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Apostila de Microbiologia

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3333333
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE MEDICINA TROPICAL
DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
RROOTTEEIIRROO DDEE AAUULLAASS PPRRÁÁTTIICCAASS DDEE
MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGIIAA EE IIMMUUNNOOLLOOGGIIAA
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R ot e i r o d e Aul a s Prá t i ca s d e M i cr ob io lo g i a e Im un olo g i a
Í N D I C E
I - ESTERILIZAÇÃO E DESINFECÇÃO-------------------------------------------------------- 3
II – TÉCNICAS DE COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS -------------------------------------------- 9
III – MEIOS DE CULTIVO BACTERIANO ----------------------------------------------------16
IV – ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS -------------19
V – ANTIBIOGRAMA: TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO E INTERPRETAÇÃO ---------------22
VI – ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS ----------- 27
VII – ASPECTOS MICROSCÓPICOS E MACROSCÓPICOS DOS FUNGOS -----------------33
VIII – REAÇÕES ANTÍGENO ANTICORPO --------------------------------------------------41
IX – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ------------------------------------------------------50
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E s t er i l i za çã o e D e s in f e c çã o 3
I - ESTERILIZAÇÃO E DESINFECÇÃO
Esterilização é o processo de destruição por meio de agentes
físicos ou químicos de todas as formas de vida microbiana
(vírus, bactérias, fungos e esporos) presentes num material.
A esterilização pode ser realizada por agentes físicos e
químicos.
 ESTERILIZAÇÃO POR MÉTODOS FÍSICOS
1. Calor Úmido
2.
1.1. Autoclavação - É um processo de esterilização pelo
vapor sob pressão em câmaras conhecidas como “autoclaves”
onde vapor de água é mantido em temperatura acima de
100oC, pelo emprego de pressão maior que a atmosférica, a
uma temperatura de 121oC. O tempo de exposição depende do
material a ser esterilizado. Este processo é utilizado
para esterilizar vidraria, instrumentos cirúrgicos, meios
de cultivo e outros.
1.2. Tindalização ou esterilização fracionada - Processo
de esterilização na temperatura de 100oC durante 30
minutos, repetindo-se o aquecimento 2 a 3 dias
consecutivos. Este processo é usado na bacteriologia para
a esterilização de certos meios de cultura que se alteram
em temperaturas elevada, como meios contendo açúcares,
leite etc.
3. Calor Seco
2.1. Forno de Pasteur - Neste processo são empregados
fornos ou estufas, onde a temperatura pode ser regulada e
mantida pelo tempo necessário para que haja
esterilização. É realizada em temperatura de 170-180oC,
em estufas elétricas por 1 a 2 horas. O material a ser
esterilizado deve ser distribuído de modo uniforme para
facilitar a distribuição do calor que emana das paredes
laterais e da base da estufa. Este processo é indicado
para esterilizar vidraria, instrumentos cirúrgicos
passíveis de serem oxidados pelo vapor, e materiais
impermeáveis como ceras, pomadas, pó e óleos.
2.2. Incineração -É um processo usado para materiais
descartáveis e carcaça de animais utilizados em
experimentos.
2.3. Flambagem - Aquecimento direto na chama do bico de
Bunsen utilizado em rotina de laboratório para
esterilização de alças de platina e bordas da boca de
tubos e balões.
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E s t er i l i za çã o e D e s in f e c çã o 4
3. Filtração - É um processo usado para esterilização de
gases e líquidos tais como soros, soluções de enzimas e
vitaminas, açúcares, que não podem ser submetidos ao
calor. A filtração consiste em passar o material a ser
esterilizado por filtros de poros muito pequenos que não
permitem a passagem de bactérias e fungos.
3.1. Tipos de filtros:
Disco de amianto - Filtro de SEITZ
Membrana de ester de celulose- Millipore
Filtros de partículas de ar de alta eficiência (HEPA) –
removem quase todos os microrganismos maiores que
0,3µ m de diâmetro. São utilizados para reduzir o
número de micróbios transmitidos pelo ar.
4. Radiações
4.1. Radiação ultra-violeta (UV) tem sido utilizada na
esterilização do ar e de ambientes. Na indústria de
alimentos são aplicados para esterilização de
superfícies de pães, xaropes, sacos plásticos, garrafas
de água mineral, carnes mantidas sob refrigeração.
Porém, seu uso é limitado, devido a seu baixo poder de
penetração, pois trata-se de radiação não ionizante.
4.2- Raios gama e raios X (radiações ionizantes)têm alto
poder de penetração. Raios gama têm sido empregados
na esterilização de certas vacinas e sanitização de
alimentos embalados.
 MÉTODOS QUÍMICOS
• Glutaraldeído 2% - As soluções de glutaraldeído são
indicadas para esterilização ou desinfecção de instrumentos
médicos cirúrgicos sensíveis ao calor, equipamentos de
anestesia gasosa, fibroscópios,partesópticas de endoscópios
etc. Exposição em torno de 18 horas.
• Formaldeído (Solução Alcoólica 8%) - A fórmula alcoólica
apresenta 8% de Formaldeído. Sua atividade germicida é
atribuída à inativação de proteínas e ácidos nucléicos
microbianos. Exposição em torno de 18 horas.
• Formaldeído (solução aquosa 10%) - As soluções aquosas além
de não liberar vapores irritantes não possuem os
inconvenientes das soluções alcoólicas sobre lentes de
equipamentos ópticos e artigos de poliestireno e borracha
em exposições prolongadas. Exposição em torno de 18 horas.
Es t er i l i z a çã o e D e s in f e c çã o 5
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 MÉTODOS FÍSICO-QUÍMICOS
• Estes métodos associam o produto químico com o uso de
equipamentos, garantindo assim a efetividade ao processo e
a segurança dos profissionais de saúde, sendo utilizado
para materiais termosensíveis.
• 1 – Esterilização por óxido de etileno: A esterilização é
realizada à baixa temperatura em torno de 54ºC durante 8 a 12
horas. Para materiais de implantes e próteses se recomenda uma
aeração ambiental em torno de 7 dias.
• Esterilização por vapor de formaldeído à baixa temperatura:
A esterilização por vapor de formaldeído é realizada em
autoclaves, em concentrações baixas em torno de 2% sob
forma de vapor, em temperaturas que variam entre 73ºC e
82ºC durante 90 e 180 minutos.
Precauções - As precauções recomendadas para estas soluções
consistem em utilizar luvas ou pinças para o manuseio de
artigos nelas imersas e, nos casos das soluções alcoólicas,
mantê-las em cubas de esterilização fechadas em ambientes
ventilados.
DESINFECÇÃO E ASSEPSIA
* Desinfecção - A Desinfecção consiste na destruição ou
redução dos microrganismos na forma vegetativa, presentes
num material inanimado ou superfícies inertes, mediante a
aplicação de agentes físicos ou químicos. A desinfecção não
implica a eliminação de todos microrganismos viáveis, porém
elimina a potencialidade infecciosa do objeto, superfícies
ou local tratado.
* Assepsia - É o termo usado para designar o processo de
desinfecção de tecidos vivos. Os anti-sépticos são
preparações contendo substâncias microbiocidas ou
microbiostáticas podendo ser usadasna pele, mucosas e
ferimentos. Exemplos: soluções alcoólicas, soluções
iodadas, soluções de permanganato de potássio, formulações
à base de sais de prata, iodóforos, etc.
Observações:
 Não são recomendados a utilização de iodofóros no recém-
nascido, pois pode ocorrer absorção transcutânea de iodo
com supressão da função tireoideana.
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E s t er i l i za çã o e D e s in f e c çã o 6
 Para a finalidade de antissepsia, não são permitidas as
formulações contendo mercuriais orgânicos, acetona,
quaternários de amônio, hipoclorito a 0,5%, éter eclorofórmio.
A desinfecção pode ser realizada por agentes físicos e
químicos.
• AGENTES FÍSICOS:
1.0. Pasteurização - É um processo empregado na indústria de
alimentos que elimina microrganismos patogênicos (bacilos
tíficos, paratíficos e desintéricos, brucelas,
estreptococos, bacilo da tuberculose) de produtos como o
leite pasteurizado, vinho, cerveja, submetendo-os a
temperatura de 63oC por 30 minutos ou 75oC por 15
segundos. Os tempos e as temperaturas de pasteurização
dependem do método e do produto a ser tratado. A
pasteurização não é um processo de esterilização, uma vez
que esporos e bactérias não patogênicas podem permanecer
viáveis.
1.1.Água Fervente - Artigos de pequeno porte, depois de
lavados com detergente adequado, podem ser desinfetados
por imersão em água a 100oC durante 10 minutos.
• AGENTES QUÍMICOS:
Principais compostos utilizados em desinfecção e assepsia:
– Álcoois - soluções a 70% e 80%
– Fenóis e Derivados - Fenol, Cresóis, Ac. salicílico e Ác.
Benzóico.
– Halogênios - Iodo, Iodóforos (Polivinil Piralidona-
Iodo/PVP-I, cloro, Hipoclorito de Sódio ou cálcio).
– Metais Pesados - Mercúrio (Mercúrio Cromo,Mertiolato),
Prata (Nitrato de prata), Cobre (Sulfato de Cobre).
– Corantes - Verde brilhante e malaquita. Violeta
Genciana, Azul de Metileno.
de
– Detergentes Sintéticos
-Aniônicos: laurilsulfato de sódio
-Catiônicos: cloreto de cetilpiridínio.
– Oxidantes - Água oxigenada, permanganato de potássio.
– Ácidos, Álcalis - Ác. Sulfúrico, Ác. clorídico, soda
(NaOH).
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E s t er i l i z aç ã o e D e s in f e c çã o 7
NOTAS:
As seguintes precauções deverão ser tomadas para evitar
a sobrevivência de microrganismos contaminantes, falhas de
esterilização ou a recontaminação dos artigos esterilizados,
independentes do processo de esterilização.
1. A escolha do processo de esterilização
 Processo de esterilização mais eficaz é o vapor saturado
sob pressão, seguindo-se o calor seco e os esterilizantes
químicos.A escolha depende da natureza do artigo a ser
esterilizado.
