY. Plant Bacteria l Diseases – a Diagnostic Guide.
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