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PROFs. OLEG / CLÁUDIO - UFPE 1 POTENCIAIS BIOELÉTRICOS (BIOELETROGÊNESE). Como é possível medir os potenciais elétricos presentes em nossas células? O potencial de membrana, ou seja, o POTENCIAL DE REPOUSO é um Potencial que surge devido à difusão de alguma espécie química dotada de carga elétrica? Potencial eletroquímico para um dado íon (X) A equação de Nernst Assumindo uma diferença nula na energia química para um íon em ambos os lados da membrana, a diferença de potencial eletroquímico do íon (X) pode ser expressa como a soma das diferenças na energia osmótica e elétrica, ou seja: ( ) ( ) ( ) [ ][ ] ( )121 2 12 ln ϕϕµµµ −+=−=∆ zFX XRTXXX Quando o sistema está em equilíbrio PROFs. OLEG / CLÁUDIO - UFPE 2 [ ][ ] ( ) 0ln 1212 =−++ + ϕϕzF K KRT [ ][ ]1212 ln + + −=−=∆ K K zF RTϕϕϕ Equação de Nernst a 36.6oC e z=1 e AA log3.2ln ≈ Assumindo φ1 no meio do lado esquerdo (do esquema acima) ou externo (de qualquer célula) = 0 [ ][ ]12log61 + + −=∆ K KmVE O potencial de Nernst para os principais íons pode ser calculado usando os dados de concentração dentro e fora da célula em repouso e adotando o potencial na solução extracelular igual a zero: Ion Cf, mM C1 Cd, mM C2 Nernst, mV K+ 4 140 -94 mV Na+ 145 10 +70.8 Ca2+ 2.4 0.0001 +133.5 Cl- 110 4 -87.8 Podemos inicialmente considerar que: O potencial de repouso, é o potencial de Nernst = o potencial de equilíbrio do K+ ou do Cl- PROFs. OLEG / CLÁUDIO - UFPE 3 Os dados experimentais não corroboram os cálculos, portanto a membrana é permeável a mais de uma espécie iônica. Os três tipos iônicos principais (K+, Na+ e Cl-) e assumindo um gradiente de voltagem constante através da membrana (varie linearmente), podemos deduzir que o potencial de membrana (Vm) poder ser calculado usando a equação de Goldman: ][][][ ][][][ln iCloNaoK oCliNaiK m ClPNaPKP ClPNaPKP zF RTV ++ ++−==∆ϕ onde, os subscritos i e o indicam os compartimentos de dentro e fora da célula, respectivamente. O potencial calculado difere do experimental em condições de mudança de temperatura e substâncias específicas, indicando a presença de outros processos de transporte envolvidos, principalmente, a bomba de Na+, K+. PROFs. OLEG / CLÁUDIO - UFPE 4 Dependência do potencial de membrana em células gigantes do gânglio gastroesofágico do molusco marinho Anisodoris nobilis em função da concentração de K+ na solução banhante externa das células. A ouabaína é um inibidor específico da Na-K-ATPase. A linha é traçada de acordo com a equação de Goldman. A bomba de Na+,K+. A difusão sempre tende a equilibrar as concentrações de íons nos meios intra e extracelular. A estabilidade dos gradientes iônicos é mantida com o transporte ativo: proteínas integrais que transportam íons através da membrana contra seus gradientes eletroquímicos, usando para isto, a energia do metabolismo. O acoplamento entre os fluxos ativos de Na+ e K+ é constante e pode ser descrito por uma equação estequiométrica simples: 3Na+dentro + 2K+fora →Bomba→ 3Na+fora + 2K+dentro Deste modo, a bomba ou Na+,K+ATPase é uma bomba eletrogênica. Assim sendo, ela gera corrente elétrica através da membrana, e como resultado, aumenta a eletronegatividade do espaço intracelular em ~10 mV. PROFs. OLEG / CLÁUDIO - UFPE 5 A bomba de Na+,K+ é o maior representante do transporte ativo das células. Na maioria das células, quase um/terço da energia é consumida no funcionamento da bomba; Nas células nervosas eletricamente excitáveis, a bomba de Na+,K+ consome quase dois/terços da energia da célula. Na ausência de K+ externo, pouco Na+ é bombeado para fora, e na ausência de Na+ interno, nenhum K+ é bombeado para dentro. Estes dois fluxos são ditos altamente acoplados, daí o nome bomba de Na+,K+. Evidência