2. Limpeza prévia
 A presença de matéria orgânica (óleo, gordura, sangue, pus
e outras secreções) protege os microrganismos contaminantes
do contato indispensável com o agente esterilizante. Por
outro lado, quanto menor for o número de microrganismos
presentes, maior será a possibilidade de esterilização.
Assim, é necessário lavar cuidadosamente todos os artigos
em soluções desencrostantes (hiploclorito de sódio,
detergentes sintéticos etc), e enxaguá-los abundantemente
com água corrente e no último enxague com água destilada ou
deionizada antes de submetê-los a qualquer processo de
esterilização.
3. Invólucros e pacotes
 Os invólucros devem permitir o contato dos artigos com o
agente esterilizante, bem como mantê-los livres de
microrganismos durantea estocagem. A permeabilidade ao
vapor e ao óxido de etileno, a impermeabilidade a
partículas, a ruptura e a flexibilidade são as
características mais importantes para a seleção de um
invólucro.
4. Estocagem
 Após a esterilização, é essencial que os pacotes estejam
íntegros secos e frios, a fim de conservarem a esterilidade
dos artigos neles contidos. Se o pacote, ao ser removido da
câmara ainda estiver quente, o vapor contido no papel
condensa na temperatura ambiente, criando uma pressão
negativa que aspira o ar (contaminado) do ambiente atravésCreate PDF with GetPDF on Windows 7, Vista, XP, Server 2003, 2008. To remove the mark, buy a license.
do invólucro. Este atua como se fosse um filtro, deixando-
se penetrar pelo ar e retendo células, partículas
bacterianas ou não. Se este invólucro não estiver íntegro,
os artigos no pacote sofrerão recontaminação. A umidade
além de diminuir a resistência de invólucros de papel,
facilita rupturas e interfere no mecanismo de filtração do
ar. Para evitar a contaminação posterior, recomenda-se o
uso de cestos metálicos.
 Os pacotes esterilizados devem ser manuseados o menos
possível, sempre com delicadeza e estocados em ambientes
limpos e secos (30 a 60% de umidade) e temperatura em torno
de 25oC, reesterilizados quinzenalmente quando não
utilizados.
5. Medidas Preventivas
 Uso de luvas, Avental e, se necessário, máscara.
 Materiais contaminados por agentes patógenos devem ser
esterilizados antes de serem descartados.
 Após o manuseio de materiais contaminados por agentes
microbianos, lavar cuidadosamente as mãos com sabão ou
soluções detergentes antissépticas, como soluções aquosas
de Polivinil Pirrolidona-Iodo (PVP-I) a 10%, cloro-hexidina
a 4% ou hexaclorofeno a 3% adicionado de 0,3% de
clorofenol.
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E s t er i l i za çã o e D e s in f e c çã o 8
Aula Prática - Análise do efeito da ação de antissépticos
relacionada ao crescimento bacteriano.
Objetivo: Observar o efeito de antissépticos sobre o
crescimento bacteriano na superfície da pele das mãos.
Materiais:
“Swab” estéril
Placa com meio de cultura Ágar nutriente.
Antissépticos: Sabão líquido e Solução álcool-iodado,
álcool 70% e álcool gel.
Técnica:
1. Abrir a placa rapidamente e colocar a ponta dos dedos,
sobre a superfície do meio de cultura. Fechar a placa.
2. Lavar as mãos com água corrente e sabão líquido, deixar a
água escorrer espontaneamente em seguida colocar a ponta
dos dedos sobre a superfície do meio de cultura. Fechar a
placa rapidamente.
3. Friccionar a ponta dos dedos com solução de álcool iodado
2%. Esperar secar, em seguida colocar a ponta dos dedos
sobre o meio de cultura, como item 2.
4. Friccionar a ponta dos dedos com solução de álcool 70% e
depois com álcool gel. Esperar secar, em seguida colocar a
ponta dos dedos sobre o meio de cultura, como item 2.
5. Incubar a 37ºC por 24 horas.
Resultado:
Ação dos Agentes Crescimento Bacteriano
Álcool Iodado
Álcool 70%
Sabão
Sem anti-sépticos
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T é cn i ca s d e Co lo raç ã o d e B a c t ér i a s 9
II – TÉCNICAS DE COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS
As técnicas de coloração iniciadas por Paul Erlich e
Robert Koch (1843-1910) permitiram ao microbiólogo distinguir
as células bacterianas quanto a sua morfologia, tamanho e
arranjo celular e diferenciá-las de acordo com as suas
características tintoriais. Os corantes são divididos em dois
grupos: os ácidos e os básicos. Os corantes básicos são sais
com base corada que se unem eficazmente a substratos ácidos,
tendo uma grande afinidade para corar material nuclear (azul
de metileno, cristal violeta, fucsina básica, safranina). As
bactérias comportam-se como material nuclear e desse modo,
quase todos os corantes utilizados em bacteriologia são
corantes básicos. Os corantes ácidos tendem a corar mais
eficientemente os substratos básicos, como o citoplasma.
MORFOLOGIA
As células bacterianas são caracterizadas
morfologicamente pelo tamanho, forma e arranjo.
 Tamanho - as bactérias são microscópicas medindo desde 0,3
por 0,8µ m até 10 por 25µ m. As espécies de maior
interesse médico medem entre 0,5 a 1µ m por 2 a 5µ m.
 Forma - as bactérias podem ser classificadas quanto a forma
em três grupos básicos:
Cocos - células esféricas.
Bacilos - células cilíndricas, em forma de bastonetes.
Espirilos - células espiriladas. Algumas delas se comportam
como bacilos curvos, em forma de vírgula, que podem ser
denominados víbrios. Ex: Vibrio cholerae.
Arranjos - Grupamentos bacterianos.
Dependendo do plano e do número de divisões através das
quais as bactérias continuam unidas, podem aparecer os
seguintes arranjos:
1.Cocos
Pares: diplococos (ex.: gonococos)
Cadeias: (ex.: estreptococos)
Tétrades ou cúbicos (Sarcina)
Cocos em cachos(ex.: estafilococos)
2.Bacilos e espirilos apresentam-se em geral, como células
isoladas, porém ocasionalmente, pode-se observar: bacilos
aos pares (diplobacilos) ou em cadeia (estreptobacilos).
Após a divisão de algumas bactérias, podem ocorrer
movimentos característicos, por exemplo: um movimento em
chicotada pode levar as bactérias a posições paralelas.
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T é c n i ca s d e Co lo raç ã o d e B a c t ér ia s 10
Divisões repetidas e seguidas desses movimentos determinam
posições semelhantes a letras chinesas características do
bacilo diftérico.
PREPARAÇÃO DE ESFREGAÇO BACTERIANO PARA COLORAÇÃO
1-Preparação a partir de meio líquido
Usando alça de platina estéril, colocar duas a três
alíquotas de cultura bacteriana preparada em meio líquido
sobre a superfície de uma lâmina de microscopia.
Espalhar sobre a lâmina, fazendo movimentos circulares
de dentro para fora e deixar o esfregaço secar a temperatura
ambiente. Em seguida, realizar a fixação passando duas a três
vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen.
2-Preparação a partir de meio sólido
Colocar uma pequena gota de água destilada numa lâmina.
Com alça de platina colocar sobre a lâmina uma pequena porção
do crescimento bacteriano. Espalhar sobre a lâmina e
prosseguir a preparação como no item anterior.
3-Preparação a partir de material biológico
Usando um swab estéril (zaragatoa), friccionar a
superfície da mucosa ou lesão oral por exemplo e fazer um
esfregaço circular na superfície de uma lâmina. Deixar secar
à temperatura ambiente. Recolocar o swab dentro do tubo de
ensaio e executar a fixação, como no item anterior.
COLORAÇÃO SIMPLES
Técnica de coloração caracterizada pelo uso de apenas um
corante, permitindo a observação da forma, tamanho e
grupamento da célula bacteriana. Esta técnica de coloração é
bastante utilizada para a detecção de cocos que causam
meningite (Neisseria meningitidis), em amostra de líquido
cefalorraquidiano (LCR).
MÉTODO
1)Preparar o esfregaço bacteriano em lâminas;
2)Cobrir toda a lâmina com solução de azul de metileno, aguar
dar 5 minutos e desprezar o corante na pia;
3)Lavar a lâmina rapidamente em água corrente, secar com
papel de filtro ou à temperatura ambiente (sem esfregar) e
observar em objetiva de imersão.
RESULTADO
Visualizar, descrever a morfologia e arranjo das
bactérias existente na lâmina.
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T é c n i ca s d e Co lo raç ã o d e B a c t ér ia s 11
COLORAÇÃO DE GRAM (Coloração diferencial)
Este método de coloração foi empiricamente desenvolvido
pelo bacteriologista dinamarquês, Christian Gram, em 1884, e
permite distinção entre diferentes bactérias que podem
mostrar uma morfologia similar, porém com propriedades
tintoriais diferentes. A coloração de Gram classifica as
bactérias em dois grupos: Gram positivas e Gram negativas.
TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM
1)cobrir toda a lâmina com solução de cristal violeta,
aguardar um minuto e desprezar o corante na pia;
2)cobrir a lâmina com lugol, aguardar um minuto, desprezar o
lugol na pia;
3)inclinar a lâmina e gotejar álcool-acetona até que não haja
desprendimento de corante (cerca de 30 segundos), lavar a
lâmina rapidamente em água corrente.
4)cobrir a lâmina com fucsina de Gram e aguardar 30 segundos.
Lavar, secar e observar em objetiva de imersão.
NOTAS
1)O Cristal violeta só se liga a parede celular bacteriana
após a adição da solução de lugol (mordente)
2)O etanol poderá ser usado como agente descorante fraco.
3)O material dos corantes empregados na técnica,
principalmente sedimento do cristal violeta, poderá
aparecer como artefato.
4)O descoramento para mais ou menos é resultante da incorreta
diferenciação pelo álcool-acetona.
5)A idade da cultura bacteriana tem importância fundamental
na coloração de Gram. Em culturas envelhecidas, células
Gram Positivas freqüentemente se tornam Gram Negativas.
