Coloração GRAM e Ziehl-Neelsen

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COLORAÇÃO DIFERENCIAL (GRAM) 
 
1. Transferir, com alça de platina, uma porção de cultura, 
para tubos Eppendorf contendo 0,5 mL de água 
destilada. Agitar no vórtex; 
 
2. Espalhar a suspensão celular sobre uma lâmina de vidro 
desengordurada, com auxílio de alça de platina. Secar ao ar; 
 
 
 
 
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3. Fixar cada esfregaço pelo calor, passando rapidamente a 
lâmina contendo o esfregaço sobre a chama do bico de 
Bunsen. Repetir este procedimento duas ou três vezes; 
 
ALTERNATIVA: utilizar vermelho de metila que já contém fixador 
químico, dispensando assim, a fixação do esfregaço em chama 
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4. Cobrir o esfregaço da cultura (previamente fixado à lâmina 
de vidro) com uma solução de Violeta de cristal (desuso) - 
1 min/Violeta de metila (em uso) - 15 s. 
 
 
 
Nota: Após este passo, todas as células ficam coradas com 
 o violeta (corante primário). 
 
 
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 5. Escorrer o corante e lavar com água (LAVAGEM NÃO 
OBRIGATÓRIA). Cobrir a preparação com Lugol e aguardar 1 
minuto. 
 6. Escorrer a solução de Lugol, lavar com água (LAVAGEM 
NÃO OBRIGATÓRIA) e secar; 
 
Lugol é um mordente 
(fixador), que tem iodo em 
sua composição. O iodo 
reage com o corante cristal 
violeta formando um 
complexo denominado 
IODOPARAROSANILINA 
que fica aprisionado na 
camada de peptideoglicana 
nas Gram positivas. 
Nota: 
O iodo da solução de Lugol forma um complexo insolúvel com o 
corante primário. O complexo violeta de cristal-iodo VC-I 
(iodopararosanilina) tem uma cor mais intensa (violeta escuro) 
do que o VC livre e é mais díficil de remover das células. 
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 7. Adicionar solução de álcool gota a gota sobre a preparação 
 até que não saia mais corante. 
 
Nota: 
As bactérias Gram - perdem o complexo VC-I e as Gram + 
retêm-no. As primeiras ficam incolores e as últimas coradas 
de violeta-escuro 
 8. Lavar com água (LAVAGEM OBRIGATÓRIA), escorrer e 
secar com papel de filtro. Corar a preparação, durante 5 minutos, 
com uma solução de safranina ou fucsina 
 
Nota: 
As células incolores de bactérias Gram negativas ficam coradas 
de cor-de-rosa (cor do contra-corante safranina). 
 
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9. Escorrer o corante, lavar com água (LAVAGEM OBRIGATÓRIA) 
e secar com papel de filtro 
 
10. Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço; 
 
11. Leia em objetiva de imersão (100 X). 
 
Streptococcus oralis Bacillus subtilis 
E. coli Neisseria gonorrhoeae 
Gram + Gram + 
Gram - Gram - 
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COLORAÇÃO DIFERENCIAL (ZIEHL NIELSEN) 
Coloração diferencial importante denominada de 
coloração álcool-ácido resistente que classifica as 
bactérias em um grupo 
distinto (Bacilos Álcool Acido Resistentes). 
 A coloração de Ziehl-Neelsen baseia-se na capacidade de 
algumas bactérias resistirem aos métodos comuns de 
coloração devido à composição altamente lipídica da parede 
celular. 
 
 
 
 
 
 
 
 O método permite identificar os microrganismos que possuem 
paredes celulares (ricas em ácido micólico) capazes de resistir 
ao descoramento pela mistura álcool-ácido, depois de coradas 
a quente pela fucsina. (Ex: Mycobacterium tuberculosis) 
 O Azul de Metileno serve para corar o campo, tornando mais 
fácil a visualização dos BAAR. 
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• Preparar os esfregaços; 
• Fixar na chama do bico de bunsen; 
• Cobrir a lâmina com a solução de fucsina de Ziehl Neelsen; 
• Aquecer até a emissão de vapores (não deixar ferver); 
• Repetir o processo por 5 minutos; 
• Lavar com água corrente; 
• Descorar com uma solução de álcool-ácido clorídrico 1%; 
• Lavar em água corrente; 
• Corar 1 minuto com azul de metileno; 
• Lavar em água corrente; 
• Secar ao ar. 
COLORAÇÃO DIFERENCIAL (ZIEHL NIELSEN) 
Resultado Final 
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Fotomicrografia de Mycobacterium tuberculosis 
com a coloração de Ziehl-Nielsen (in, Small and 
Fujiwara. N Engl J Med, 2001; 345 (3): 189, Fig 
2). 
 
 
Colônias de Mycobacterium tuberculosis 
(in, Daily and Sadeghi. N Engl J Med, 2000; 
342 (7): 493, Fig.6).