experimental da dependência de energia do transporte de Na+ para fora da célula. A taxa de transporte de Na+ por meio da bomba é suficientemente alta: 150- 600 Na+ íons/sec. Por outro lado, a mesma taxa é de 105 Na+ íons/sec, em um único canal de Na. A bomba de Na+,K+ é uma proteína heterodimérica. Sua estrutura tridimensional e o seu mecanismo molecular de funcionamento são pouco conhecidos. PROFs. OLEG / CLÁUDIO - UFPE 6 A estrutura esquemática da bomba de Na+,K+ Efeitos da inibição da bomba Na+,K+. Fluxo de Na+ de um axônio gigante da Lula em potencial de repouso, seguido por um período de estimulação, em água do mar contendo sódio radioativo. PROFs. OLEG / CLÁUDIO - UFPE 7 Modelo molecular proposto. Equilíbrio de Gibbs-Donnan Um sistema (como a célula) contendo íons permeantes e não permeantes, o potencial eletroquímico para todos os íons permeantes dentro e fora da célula são iguais. Este é o Equilíbrio de Gibbs-Donnan. Deste modo para os íons K+ e Cl-, o potencial de equilíbrio de Gibbs-Donnan, é escrito como: [ ][ ] ( ) 0ln =−+=∆ + + + BA B A K zFK KRT ϕϕµ + [ ][ ] ( ) 0ln =−−=∆ − − − BA B A Cl zFCl ClRT ϕϕµ ====================================== [ ][ ] ABBABA Cl Cl Cl Cl K K ][ ][ln ][ ][lnln − − − − + + =−= onde, os subscritos A e B indicam os meios intra- e extra celular, respectivamente. [ ][ ] ABBA Cl Cl K K ][ ][ − − + + = BBAA ClKClK ][][][][ −+−+ = Equação de Gibbs-Donnan. PROFs. OLEG / CLÁUDIO - UFPE 8 A influência dos íons não permeantes. Podemos deduzir que a presença de ânions não permeantes resulta em potencial elétrico negativo, no compartimento onde ele está presente. No caso da figura acima Y- é um ânion não permeante. A presença dele só no lado esquerdo desequilibra a concentração de K+ e conseqüentemente modifica a distribuição do Cl-. A equação do Gibbs-Donnan indica que se a mudança da concentração do K+ é X, o equilíbrio pode ser descrito como (0.1 + X)*X = (0.1-X)2 Tudo isso forma a diferença de potencial entre o lado A e o lado B. Se assumirmos que o potencial no lado B é zero, temos que o lado A está sob potencial negativo: φA-φB= -61 mV log(2) = -18.4 mV Uma pressão adicional precisa ser aplicada no lado contendo os ânions não permeantes, em condições de equilíbrio de Donnan, para evitar o fluxo de água para a câmara A. 1 atm =1.013 x 105 N m-2; 1 N m-2 = 1P; 1 bar = 1 x 105 N m-2 (P); 1 mmHg (Tor)=133.3 N m-2 (P); mmH2O = 9.81 P = 1 kg m-2. PROFs. OLEG / CLÁUDIO - UFPE 9 De maneira geral, os ânions não permeantes são responsáveis pela geração de –10mV no potencial de repouso. Uma pressão adicional precisa ser aplicada no lado contendo os ânions não permeantes, em condições de equilíbrio de Donnan, para evitar o fluxo de água para a câmara A. De forma simplificada a pressão osmótica (π) pode ser expressa pela lei de Van’t Hoff: π = RT iCΦ onde i é o número das partículas (íons) criadas por uma molécula do soluto; C é a concentração molar do soluto; Φ é um coeficiente osmótico. O termo iCΦ pode ser considerado como a concentração osmótica efetiva e se chama osmolaridade (Osmoles/litro). Assumindo que i e Φ para K+ e Cl- são bem próximos do 1 CRT ∆∆ *~π Onde: Ci, , concentração em Mol/m3 ; 1 atm = 1.01 x 105 N/m2 Resolução: ∆C = 134 Mol/m3; ∆π = 134 (Mol/m3) x RT (J/Mol) = 332012 N/m2 ~ 3 atm CONCLUSÃO O potencial de repouso consiste basicamente de três componentes: 1) Transporte ativo - bomba de K+,Na+ (~ -10 mV); 2) Equilíbrio de Donnan (~ -10 mV) e 3) Potencial de Difusão. PROFs. OLEG / CLÁUDIO -UFPE 10 A EQUAÇÃO DE CONDUTÂNCIA. Então o equilíbrio para qualquer componente (A+ ou A-) em um sistema de dois compartimentos separados por uma membrana permeável, deve apresentar igualdade entre a diferença da energia osmótica e a diferença da energia elétrica do componente: ( ) [ ][ ]o i oi A ARTzF ln−=−ϕϕ Nerrnsteqoi EE ==−ϕϕ Nessa situação o fluxo resultante de A é nulo! Isso é a situação dos íons distribuídos entre os meios intra e extracelular. Então o fluxo do qualquer componente A acontece se o potencial de membrana (Vm ) é diferente do potencial de Nernst (Eeq) para o componente A. A força elétrica (F) que move íons pode ser expressa como: F ~ (Vm - Eeq) Como os íons possuem carga, o fluxo iônico é igual a corrente elétrica (I). Então da lei de Ohm: )( KmKK EVgI −= )( NamNaNa EVgI −= )( ClmClCl EVgI −= Vm é potencial de membrana; I representa as correntes; g são condutâncias e E, os potenciais de equilíbrio de cada íon, como denotado pelos subscritos. A equação da condutância pode ser derivada do potencial eletroquímico ou simplesmente da Lei de Ohm. Como visto, se a voltagem transmembrana for igual ao potencial de equilíbrio de um determinado íon, não haverá fluxo efetivo desse íon através da membrana. Se o potencial de membrana não for igual ao potencial de equilíbrio de qualquer íon, a diferença entre o potencial de membrana e o potencial de equilíbrio desse íon é a força propulsora para esse íon. Dado que os íons têm carga, o fluxo iônico é equivalente á corrente elétrica, então podemos aplicar a Lei de Ohm. PROFs. OLEG / CLÁUDIO - UFPE 11 Caso se admita que K+ , Na+ e Cl- são os íons mais importantes, em condições de estado estacionário (equilíbrio dinâmico), a corrente total transmembrana é igual a zero. IK + INa + ICl = 0 ou 0)()(g )( Na =−+−+− ClmClNamKmK EVgEVEVg Deste modo, o potencial de repouso pode ser escrito como: Cl Cl Na Na K K m Eg g E g g E g gV ∑+∑+∑= onde ClNaK gggg ++=∑ A equação postula que o potencial de membrana é uma média ponderada dos potenciais de equilíbrio de todos os íons a que a membrana é permeável, neste caso K+ , Na+ e Cl-. O peso atribuído a cada íon é a condutância da membrana para aquela espécie de íon, dividida pela condutância iônica total da membrana. As equações de Goldman, de Nernst e da condutância, são freqüentemente utilizadas na análise do potencial transmembrana celular. PROFs. OLEG / CLÁUDIO - UFPE 12 Potenciais de Propagação: Potenciais locais e Potencial de ação. Analisando os sinais elétricos dos tecidos excitáveis, encontramos dois tipos básicos de potenciais: o potencial local e o potencial de ação. Os potenciais de ação são empregados para enviar mensagens rapidamente a longas distâncias. (músculos e nervos) com velocidade constante e nenhuma perda de amplitude. Ao contrário dos potenciais de ação, os potenciais locais propagam-se em distâncias pequenas e são responsáveis por mecanismos de transdução altamente localizados; são graduados em amplitude e duração. Não apresentam limiar e sofrem somação temporal e espacial. Potencial de Ação. Limiar. Existe um limiar para estimulação artificial do potencial de ação com um eletrodo de corrente. elétrica. Um estímulo hiperpolarizante normalmente não excita; Um estímulo despolarizante sublimiar também não produz nenhuma resposta propagada; e todos os estímulos supralimiar geram o mesmo esteriótipo de onda que trafega com a mesma velocidade. O potencial de ação é dido como tudo ou nada, em termos de resposta. Um breve estímulo de corrente precisa ser mais intenso que um estímulo longo. Resposta de voltagem do axônio ao estímulo de corrente. Os números indicam a intensidade relativa da corrente aplicada. O estímulo indutor do potencial de ação é considerado como 1. Refratariedade. Para um breve estímulo após um potencial de ação, por maior que seja o estímulo, não eliciará um segundo potencial de ação, isto é o período PROFs. OLEG / CLÁUDIO - UFPE 13 refratário absoluto, ou seja, a célula está inexcitável. Logo em seguida temos um curto intervalo, chamado período