Enzimas líticas excretadas normalmente por culturas
envelhecidas podem causar danos à parede da célula, como por
exemplo, alterando a permeabilidade aos solventes (álcool-
acetona). Conseqüentemente, o complexo iodo cristal violeta
poderá ser retirado da célula, nessa fase de coloração.
RESULTADO
Visualizar, desenhar a morfologia e classificar as
bactérias nas lâminas de acordo com o seu comportamento
diante dos corantes de Gram:
Bactérias Gram positivas coradas em roxo
Bactérias Gram negativas coradas em rosa
INTERPRETAÇÃO
A coloração de Gram classifica as bactérias em Gram
positivas ou Gram negativas. O mecanismo da coloração de
Gram, se refere à composição da parede celular, sendo que asCreate PDF with GetPDF on Windows 7, Vista, XP, Server 2003, 2008. To remove the mark, buy a license.
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Gram positivas possuem espessa camada de peptidoglicano e
ácido teicóico, e as Gram negativas, uma fina camada de
peptidoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta
por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e
lipopolissacarídeos. Durante o processo de coloração, o
tratamento com o álcool(ou álcool-acetona) extrai os
lipídeos, daí resultando uma porosidade ou permeabilidade
aumentada da parede celular das bactérias Gram negativas.
Assim, o complexocristal violeta iodo(CV-I) pode ser
retirado e as bactérias Gram negativas são descoradas. A
parede celular das bactérias Gram positivas, em virtude de
sua composição diferente, torna-se desidratada durante o
tratamento com álcool, a porosidade diminui, a permeabilidade
é reduzida e o complexo CV-I não pode ser extraído.
COLORAÇÃO DIFERENCIAL PELO MÉTODO DE ZIEHL-NEELSEN (1882)
A coloração de Ziehl-Neelsen é o método para a pesquisa
de bacilos álcool ácido resistentes (BAAR) incluindo-se o
bacilo da tuberculose, o bacilo de Hansen e micobactérias
atípicas. Este método de coloração se baseia na propriedade
das micobactérias de se corarem inicialmente pela
carbolfucsina (a fucsina dissolvida numa solução de fenol-
álcool-água) e resistirem a uma descoloração por álcool-
ácido.
Através desta coloração, podemos visualizar um grupo
restrito de bactérias que possuem sua parede celular
constituída delipídeos em grande concentração, devido a
presença de cêras e ácidos graxos de cadeia longa(ácidos
micólicos), que conferem à célula a característica de álcool-
ácido resistência.
COLETA DO MATERIAL
1- Coletar a amostra, antes da antibioticoterapia.
2- Obter, de preferência o primeiro escarro da manha antes da
ingestão de alimentos.
3- Orientar o paciente para escovar os dentes com água (não
utilizar pasta dental) e enxaguar a boca varias vezes,
inclusive com gargarejos.
4- Respirar fundo, umas oito ou dez vezes, e tossir
profundamente, recolhendo o material no frasco de coleta
estéril.
5- Quando o material produzido for escasso, coletar amostra
após nebulização.
6- Enviar ao laboratório o mais breve possível.
O escarro obtido deve ser purulento. As amostras salivares
são impróprias para análise bacteriológica, pois não são
representativas do processo infeccioso.
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T é cn i ca s d e Co lo raç ã o d e B a c t ér i a s 13
PREPARAÇÃO DO ESFREGAÇO
Colocar as amostras em lâminas (novas e desengorduradas)
com aplicador de madeira. Escolher a partícula mais densa ou
uma mistura da amostra, quando só existirem pequenas
partículas purulentas ou mucosas. E com aplicador estirar a
amostra em 1/3 da lâmina, deixar secar à temperatura ambiente
e fixar como no procedimento anterior.
Técnica:
1)Cobrir toda a lâmina com fucsina fenicada.
2)Com auxílio de uma chama, aquecer a lâmina, pela sua parte
inferior até emitir vapores. Repetir duasvezes esperando o
corante esfriar. Aguardar 5 minutos, não deixando o corante
nem ferver nem secar.
3)Lavar a lâmina com água corrente, suavemente.
4)Inclinar a lâmina descorar com solução álcool ácido
clorídrico, até não sair mais corante.
5)Lavar a lâmina com água corrente.
6)Cobrir o esfregaço com solução de azul de metileno de
Loeffler durante 30 segundos.
7)Lavar a lâmina em água corrente.
8)Deixar secar e observar ao microscópio, com a objetiva de
imersão.
Notas:
1.Na coloração de Ziehl, o aquecimento não deve ser feito
muito intenso, a ponto de ferver o corante, mas apenas até
ligeira emissão de vapores.
2.A coloração de fundo é feita para corar bactérias e outras
estruturas que foram diferenciadas, para o efeito
contrastante ou distinção entre as bactérias e células
presentes no material.
RESULTADO:
Visualizar, esquematizar e classificar as bactérias
existentes nas lâminas. A classificação deverá ser quanto à
resistência ou não das bactérias ao descoramento em álcool
ácido.
Bactérias álcool ácido resistente (BAAR) permanecem
coradas de vermelho pela fucsina.
Bactérias não álcool ácido resistente (BNAAR) não retém
a fucsina, aparecem coradas pelo azul de metileno.
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T é cn i ca s d e Co lo raç ã o d e B a c t ér i a s 14
BAAR por campo microscópico Resultado
Nenhum bacilo em 100 campos
observados
Negativo
Menos de 1 bacilo por campo, em
100 campos observados
+
De 1 a 10 bacilos por campo, em
50 campos observados
++
Mais de 10 bacilos por campo, em
20 campos observados
+++
TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DOS CORANTES DE GRAM
Preparação do Cristal de Violeta:
Cristal violeta 1g
Ácido fênico 2g
Álcool absoluto 10ml
Água destilada 100ml
Triturar num gral de vidro o corante e acrescentar o
álcool. Juntar aos poucos o ácido fênico, misturando sempre,
de modo a obter uma mistura bem homogênea. Juntar a água
pouco a pouco, misturando bem. Filtrar após 24 horas de
repouso, em papel de filtro.
Preparação do Lugol:
Iodo 1g
Iodeto de potássio 2g
Água destilada 300ml
Triturar o iodo com o iodeto de potássio em gral de
vidro. Juntar a água e misturar bem. Preparar em quantidade
que seja usada antes de 30 dias.
Preparação de álcool acetona:
Álcool 800ml
Acetona 200ml
Unir os dois componentes e misturar bem.
Preparação da Fucsina para Coloração de Gram:
Fucsina 2,5g
Álcool etílico 100ml
Água destilada 90ml
A solução estoque (fucsina e álcool etílico) deve ser
preparada unindo-se os dois componentes e misturando bem.
Para usar 10ml da solução em 90ml de água destilada, isto é,
diluir a 10% em água destilada.
Armazenamento de corantes:
Os corantes devem ser estocados em frascos de vidro
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T é cn i ca s d e Co lo raç ã o d e B a c t ér i a s 15
âmbar em local onde as condições ambientais sejam favoráveis,
com temperatura entre 20 e 25ºC (T.A.) e sem teor de umidade.
TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DOS CORANTES DE ZIEHL-NEELSEN
Preparação de Fucsina fenicada:
Fucsina básica 1g
Álcool a 95% 10ml
Fenol fundido 5g
Água destilada 100ml
Dissolver num gral o corante no álcool. Adicionar aos
poucos o ácido fênico, misturando sempre, de modo a obter uma
mistura bem homogênea. Juntar a água pouco a pouco, lavando o
gral.
Filtrar após 24 horas de repouso.
Ácido clorídrico
Álcool 95% 100ml
Ácido clorídrico (dens. 1,19) 1ml
Azul de Loeffler
A)Azul de metileno 10,3g
Álcool a 95% 30ml
B)Solução de hidrato de sódio a 0,01% 1ml
Água destilada 100ml
Misturar A) e B). Diluir 10 vezes em água destilada.
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M e io s d e Cu l t i v o Ba c t er i an o 16
III – MEIOS DE CULTIVO BACTERIANO
Meios de cultivo é uma mistura de nutrientes, sais
minerais e água que propiciam o crescimento in vitro
de bactérias. A constituição de um meio de cultivo é
bastante variada, pois os micro-organismos apresentam uma
ampla diversidade metabólica. Portanto os meios de cultivo possuem
componentes nutricionais variados promovendo o crescimento de
micro-organismos mais exigentes e menos exigentes.
Até 1880 os micro-organismos eram cultivados em meios
líquidos, quando Robert Koch e sua equipe introduziram os meios
sólidos, os quais permitiram o estudo de espécies isoladas
(culturas puras) separando-as de espécies contaminadas.
Os meios de cultivo são utilizados para o isolamento e
identificação de micro-organismos, teste para controle de
esterilização ambiental, análise de alimentos e de água, etc. A
maioria das bactérias cresce em meios de cultura. Exceto as
riquétsias e clamídias por serem parasitas intracelulares
obrigatórios só se desenvolvem in vitro em meios celulares (cultivo
celular).
Basicamente, um meio de cultivo deve conter além de
extrato de carne para o fornecimento de proteínas,
carboidratos e sais, peptona e Cloreto de Sódio.
A preparação dos meios de cultivo pode ser realizada no
laboratório de microbiologia de duas formas:
(1)a partir de seus ingredientes básicos.
(2)a partir dos desidratados disponíveis comercialmente, ou
podem ser comprados prontos para uso em tubos de ensaio ou placas
de Petri.
Didaticamente, os meios de cultivo cultivo podem ser
classificados quanto à consistência, quanto à
procedência, quanto à composição, e quanto à função.
a) Quanto à consistência: os meios podem ser líquido, semi-sólido e
sólido.
 Meio líquido: é aquele em que os nutrientes estão
dissolvidos em aquosa. São os caldos (“broth). É utilizado para
ativação das culturas, repiques de micro-organismos, provas
bioquímicas dentre outros.
 Meio semi-sólido: Esse meio possui na sua composição além dos
nutrientes, ágar (polissacarídeoextraído de algas
marinhas) na concentração de 0,075% a 0,5%. É usado para
 Meio sólido: É um meio que possui na sua composição
nutrientes e uma concentração de 1,0 a 2,0% de Agar e distribuído
em placas,tubos em vertical ou inclinados.
b)Quanto a procedência: os meios podem ser:naturais,
artificiais sintéticos, ou artificiais complexos.
- Meios naturais: São aqueles de origem vegetal (batata,pão)
Animal( gema de ovo, carne, cérebro etc.)
- Meios artificiais sintéticos: São aqueles de composição químicaCreate PDF with GetPDF on Windows 7, Vista, XP, Server 2003, 2008. To remove the mark, buy a license.
definida. Ex: Glicose
- Meios artificiais complexos: São aqueles que se desconhece a
exata composição química. Ex:Extrato de carne.
c) Quanto à função: O meio de cultivo pode ser enriquecedor,
seletivo, diferenciador e de manutenção.
 Meio enriquecedor ou enriquecido: É aquele que t e m s u a
c a p a c i d a d e n u t r i c i o n a l , p e r m i t i n d o o
c r e s c i m e n t o d e m i c r o - o r g a n i s m o s e x i g e n t e s .
E x : B H I , Á g a r s a n g u e , A g a r c h o c o l a t e .
 Meio seletivo: É aquele que contém substâncias que inibem o
crescimento de certos micro-organismos, sem impedir o crescimento
de outros.
Ex: Ágar SS,(Salmonella , Shigella)
 Meio diferenciador ou indicador: É empregado para detectar
colônias bacterianas com propriedades distintas. As
bactérias acidogênicas são conhecidas pela ação da cor do
indicador ácido-base adicionado ao meio.
As bactérias que hidrolisam o amido podem ser conhecidas pelas
zonas claras produzidas nos meios contendo suspensões de amido.
Bactérias hemolíticas são visualizadas pelas
alterações produzidas no ágar sangue.
Os produtores de gás sulfídrico formam uma zona escura de sulfito
de ferro no meio contendo excesso de ferro. Ex: Ágar EMB, Ágar
sangue.
- Meio de manutenção: É um meio utilizado para estocagem de baixo
teor nutritivo para evitar a rápida morte celular, devido a
eliminaçãode substâncias tóxicas resultantes do metabolismo dos
micro-organismos. Ex: Ágar nutriente.
- Meio para crescimento anaeróbico: Como os anaeróbios não
sobrevivem na presença de oxigênio são utilizados meios
especiais denominados meios redutores, esses meios contém
ingredientes como o tioglicolato de sódio, que se combinam
quimicamente com o oxigênio dissolvido e o eliminam do meio de
cultura.
Outros métodos: Jarra de anaerobiose, estufas de dióxido de
carbono.
Preparação:
Um fator que influencia na preparação do meio de cultivo é a
temperatura. Ao preparar um meio de cultivo não podemos manterà
temperatura ambiente uma solução não estéril por
mais de uma hora devido à possibilidade de evaporação da
água decrescimento microbiano.
Alguns componentes são utilizados pelos microrganismos e os
demais, pelo efeito d o crescimento microbiano.Alguns
componentes são utilizados pelos micro-organismos e os
demais, pelo efeito da evaporação,se concentram. Após preparados
os meios devem ser esterilizados pelo processo de esterilização
adequada.
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Técnica:
Preparação de meio líquido: Meio de B.H.I. (Brain-Heart-
Infusion).
Componentes do meio:
Infusão de coração ................... 250g
Infusão de cérebro ................... 200g
Peptona ............................... 10g
Dextrose................................ 2g
Cloreto de Sódio ....................... 5g
Fosfato de Sódio ..................... .2,5g
Água destilada ....................... 100ml
Execução:
a)Adicionar 100ml de água destilada aos ingredientes
previamente pesados;
b)Dissolver o meio aquecendo em chama de bico de Bunsen
ou forno de microondas;
c)Distribuir o meio em tubos 16x16 aproximadamente 10ml
por tubo. Colocar tampão de algodão em cada tubo;
d)Autoclavar (121ºC por 15 a 20 minutos).
Preparação de meio sólido: Meio Ágar nutriente (Ágar Base) ou
Ágar Gelose.
Componentes do meio:
Extrato de Carne ....................... 3g
Peptona ................................ 5g
Ágar .................................. 15g
Água destilada ...................... 1000ml
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M e io s d e Cu l t i v o Ba c t er i an o 18
Conservação dos meios de cultivo
Após preparados, os meios devem ficar à temperatura
ambiente até o esfriamento total. Quando a quantidade de meio
preparado for pequena e de uso imediato (uma semana), deve
ser armazenado em geladeira dentro de sacos plásticos para
evitar desidratação. Quando a quantidade de meio for grande e
não de uso imediato, deve ser distribuído em frascos com
rolha, selados com tampas dealumínio e logo após
autoclavados.
A maioria dos meios de cultura na forma desidratada pode
ser conservada à temperatura ambiente durante anos e outros
que contenham substâncias termolábeis em sua composição são
guardados em geladeiras.
Para usar frascos de meio líquido, abrimos o selo de
alumínio, retiramos a rolha de borracha com cuidados
assépticos e, em ambiente estéril, transferimos o meio para
tubos estéreis (através de pipetas).
Para usar frascos de meio sólido, fundimos o ágar
imergindo o frasco fechado, em banho-maria fervente ou forno
de microondas a temperatura de 100oC. Após a fusão do ágar
abrimos o selo de alumínio, retiramos a rolha de borracha e
transferimos o meio para tubos (através de pipetas estéreis)
ou para placas de Petri e deixamos solidificar a temperatura
ambiente.
TÉCNICAS DE SEMEIO
OBJETIVOS
- Identificação das técnicas de semeadura mais empregadas na rotina
bacteriológica.
- Cultivo de bactérias com finalidade de obtenção de cultura pura,
ou seja, uma população onde todas as bactérias se originam de uma
única célula bacteriana.
Toda manipulação de culturas bacterianas, meios e instrumental
necessário deve ser feita seguindo-se procedimentos básicos de
assepsia visando evitar qualquer tipo de contaminação.
A) Meio inclinado
-Estria sinuosa- semear com alça de platina, em zigue-zague partindo
da base para a extremidade da superfície inclinada do meio, este
tipo de semeadura permite a obtenção de melhor massa de micro-
organismos.
-Em estria reta- semear com agulha de platina, em estria reta,
partindo da base para a extremidade da superfície inclinada do meio,
ou em profundidade e superfície, este tipo de semeio é utilizado em
provas bioquímicas para identificação bacteriana.
B) Meio em pé (camada alta)
- Em picada: com agulha de platina fazer o inóculo penetrar de 0,5 a
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1,0 cm no centro do meio de cultura.
Este tipo de semeadura é bastante utilizado para conservação de
bactérias no meio de cultura e quando o meio de cultura é semi-
sólido é utilizado para a verificação de motilidade.
C) Em placa de Petri
C.1 Em superfície
- Estrias múltiplas ou esgotamento: Fazer o inóculo em um ponto da
superfície do meio, flambar a alça, deixar esfriar e daí semear em
zigue-zague em toda superfície do meio.
Este tipo de semeadura é empregado para isolamento bacteriano,
obtenção de u.f.c. isolados.
- Por distensão: Com pipeta estéril, colocar no centro da superfície
do meio 0,1 ml da suspensão e espalhar uniformimente com Swab ou
Alça de Drigalski. Com swab obteremos crescimento confluente e com
alça de Drigalski, utilizamos para contagem. Usa-se para
determinados testes e antibiogramas.
C.2 Em Profundidade ou Disseminação
- Por Plate: Depositar na placa de Petri 0,1 ml ou 1,0 ml da
suspensão bacteriana . Adicionar 10 ml do meio fundido em tubo de
ensaio e resfriado a 45-50ºC. Homogeneizar com movimentos giratórios
da placa sobre uma superfície plana. Utilizado para isolamento,
contagem, identificação bacteriana, conforme o meio de cultura
utilizado.
D) Repique por pescaria: Colônia em placa de Petri retirada através
de uma agulha para um meio de cultura líquido ou sólido. Método
empregado para isolamento bacteriano.
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I so lam en t o e Id en t i f i c a çã o d e B a c t ér ia s G ram P os i t i v a s 19
IV – ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS
Em se tratando de material clínico para ser submetido a
exame bacteriológico este deve ser colhido antes da
administração de antimicrobianos, porque se a bactéria for
sensível àquele antibiótico, dificilmente ela crescerá nos
meios de cultura. A bactéria poderá estar morta no momento da
colheita ou então ter o seu crescimento inibido pelo
antimicrobiano presente no material clínico.
1- ISOLAMENTO - As bactérias podem ser cultivadas in vitro em
meios de cultura que lhes forneçam todas as condições
nutricionais e ambientais necessárias ao seu crescimento.
As culturas são feitas pela semeadura dos materiais
clínicos em meios sólidos distribuídos em placa de Petri, em
tubos de ensaio ou em outros tipos de frascos.
Depois de semeados os meios devem ser incubados em
temperatura e atmosfera adequadas. O período de incubação
varia de acordo com a velocidade de crescimento da bactéria.
A grande maioria das bactérias pode ser cultivada em 24 a 48
horas. Exceções são feitas para o cultivo de Neisseria (14-
16hs) e Mycobacterium (até 21 dias).
Material para colheita e isolamento:
Abaixador de língua
"Swab"
Ágar sangue
Procedimento:
Transferir a amostra colhida com o "Swab" para um ponto
da superfície do meio distribuído em placa e semear pela
técnica de estrias. Incubar a placa a 37ºC por 24h e fazer a
identificação bioquímica e diferenciação de atividade
hemolítica e enzimática.
2- IDENTIFICAÇÃO:
2-1 Gênero: Streptococcus
As espécies de maior interesse clínico são:
Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae,
Streptococcuspneumoniae.