refratário relativo quando o estímulo limiar está acima do normal. A refratoriedade permanece até que os canais iônicos na membrana retornem a condição de repouso. O período refratário absoluto estabelece um limite superior na taxa máxima de disparos repetitivos de um axônio. A refratariedade exerce a maior importância em garantir que os impulsos não revertam sua direção espontaneamente. Circuitos locais de corrente e a propagação do potencial de ação. Como uma região excitada de um axônio coloca uma região ainda não excitada em atividade durante a propagação normal do potencial de ação? 1. A propagação é basicamente um evento mecânico ou químico com substâncias excitantes colocadas em cada local, causando secundariamente um evento elétrico mensurável. 2. O próprio potencial de ação funciona como estímulo elétrico que se espalha pelas “propriedades de cabo do axônio”, colocando em atividade regiões de membranas na vizinhança. PROFs. OLEG / CLÁUDIO - UFPE 14 A base molecular desses efeitos são os canais iônicos. Tipos de canais iônicos Como a corrente elétrica afeta o potencial de repouso das células? As correntes elétricas pequenas normalmente fluem das regiões excitadas (despolarizadas) para regiões vizinhas ainda não excitadas, despolarizando-aS. Os circuitos locais de corrente fluem de dentro do axônio, onde a membrana está despolarizada para a membrana em repouso, ou seja, saindo através da membrana em repouso, e fechando o circuito para a região da membrana ativa, através do espaço extracelular, seguindo as regras de fluxo de corrente em resistores e capacitores, resultando num espalhamento passivo da despolarização a frente do potencial de ação. A propagação é unidirecional por causa da refratariedade. PROFs. OLEG / CLÁUDIO - UFPE 15 A propagação do potencial de ação apresenta no mínimo quatro propriedades fundamentais. Constância na forma e no tamanho durante a propagação. A condutância elétrica da membrana aumenta transitoriamente durante a propagação. A velocidade de condução e curso temporal do potencial de ação diminuem, quando a célula é resfriada. A amplitude, a taxa de subida e a velocidade de condução diminuem reversivelmente quando a concentração de sódio externo é reduzida. Constância na forma e amplitude. Aumento transitório da condutância elétrica da membrana (mensurada pela permeabilidade iônica. Diminuição na duração e na velocidade de condução com o resfriamento. Diminuição de amplitude, taxa de subida e velocidade de condução com a concentração do sódio. PROFs. OLEG / CLÁUDIO - UFPE 16 A CONSTANTE DE ESPAÇO É UM PARÂMETRO DAS CÉLULAS ALONGADAS. Montagem do experimento. O gráfico mostra que Vm decai exponencialmente a medida que a distância aumenta, com uma constante de espaço, λ, de ~1.2 mm na fibra muscular. Como em um cabo elétrico, uma parte da corrente flui longitudinalmente ao longo do eixo da fibra, para áreas mais distantes do local de aplicação de corrente (estímulo), o decurso espacial de Vm decai exponencialmente a medida que a distância aumenta, dependendo das propriedades da membrana. A teoria do cabo prediz que a constante de espaço λ (Constante de comprimento) depende das resistências de membrana (rm) e da citoplasmática (ri), ou seja: λ = √(rm/ri)] PROFs. OLEG / CLÁUDIO - UFPE 17 VELOCIDADE DE CONDUÇÃOE O DIÂMETRO DA FIBRA NERVOSA. Para axônios mielinizados de mamíferos a 370C, cada µm de diâmetro externo, aumenta em 6 m/s a velocidade de condução. A 20oC 10-µm de uma fibra de axônio de rã apresenta a mesma velocidade de condução que, uma fibra de axônio gigante de Lula 500- µm. Uma fibra nervosa de axônio típica de mamífero, com 1 mm de diâmetro, contém 1000 fibras de 10- 20 µm . Uma fibra nervosa composta de axônios não mielinizados, precisaria ter 38 mm de diâmetro