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I so lam en t o e Id en t i f i c a çã o d e B a c t ér ia s G ram P os i t i v a s 20
Os Streptococcus são identificados de acordo com:
1) Atividade hemolítica
a)b-hemolíticos: quando lisam completamente as hemácias
(in vitro) liberando hemoglobina e formando uma zona clara
ao redor da colônia.
b)a-hemolíticos: quando causam lise incompleta das
hemáceas com liberação de pigmento verde (redução da
hemoglobina) promovendo uma zona esverdeada ao redor da
colônia.
c)g-hemolítico: ausência de atividade hemolítica.
2) Morfologia celular:
Corados pelo método de Gram, aparecem como Gram
positivos esféricos ou lanceolados, de tamanho variável,
isolados ou em grupos formando cadeias curtas ou longas.
3) Diferenciação bioquímica:
São utilizados testes com antimicrobianos para
diferenciação de Streptococcus alfa, beta e gama
hemolíticos, como também são realizados testes
presuntivos para pesquisa de enzimas produzidas
pelos isolados.
4) Composição antigênica
Os estreptococos b-hemolíticos elaboram carboidratos que
são utilizados em reações de precipitação com anti-soro
específico, que possibilita a separação dos grupos. Rebeca
Lancefield padronizou a classificação deste gênero de acordo
com esta composição grupo específicos antigênica da parede
celular.
Estreptococos a-hemolíticos
Utilizar o Teste de sensibilidade a Optoquina para
diferenciar o Streptococcus pneumoniae (sensível a optoquina) de
estreptococos viridescentes (resistente a optoquina), e o Teste
de Solubilidade em Bile. As bactérias solúveis em Bile são da
espécie Streptococcus pneumoniae, as bactérias insolúveis em
Bile são de estreptococcos viridescentes.
Teste de optoquina
Finalidade:
A optoquina (etil-hidrocupreínahidroclorídrica) é um
farmaco solúvel em água que se difunde rapidamente em meio
de cultura sólido. Para este teste, em geral, utiliza-se o
disco de optoquina de6 mm contendo 5 µg da droga. O teste
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tem sensibilidade maior que 95%, sendo considerado de
baixo custo e simples de ser realizado.
Procedimento:
· Preparar uma suspensão do isolado em solução salina a
0,85% estéril com densidade ótica de 0,08 a 0,1 ao
comprimento de onda de 625 nm, ou correspondente a 0,5 da
escala de McFarland;
· Semear a suspensão em uma placa de ágar sangue de carneiro
5% de forma a obter crescimento confluente;
· Após a absorção da suspensão pelo meio de cultura, colocar
um disco de optoquina na superfície do meio semeado, com o
auxílio de uma pinça;
· Incubar a 35±2ºC e 5 - 7% de CO2 por 18 - 24 h;
· Fazer a leitura do halo de inibição do crescimento
bacteriano.
Interpretação:
Presença de halo 14 mm indica que a cultura é sensível à
optoquina, sendo identificado Streptococcus pneumoniae.
Estreptococos â-hemolíticos
Teste da Bacitracina
Finalidade:
O teste tem a finalidade de diferenciar S. pyogenes de outras
cepas do grupo A de outros grupos de Streptococcus â-
hemolíticos (Grupo B, C e G).
Procedimento:
· Um disco de 0,04 U de bacitracina é aplicado a uma placa
de ágar sangue de carneiro que tenha um inóculo com 4 ou 5
colônias puras de Streptococcus spp., a ser testado.
· Incubar 12 horas (overnight) a 35± 2ºC.
Interpretação:
A presença de halo de 10mm inibição ao redor do disco é
interpretado como sensibilidade a bacitracina e indicativo
de S. pyogenes.
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I so lam en t o e I d en t i f i c a çã o d e B a c t ér i a s Gram P o s i t i v a s 22
Teste de Camp
O teste visa a identificação de linhagens de S.
agalactiae (grupo B). Estas linhagens produzem o fator
CAMP (Christie, Atkins e Munch-Petersen) que atua
sinergicamente com a â-hemolisina produzida pelo
Staphylococcus aureus em ágar sangue.
Procedimento:
· Semear um inóculo de Staphylococcus aureus ATCC 25923 (ou
cepa de S. aureus com duplo halo de hemólise) de um ponto
a outro da placa de ágar sangue;
· Semear perpendicularmente (90°) a colônia
de Streptococcus â-hemolítico a ser testada, sem que haja
o contato com a estria de Staphylococcus aureus;
· Incubar a 35±2ºC em atmosfera de 5% de CO2 por 48 h.
Interpretação:
· A formação de uma seta ou meia-lua convergindo para
o S.aureus na intersecção do crescimento das duas
bactérias indica que o teste é positivo e indicativo
de S.agalactiae;
· Se não houver formação de seta ou meia-lua, o teste é
negativo e a cepa não pertence ao grupo B de Lancefield.
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I so lam en t o e Id en t i f i c a çã o d e B a c t ér ia s G ram P os i t i v a s 23
2-2 Gênero Staphylococcus
As três espécies de maior interesse clínico são:
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus saprophyticus.
Morfologia celular
São cocos Gram positivos que podem apresentar-se
isolados ou em pares, em pequenas cadeias ou aglomerados em
cachos.
Identificação e diferenciação
a)Atividade enzimática
Prova de coagulase:
A 0,5ml de plasma de coelho, adicionar 0,1ml de cultura
em caldo. Incubar em banho-maria a 37ºC e verificar a
intervalos de 30 minutos, se há formação de coágulo. O
Staphylococcus aureus é produtor de coagulase.
Staphylococcus epidermidis, não produtor de coagulase, é
usualmente considerado não patogênico mas pode estar
envolvido em certas situações clínicas: endocardite
bacteriana, em cirurgia com prótese, em transplante de medula
e em cateterismo venoso.
b)Sensibilidade a novobiocina
Teste de novobiocina
Preparar uma suspensão em caldo e semear em ágar. Colocar
um disco de novobiocina (5mg), incubar a 37ºC por 24 horas
e verificar a formação de um halo de inibição de 14mm.
Esse teste diferencia o S. saprophyticus (resistente ao
farmacoa) do S. epidermidis (sensível a droga). O S.
saprophyticus é causa relativamente freqüente de infecção do
trato urinário em pacientes jovens.
C) Teste de Fermentação do Manitol
Finalidade:
Verificar se o microrganismo tem a capacidade de fermentar o
manitol contendo 7,5% de cloreto de sódio.
Procedimento:
· Fazer pequenos círculos no ágar com a colônia suspeita;
· Incubar a 35±2ºC por 18 - 24 h.
Leitura:
Formação de halo amarelo ao redor das colônias.
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Interpretação:
· Formação de halo amarelo ao redor das colônias,
identifica Staphylococcus aureus;
· Meio permanece inalterado ao redor das colônias,
identifica Staphylococcus coagulase negativa.
Obs.: Outras espécies de estafilococos, com pouca frequência,
também podem produzir ácido a partir do manitol, portanto também
devem ser testados quanto à produção de coagulase.
d) Teste da Catalase
O teste da catalase é utilizado para diferenciar os
estafilococos (catalase positiva) dos estreptococos (catalase
negativa). Entretanto, existem relatos na literatura
de Staphylococcus aureus catalase negativa relacionados a
processos infecciosos, embora raros, descritos em vários países,
inclusive no Brasil.
Procedimento:
Colocar uma gota de peróxido de hidrogênio (água oxigenada) 3%
sobre uma lâmina;
Com auxílio de fio bacteriológico, agregar a colônia em estudo
na gota de peróxido de hidrogênio.
INTERPRETAÇÃO
Positivo: Presença imediata de bolhas - a produção de
efervescência indica a conversão do H2O2 em água e oxigênio
gasoso.
Negativo: Ausência de bolhas ou efervescência.
RECOMENDAÇÕES
Evitar o uso de meios contendo sangue, pois os eritrócitos
podem produzir reação fraca de catalase.
Para controle utilizar outra linhagem de Staphylococcus para ocontrole positivo e como controle negativo Streptococcus spp.
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Antibiograma: Técnicas de Preparação e Interpretação 22
V – ANTIBIOGRAMA: TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO E INTERPRETAÇÃO
Introdução:
A análise da sensibilidade das bactérias aos agentes
antimiccrobianos está relacionada à várias técnicas ou
métodos laboratoriais in vitro utilizados para determinar a
sensibilidade e a resistência de determinado microrganismo a
antimicrobianos.
DETERMINAÇÃO DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS EM BACTÉRIAS
A identificação de bactérias isoladas de espécimens
clínicas necessita de teste complementar para determinar o
perfil de sensibilidade daquela espécie frente a
quimioterápicos antimicrobianos (Antibiograma). As drogas
disponíveis no combate àquela infecção, são estudadas por
grupos (aminoglicosídeos, betalactâmicos, fluorquinolonas,
macrolídeos, peptídeos e sulfas) e em concentrações
padronizadas (proporcionais às concentrações atingidas no
soro de pacientes em tratamento) obtidas por estudo "in
vitro". Drogas que mostraram-se inibidoras para determinado
isolado bacteriano são selecionadas pela seletividade tóxica,
efeitos secundários, facilidade de administração (oral e
parenteral), epelos custos do tratamento. Várias técnicas
foram desenvolvidas mas a metodologia desenvolvida por Kirby,
Bauer & Turck (1966) é utilizada mundialmente por apresentar
resultados rápidos e seguros.
Um segundo tipo de teste de sensibilidade é realizado
utilizando-se espécies não patogênicos, para fins de pesquisa
básica, quando se deseja estudar mecanismos de ação das
drogas ou modelos de resistência antimicrobiana ou ainda para
marcar uma população. Neste caso, são determinados os grupos
de drogas e a concentração mínima inibitória (CMI) por método
quantitativo.
Objetivos:
1) Avaliação da atividade e
agentes antimicrobianos;
do espectro de ação de novos
2) Nos estudos de populações
padrão de sensibilidade
bacterianas, para estabelecer o
sob o efeito seletivo de
antimicrobianos;
3) Como marcadores epidemiológicos.
Fundamento: Substâncias antimicrobianas são incorporadas ao
meio de cultivo (líquido ou ágar), emconcentrações
inibitórias para aqueles organismos sensíveis. A concentração
é dada em µ g/ml ou Unidades Internacionais(UI).
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Métodos:
Antibiograma: Técnicas de Preparação e Interpretação 23
1.Qualitativo - Pesquisa que grupos de drogas antimicrobianas
são bactericidas para determinada espécie bacteriana numa
determinada concentração. Ex.: Técnica de Kirby
Bauer(1966).
2.Quantitativo - Pesquisa que concentração de determinada
droga antimicrobiana é inibitória para uma espécie
bacteriana isolada. Determinação da concentração mínima
inibitória (CMI).
Método de difusão com disco (Técnica Kirby Bauer):
Difusão da droga, sob forma de disco ou comprimido na
superfície do meio sólido.
1. Padronização do inóculo bacteriano:
A partir da placa original da cultura bacteriana do
microrganismo a ser testado são transferidas 4 a 5 colônias
para um meio de cultura líquido (Caldo-Soja-Caseína, Caldo
BHI, caldo Mueller-Hinton). Em seguida, incuba-se durante 2 a
4 horas. A densidade do inóculo deve ser comparada com a
escala de turbidez de McFarland (ácido sulfúrico + cloreto de
bário), equivalente a 104 bactérias por ml de meio.
2. Semeio: Realizado através de “swab” estéril embebido no
inóculo bacteriano e passado em toda a área da superfície do
meio ágar Mueller-Hinton (crescimento confluente). Deixar
secar por 2 minutos.
Com auxílio de uma pinça estéril colocar sob a
superfície do meio inoculado os discos de antibióticos em
pontos eqüidistantes (30 mm).
Incubar a temperatura ideal para o crescimento daquela
população bacteriana por 18-24h.
Leitura: Observar halo de inibição em torno do disco de
antimicrobiano. O diâmetro deste halo é medido em mm
(halômetro) e comparado com a tabela recomendada pelo C L S I
(Clinical Laboratory Standards Institute, 2010). Para cada
agente antimicrobiano, o diâmetro dohalo poderáser
interpretado como sensível (S), resistente (R) ou
intermediário (I).
Utilização de Drogas de baixa difusão: moléculas grandes e
polarizadas. Considerar pequenos halos como sensíveis.
Drogas de alta difusão: moléculas pequenas e apolares.
Considerar halos com maiores diâmetros que os padrões.
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Antibiograma: Técnicas de Preparação e Interpretação 24
Considera-se uma população sensível a determinada droga
quando esta população é inibida por concentração três ou mais
vezes inferior a concentração que a substância atinge no
sangue. Amostras resistentes são inibidas por concentrações
intermediárias.
Ex.: Droga X atinge concentração sérica de
32µ g/ml. Populações que são inibidas por
8µ g são consideradas sensíveis e aquelas inibidas
por concentrações acima de 16µ g
consideradas resistentes.
Fatores Intervenientes capazes de alterar a interpretação:
1.Utilização de meio muito ricos ou muito pobres em
composição de "simular" falsos microrganismos resistentes ou
sensíveis.
2.Utilização de inóculos muito concentrados (densos) e
formação de tapetes de células mortas entre bactérias vivas e
a droga.
3.Para algumas infecções como difteria (C. diphteriae),
meningite meningocócica não são realizados antibiogramas.
Utilizam-se drogas de escolha.
4.Devido a variabilidade de marcas de resistência a
drogas devem ser realizados sempre nas bactérias
Enteropatogênicas (Salmonella, Shigella, E. coli
soropatogênicas e para Mycobacterium tuberculosis).
5.Observar a concentração da droga que impregna o papel
de filtro que compõe o disco ou comprimido.
6.Observar prazo de validade das drogas ensaiadas.
Seleção de substâncias antibióticas:
Bactérias gram positivas: Penicilina, Eritromicina,
Clindamicina, Gentamicina e Tetraciclinas. Para
Staphylococcus não precisa testar Ampicilina e Carbenicilina
(Produtores de betalactamases). A meticilina representa
betalactâmico (penicilina) não degradada pela betalactamase.
Bactérias gram negativas (Enterobacteriaceae):
Ampicilina, Cefalosporinas, Gentamicina, Tetraciclinas,
Cloranfenicol, Trimetoprim + Sulfametoxisazol e Amoxacilina.
Infecções urinárias: Ampicilina, Ac. Nalidíxico,
Nitrofurantoínas, Cefalosporinas, Sulfas e Fluorquinolonas.
Para infecções por Pseudomonas sp.: Carbenicilina,
Gentamicina, Tobramicina, Pipraciclina e Amicacina.
Para infecções por cêpas de Anaeróbios: Bacteróides,
Peptococos, Fusobactérias e Clostrídios: Clindamicina,
Metronidazol, Rifampicina, Vancomicina e Tetraciclinas.
Microrganismos de referência
Mantenha culturas-estoques de S. aureus (ATCC25923) e E.
coli (ATCC25922).
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Antibiograma: Técnicas de Preparação e Interpretação 25
Teste esses microrganismos de referência, pelo método
que foi descrito, usando discos de antibióticos
representativos daqueles a serem empregados no teste de
isolados clínicos.
Comparações de resultados para os microrganismos-
controle de teste para teste oferecem uma verificação na
reprodutibilidade do processo do teste e na credibilidade dos
discos-teste.
Limitações do método
O método de interpretação descrito aqui se refere a
patógenos de crescimento rápido e não deve ser aplicado a
microrganismos de crescimento lento, para os quais os
critérios dos halos não são apropriados. E para antibióticos
que se difudem lentamente em ágar, ex: polimixina B.
Método Quantitativo
E-test: Teste epsilométrico, método de difusão mais avançado
que permite estimar a concentração mínima inibitória (CMI),a mais
baixa concentração de antibiótico que impede o crescimento
bacteriano. Uma tira revestida de plástico contendo um gradiente de
concentração do antimicrobiano, e a CMI pode ser lida em uma escala
impressa na tira.
Etapas para realização da técnica:
As etapas iniciais são semelhantes à técnica de Kirby Bauer, como a
preparação do inoculo bacteriano e semeio. As fitas do E-test
consiste numa fita plástica fina, inerte e não porosa de 5mm largura
e 50mm de comprimento. Um lado da fita é marcado com uma escala de
leitura de CIM em mcg/ml. Um código de letras designa a identidade
do antibiótico. Um gradiente exponencial pré-definido do fármaco
seco e estabilizado é mobilizado no outro lado da fita, com uma
concentração máxima em "a" e mínima em "b", como demonstrado na
Figura abaixo.
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Antibacteriano Símb. Conc.
disco
Zonas de inibição (em mm)
Resistente Interme
diário
Sensível
Amicacina AM 30mcg 14 ou menos 15-18 17 ou mais
Ampicilina ao
testar
microrganismos
Gram-negativos e
enterococos
AP 10mcg 11 ou menos 12-13 14 ou mais
Ampicilina ao
testar
estafilococos e
microrganismos
sensíveis à
penicilina G
AP 10mcg 20 ou menos 21-28 29 ou mais
Ampicilina ao
testar Haemophilus
sp.
AP 10mcg 19 ou menos 20 ou mais
Bacitracina BC 10un. 8 ou menos 9-12 13 ou mais
Carbenicilina ao
testar Proteus sp.
E E. coli.
CR 100mcg 17 ou menos 18-22 23 ou mais
Carbenicilina ao
testar Pseudomonas
aeruginosa
CR 100mcg 13 ou menos 14-16 17 ou mais
Cefalotina ao
relatar
sensibilidade a
todas as
cefalosporinas
CF 30mcg 14 ou menos 15-17
18 ou mais
Clindamicina ao
relatar
sensibilidade à
clindamicina e à
lindomicina
CL 2mcg 14 ou menos 15-16 17 ou mais
Cloranfenicol
Colistidina
Eritromicina
Estreptomicina
Gentamicina
Konanilcina
Nalidíxico, ácido
Neomicina
Nitrofurantoína
Novoblocina
Oxocilina
CO
CL
EL
ET
GN
KN
AN
NO
NT
NV
OX
30mcg
10mcg
15mcg
20mcg
20mcg
30mcg
30mcg
30mcg
300mcg
30mcg
6mcg
12 ou menos
8 ou menos
13 ou menos
11 ou menos
12 ou menos
13 ou menos
13 ou menos
12 ou menos
14 ou menos
17 ou menos
9 ou menos
13-17
9-10
14-17
12-14
13-14
14-17
14-18
13-16
15-16
18-21
10-13
18 ou mais
11 ou mais
18 ou mais
15 ou mais
15 ou mais
18 ou mais
19 ou mais
17 ou mais
17 ou mais
22 ou mais
14 ou mais
Penicilina G. ao
testar
Estafilococos
PN 10un. 20 ou menos 21-28 29 ou mais
Penicilina G. ao
testar outros
microrganismos
PN 10un. 11 ou menos 12-21 22 ou mais
Penicilina G. PL 50un. 8 ou menos 0-11 12 ou mais
Sulfazotrin
(Sulfatomoxazol +
Trimetoprin)
SFT 25mcg 10 ou menos 11-15 16 ou mais
Sulfonamidas
Tetraciclina
Tobramicina
Vancomicina
SF
TT
TB
VC
300mcg
30mcg
10mcg
30mcg
12 ou menos
14 ou menos
12 ou menos
9 ou menos
13-16
15-18
13-14
10-11
17 ou mais
19 ou mais
15 ou mais
12 ou mais
Antibiograma: Técnicas de Preparação e Interpretação 26
Tabela 1.
Limites para interpretação do antibiograma com 24
antibacterianos de uso corrente na terapêutica clínica.
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VI – ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS
As bactérias gram-negativas incluem vários gêneros de
bacilos fermentadores de carboidratos(Enterobactérias;
família Enterobacteriaceae ) ou não fermentadores de
carboidratos (Ex.:Pseudomonas, Acinetobacter). As
enterobactérias (Ex: Escherichia coli, Klebsiella,
Enterobacter, Hafnia, Shigella, salmonella, Proteus,
Serratia, etc.)são os bacilos mais freqüentemente isolados
de amostras clínicas em laboratórios de microbiologia. Esses
bacilos estão amplamente distribuídos nanatureza e são
encontrados principalmente no trato intestinal do
homem e de animais. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae
e Pseudomonas aeruginosa são as bactérias gram-negativas mais
envolvidas em infecções hospitalares.
A identificação das bactérias Gram-
negativas baseiam-se principalmente em reações bioquímicas
que ocorrem nos meios de cultura, resultantes do metabolismo
bacteriano.
1 - ISOLAMENTO
Para o isolamento dos bacilos gram-negativos são
utilizados principalmente meios seletivos diferenciais.
a) Meios de isolamento
Ágar salmonella Shigella (SS), Ágar Hektoen (HE), Ágar
MacConkey, Ágar Verde Brilhante, Ágar Eosina Azul de Metileno
(EMB), Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD) e Ágar Bismuto
Sulfito, etc.
b) Técnica de semeio para isolamento
Transferir o inóculo bacteriano para um ponto da
superfície do meio de cultivo distribuído em placa e semear
pela técnica de estrias utilizando a alça de platina
flambada. Incubar a placa a 37oC por 18-24h e fazer a
diferenciação e identificação bioquímica.
2 - IDENTIFICAÇÃO (Provas bioquímicas)
2-1. Fermentação de carboidratos (lactose, sacarose,
glicose)
Nos sistemas de provas bacteriológicas o processo de
fermentação é detectado por observação visual das mudanças de
cor dos indicadores de pH do meio quando os produtos ácidos
são formados pelas bactérias.
a) Princípio
Os testes de fermentação de carboidratos determinam a
capacidade de um microrganismo em hidrolizar determinado
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açúcar, incorporado numa concentração de 0,5 a 1,0% em meio
base de vermelho de fenol, produzindo ácidos com ou sem gás.
Todas as enterobactérias fermentam a glicose pela via Embden-
Meyerhof, formando ácido pirúvico.
b) Meio: base de vermelho de fenol
Indicador de pH: Vermelho de fenol
Ácido (cor amarela) - pH < 6,8
Alcalino(cor vermelha)-pH >8,4
Neutro (cor laranja) - pH = 7,4
c) Técnica
Transferir, com alça de platina estéril, uma colônia
bacteriana isolada para o meio líquido vermelho de fenol
adicionado do carboidrato a ser fermentado. Incubar a 37oC
por 18-24h.
d) Resultado
POSITIVO: cor amarela -- presença de ácido (carboidrato
fermentado)
NEGATIVO: cor vermelha -- ausência de ácido (Carboidrato
não fermentado)
2-2 Teste TSI (Ágar Tríplice-açúcar-ferro)
a) Princípio
No meio TSI distribuído em tubos de ensaio observa-se a
fermentação ou não dos açúcares (lactose, glicose e sacarose)
pelas bactérias Gram-negativas, com produção ou não de gás
CO2. Também pode se observar a formação de H2S (gás sulfídrico
ou sulfeto de hidrogênio) pela sua reação com o sulfato
ferroso (presente no meio TSI), resultando num precipitado de
sulfeto ferroso que se manifesta por uma reação visível de
cor negra.
b) Meio TSI
Neste meio, além do ágar e das fontes de carbono e de
nitrogênio, também estão presentes o tiossulfato de sódio que
é uma fonte de enxofre para a produção de H2S e o indicador
de pH vermelho de fenol,que já foi visto no tópico anterior.
c) Técnica
Transferir a colônia bacteriana isolada para o meio TSI,
utilizando-se a agulha de platina flambada. A inoculação
deverá ter a profundidade de 2/3 do meio em uma única picada.
Em seguida, fazem-se estrias na superfície inclinada. Incubar
a 37oC por 18-24h.
d) Resultado e interpretação
O resultado é obtido pela visualização da mudança de cor
no pico (superfície inclinada) e no fundo (profundidade) do
tubo de ensaio contendo o ágar TSI:
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• Pico alcalino/fundo alcalino - Ausência de fermentação dos
açucares. Ex: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter.
• Pico alcalino/fundo ácido - Fermentação apenas da glicose.Ex: Shigella.
• Pico alcalino/fundo ácido e negro - Fermentação da glicose
e produção de H2S. Ex: Salmonella, Proteus, Citrobacter.
• Pico ácido/fundo ácido - Fermentação dos três açucares. Ex:
Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia e outros
componentes do grupo coliforme.
2-3. Teste de Motilidade
a) Princípio e meio
O meio de cultivo apropriado para teste de motilidade
bacteriana deve ser semi-sólido (0,5% de agar) para permitir
a difusão de bactérias móveis. O meio SIM (S= H2S,I=Indol,
M=Motilidade)é um dos meios utilizados para o teste de
motilidade, como também para o teste de indol que será visto
em seguida.
b) Técnica
Inocular em uma única picada a colônia bacteriana
isolada no meio, utilizando-se a agulha de platina estéril.
Incubar a 37oC por 18-24h.
c) Resultado
A motilidade bacteriana é detectada pelo exame
macroscópico do meio para se observar uma zona de crescimento
difuso (turbidez) que parte da linha de inoculação feita com
a agulha de platina.
2-4. Teste do Citrato
a) Princípio
Determinar se um microrganismo é capaz de utilizar o
citrato como única fonte de carbono para seu metabolismo e
crescimento. Se o citrato for utilizado, o nitrogênio
(do fosfato de amônia) presente no meio também será, havendo
liberação da amônia com a conseqüente alcalinização do meio.
b) Meio: Ágar Citrato de Simmons
Este é um meio sólido no qual a única fonte de carbono é
o citrato de sódio (obs: não contém proteínas ou carboidratos
que são fontes de carbono,tendo como indicador de pH o azul
de bromotimol.
c) Técnica
A bactéria em estudo é inoculada na superfície do ágar
inclinado em tubo fazendo-se estrias na superfície do meio,
utilizando-se a alça de platina flambada. Incubar a 37oC por
18-24h ou até 3 dias, se necessário.
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d) Resultado
POSITIVO: meio azul (alcalino) - Utilização do citrato
NEGATIVO: meio verde (neutro) - Não utilização do citrato
2-5. Teste da lisina descarboxilase
a) Princípio
Determinar a habilidade enzimática de uma determinada
bactéria em descarboxilar o aminoácido lisina, com a
subsequente alcalinização do meio devido a formação de amina
alcalina (cadaverina).
b) Meio LIA (Ágar lisina ferro)
Este meio contém como indicador o púrpura de
bromocresol:
c) Técnica
Ácido: cor amarela -- pH < 5.2
Neutro a básico: cor púrpura -- pH = 6.8
A bactéria teste é inoculada em uma única picada no meio
LIA em tubo de ensaio, utilizando-se uma agulha de platina
estéril. Em seguida, fazem-se estrias na superfície
inclinada. Incubar a 37oC por 24h.
d) Resultado
POSITIVO: meio púrpura (alcalino) - Ocorreu a descarboxilação
da lisina e conseqüente formação de aminas.
NEGATIVO: meio amarelo (ácido) - Não ocorreu a descarboxilação
da lisina. A acidificação do meio ocorre porque a bactéria
fermenta uma pequena quantidade de glicose presente no meio.
2-6. Teste de Indol
a) Princípio
Determinar a habilidade do organismo em produzir o indol
(benzil pirrol) a partir da molécula de triptofano ou
outros aminoácido presentes no meio SIM. Quando ocorre a
degradação deste aminoácido por bactérias que possuem a
enzima triptofanase ocorre a formação de: Indol,
ácido pirúvico e amônia. Este teste é útil para diferenciar a
E.coli (indol positiva) de outras enterobactérias.
b) Meio e reativo
• Meio SIM
• Reativo de Kovac ou Reativo de Ehrlich Composição: p-
dimetilaminobenzaldeído, HCL concentrado, álcool
isoamílico (Kovac), álcool etílico absoluto (Ehrlich).
c) Técnica
Inocular com agulha de platina o meio SIM com a
bactéria em estudo e incubar a 37oC por 18-24h.
Em seguida,adicionar gotas do reativo Ehrlich ou de Kovac
no tubo.
d) Resultado
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O desenvolvimento de uma cor vermelha na superfície do
meio após a adição do reativo indica a presença de indol e
uma prova positiva. A cor vermelha aparece na camada de
álcool quando o indol produzido reage com o p-
Dimetilaminobenzaldeído presente nos reativos de Ehrlich ou
de Kovac.
2-7. Teste de urease
a) Princípio
Determinar a habilidade de um microrganismo em degradar
enzimaticamente a uréia pela urease com a formação de duas
moléculas de amônia (NH3), resultando na alcalinização do
meio.
b) Meio caldo uréia
Este meio tem como indicador de pH o vermelho de fenol,
já visto anteriormente.
c) Técnica
Inocular o caldo uréia com uma alça de platina carregada
de cultura pura do organismo em estudo. Incubar a 37oC por
18-24h, ou até 48h se necessário.
d) Resultado
POSITIVO: meio rosa (alcalino) - Presença de urease
NEGATIVO: meio amarelo (neutro) - Ausência de urease
3 – MÉTODOS RAPIDOS DE IDENTIFICAÇÃO
3-1. Sistema API 20E (bio Mérieux) – Identificação de
Enterobactérias
O sistema de identificação API 20E consiste em tiras
plásticas com 20 compartimentos miniaturizadas que contêm os
substratos desidratados (meio de identificação bioquímica) e
uma câmara plástica de incubação com tampa frouxa. Cada
compartimento possui um pequeno orifício superior através do
qual a suspensão bacteriana diluída em solução salina ou água
destilada estéril pode ser inoculada com uma pipeta. A ação
bacteriana sobre o substrato produz mudança de cor que é
interpretada visualmente em 24 horas a 35ºC. O fabricante
fornece folhas de trabalho para registro das interpretações
visuais das reações coloridas, que em seguida são convertidas
em número do biótipo de 7 dígitos, levando a identificação da
espécie bacteriana.
Os 20 substratos incluídos para identificação de
enterobactérias são: ONPG, arginina diidrolase, lisina
descarboxilase, ornitina descarboxilase, citrato, sulfeto de
hidrogênio, urease, triptofano desaminase, indol, Voges-
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Proskauer, gelatina, glicose, manitol, inositol, sorbitol,
ramnose, sacarose, melibiose, amigdalina, arabinose.
Pelo sistema API 20E são identificadas mais de 100
espécies de bactérias gram-negativas. Esse sistema é um dos
mais utilizados nos laboratórios clínicos e de pesquisa.
Obs: Também são comercializados outros sistemas API para
identificação de bactérias Gram-positivas.
3-2. Sistema VITEK (SISTEMA AUTOMATIZADO)
O sistema VITEK (bio Mérieux) é um sistema
computadorizado que consiste em um módulo gerador de vácuo,
leitor-incubador, computador-impressora e um monitor de
computador. Este sistema é utilizado com cartões de teste
VITEK para identificação bacteriana e provas de
susceptibilidade a antibióticos, totalmente automatizadas.
Este sistema permite a identificação de enterobactérias em 8
horas, sendo aceito como um método confiável para
identificação rápida de bacilos gram negativos nos
laboratórios de microbiologia clínica.
Cada cartão de identificação possui 30 testes
bioquímicos que não necessita adição de reagentes, evitando
erros. VITEK é capaz de detectar mais de 300 espécies de
microrganismos (bactérias gram-negativas e gram-positivas e
leveduras).
Tabela de Identificação Bioquímica de Enterobactérias
Indol + -/+ - - - -/+ - - - - + - + + +
Citrato de Simmons - - d + + + + + +/- + d + - + -
H2S (TSI) - - + + +/- - - - - - + + - - -
Urease - - - - dw +w +w - - dw + + + + -
Motilidade +/- - + + + - + + + + + + + + +
Lisina d - + + - + - + + + - - - - -
Ornitina d d + + d - + + + + - + + - -
Glicose + + + + + + + + + +/- +/- + d -/+ -
Lactose + - - d d + + + -/+ -/+ - - - - -
Sacarose d - - - d + + + d + + d - d d_
(+) positivo,( - ) negativo, (d) positiva tardia, reação pode ocorrer em até 72h, (w) reaçãofraca, (+/-) maioria positiva,
(-/+) maioria negativa
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A sp e c t o s Mi c ro sc óp i co s e Ma c ro s có p ic o s do s F ung o s 33
VII – ASPECTOS MICROSCÓPICOS E MACROSCÓPICOS DOS FUNGOS
Os fungos são organismos eucarióticos, heterotróficos,
obtendo sua alimentação a partir de matéria orgânica
inanimada ou nutrindo-se como parasitas de hospedeiros vivos.
Estes microrganismos causam doenças humanas, em animais e
vegetais. De um modo geral, os fungos incluem os bolores (ou
mofos) e as leveduras. Os bolores são filamentosos e
pluricelulares e as leveduras se apresentam sob forma
unicelular.
Conhecer os aspectos microscópicos e macroscópicos dos
fungos é de extrema importância para a identificação destes
organismos que são agentes etiológicos de processos
infecciosos, de reações de hipersensibilidade imediata e
tardia e produtores de micotoxinas.
A coleta do material é o primeiro passo para
obtenção de um resultado laboratorial confiável. Deve-se
sempre questionar o paciente em relação ao uso de medicações
antifúngicas tópicas e/ou sistêmicas. Caso o paciente esteja
fazendo uso da medicação, o mesmo deverá ser orientado a
suspendê-la por um período de 15 dias, em caso de uso tópico
e 1 mês, quando se tratar de drogas de uso sistêmico. Esta
suspensão deve ser realizada com autorização médica.
É de grande importância que todos os espécimes
clínicos encaminhados para diagnóstico laboratorial, venham
acompanhados de uma ficha, que contenha no mínimo as
seguintes informações: identificação e procedência do
paciente, tempo de evolução da lesão, localização e aspectos
clínicos da lesão, possíveis contatos com animais e solo, uso
de drogas.
1)ASPECTOS MICROSCÓPICOS DOS FUNGOS
1.1- Exame microscópico direto
O diagnóstico microbiológico e imunológico das micoses
pode ser feito pelo exame microscópico direto, exame
histopatológico, cultivos, testes intradérmicos, pesquisa de
anticorpos séricos e de antígenos. O exame microscópico
direto é o método mais usado no diagnóstico de rotina das
micoses por ser rápido e sensível, permitindo a visualização
do fungo e em muitas ocasiões, sua identificação. É
importante salientar que a realização do cultivo
paralelamente ao exame direto é imprescindível para um
completo diagnóstico laboratorial micológico.
A técnica de preparação para o exame direto, varia de
acordo com o material biológico a ser investigado e da
suspeita clínica da etiologia do processo.
 Preparação do exame direto com amostras clínicas densas
(p.ex.: escamas epidérmicas, ungueais e pêlos):
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A sp e c t o s Mi c ro sc óp i co s e Ma c ro s có p ic o s do s F ung o s 34
a) Clarificar a amostra clínica, já sobre a lâmina, com 1 gota
da solução de hidróxido de potássio (KOH) a 10-20%;
b) Aquecer suavemente a lâmina na chama do bico de Bunsen; o
calor juntamente com o KOH vai dissolver a queratina
presente na amostra, clareando o material de fundo; esperar
10 minutos, tempo necessário para clarear o material de
fundo.
c) Corar o material com 1-2 gotas de lactofenol azul-algodão
(ou azul de Amann);
d) Cobrir com lamínula;
e) Examinar ao microscópio com objetiva de 40X.
Exemplos de algumas características morfológicas dos
fungos:
célula brotante
Pseudo-micélio Hifa cenocítica Hifa septada
Hifa artrosporada
Epidermophyton sp Microsporum sp Trichophyton sp
A- Macroconídeos
B- Microconídeos
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A sp e c t o s Mi c ro sc óp i co s e Ma c ro s có p ic o s do s F ung o s 35
 Preparação da lâmina a partir do cultivo de fungos:
a) Colocar 1 a 2 gotas do corante lactofenol azul-algodão;
b) Retirar uma pequena porção da colônia (do micélio
reprodutivo ou aéreo, no caso dos fungos filamentosos) e
colocar sobre a lâmina;
c) Cobrir com lamínula;
d) Observar ao microscópio com objetiva de 40X.
Após o preparo da lâmina podemos visualizar os aspectos
microscópicos dos fungos.
Observações:
9 As amostras de consistência líquida e relativamente claras
podem ser examinadas diretamente ao microscópio após a
mistura em uma gota de solução salina em lâmina de vidro.
9 A utilização do corante lactofenol azul-algodão é
importante porque o fenol inviabializa os microrganismos
vivos e o azul-algodão cora a quitina, presente nas paredes
das células fúngicas.
1.2- Aspectos microscópicos dos fungos filamentosos ou bolores
O fungo filamentoso se origina a partir de um esporo,
que emite um filamento tubular microscópico, chamado hifa,
que posteriormente se ramifica formando um conjunto de hifas
denominado micélio, que pode ser vegetativo ou reprodutivo
(aéreo). Algumas hifas apresentam paredes transversais ou
septos e são chamadas hifas septadas, outras não possuem
septos e são chamadas hifas cenocíticas .
Microscopicamente, os bolores são identificados
principalmente pelos tipos de esporos, corpos de frutificação
e hifas. Os esporos são muito importantes na classificação
dos fungos, sendo as classes diferenciadas, primariamente,
pelas características morfológicas dos esporos.
A análise conjunta das características microscópicas,
em geral, permite a classificação genérica do fungo. A
definição da espécie, geralmente, é tarefa de laboratórios de
referência.
1.3- Aspectos microscópicos das leveduras
Como leveduras, os fungos apresentam-se unicelulares
com forma oval ou arredondada. A reprodução assexuada das
leveduras ocorre principalmente por gemulação ou brotamento.
Algumas vezes, após a gemulação, as leveduras e as células-
filhas ficam aderidas, formando uma estrutura conhecida como
pseudomicélio (p.ex., Candida). As leveduras também podem se
reproduzir sexuadamente através de ascosporos ou
basidiosporos. Portanto, aobservação microscópica de
estruturas assexuadas e sexuadas é bastante empregada na
identificação genérica das leveduras.
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A sp e c t o s Mi c ro sc óp i co s e Ma c ro s có p ic o s do s F ung o s 36
2) ASPECTOS MACROSCÓPICOS DOS FUNGOS (Observação macroscópica
das colônias em meio sólido).
Ao contrário do que se verifica no estudo das
infecções bacterianas, em que o cultivo é o principal método
diagnóstico, nas infecções fúngicas ele é um complemento do
exame microscópico direto. As razões que podem contribuir
para isso, são o crescimento lento dos fungos e as
dificuldades para cultivar alguns deles.
O isolamento primário, seguido da correta
identificação dos agentes etiológicos, é uma condição
indispensável para o diagnóstico laboratorial das micoses, e,
para tanto, a escolha do meio de cultura adequado é uma
tarefa de extrema importância.
Uma ampla variedade de meios de cultura pode ser
utilizada num laboratório de micologia, atendendo a diversos
fins, tais como: isolamento primário do fungo a partir dos
espécimes clínicos, a identificação taxonômica dos gêneros e
espécies, a estocagem e manutenção em micoteca, e, mais
recentemente a execução de testes de susceptibilidade frente
a diferentes antifúngicos.
A seleção do meio a ser empregado deve, basicamente,
levar em consideração o tipo de amostra biológica a ser
semeado e a suspeita clínica.
Apesar da variedade de meios de cultivo
disponíveis(muitos vendidos pronto para uso, outros
preparados artesanalmente), o ágar Sabouraud ainda é o meio
mais utilizado dentro de um labotatório de micologia. A esse
meio podem ser acrescidos muitos inibidores,tais como o
cloranfenicol e a cicloeximida, objetivando otimizar o
isolamento em espécimes clínicas possivelmente contaminadas
por bactérias e fungos anemófilos (fungos que apresentam

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