para apresentar a mesma velocidade de condução. Condução saltatória. As alterações da bainha de mielina estão presentes em doenças como a esclerose múltipla. PROFs. OLEG / CLÁUDIO - UFPE 18 Simulação computacional da propagação do potencial de ação em fibras nervosas parcialmente desmielinizadas. O cálculo utiliza o modelo de Hodgkin-Huxley para membrana nodal excitável e as equações do cabo para as regiões internodais mielinizadas. A mielina internodal entre os nódulos 4 e 5 é considerada ser 2.7% ou 2.5% da espessura normal. Adaptado de Koles ZJ, Rasminsky M.J.Physiol.(Lond) 227:351-364, 1972. A Desmielinização aumenta a capacitância efetiva próximo ao nodo 4. MODELO DE HODGKIN-HUXLEY (H-H). Para descrever o curso temporal do potencial de ação, Hodgkin e Huxley desenvolveram equações cinéticas para mimetizar a voltagem mensurada e a dependência temporal de gNa e gK. Eles escolheram um modelo cinético equivalente a presença de quatro “gates” (portões, comportas) operando de maneira independente e serial para controlar a permeabilidade de cada canal. Para os canais de Na --- 3 "m-gates", movem-se rapidamente (ativando o canal) na despolarização, e 1 "h-gate", move-se lentamente (inativando-o). A quantidade de canais de Na abertos é proporcional a m3h, onde m é a probabilidade variante no tempo de que qualquer um m-gate esteja aberto, e h é a probabilidade variante no tempo de que um h-gate esteja na posição de inativação. PROFs. OLEG / CLÁUDIO - UFPE 19 Para os canais de K são 4 "n-gates" movendo-se lentamente, e a fração de canais de K abertos é proporcional a n4. Com estas definições, as taxas de abertura e fechamento dos m-, h-, e n-gates hipotéticos podem ser determinadas em cada voltagem, a partir da medida do decurso temporal de gNa e gK. INa = m3h gNaMax (Em - ENa). IK = n4 gKMax (Em - EK). Adicionalmente uma pequena permeabilidade basal (corrente de vazamento) também foi considerada e definida como segue: IL = gL (Em - EL) Este modelo de Hodgkin e Huxley, juntamente com as equações do cabo para um axônio com capacitância de membrana e resistência interna, reproduz bem dos fenômenos da excitabilidade. PROFs. OLEG / CLÁUDIO - UFPE 20 BASES IÔNICAS DO POTENCIAL DE AÇÃO. A corrente iônica em resposta a potenciais hiperpolarizantes até -130 mV. Separação da corrente transmembrana em duas componentes, a de Na+ e a de K+. Ii é a corrente total; Ii' é a corrente após a troca de 90% do NaCl externo por, cloreto de colina INa= Ii - Ii'. Demonstração farmacológica de que as correntes de Na+ e de K+ são independentes. Registros obtidos de um nódulo de Ranvier. Após alguns minutos da adição de TEA a PROFs. OLEG / CLÁUDIO - UFPE 21 solução banhante, IK é bloqueada. Mudanças nas condutâncias de sódio e de potássio, durante o potencial de ação. gNa aumenta milhares de vezes durante o estágio inicial do potencial de ação, enquanto gK aumenta somente ~30 vezes, durante um curto intervalo de tempo no final do P.A.. Tabela de distribuição dos picos de Na e Ca. Propagação por picos de Na. Propagação por picos de Ca. Axônios do reino animal; Do músculo de vertebrados; Músculo atrial e ventricular cardíacos; Fibras de Purkinje cardíacas. Em todos os músculos de invertebrados; Nodos sinoatrial e atrioventricular cardíacos; Músculo liso de vertebrados; Dendritos de neurônios centrais. CONCLUSÃO GERAL SOBRE O POTENCIAL DE AÇÃO. A propagação do potencial de ação requer que cada região excitada da fibra nervosa, coloque a próxima em ação, em um ciclo que progride em alta velocidade ao longo do axônio. A excitação envolve canais dependentes de voltagem, inicialmente os de Na+ e/ou Ca2+ e depois de K+. Com a despolarização inativam-se os canais de Na e se abrem mais canais de K, a membrana repolariza, e o potencial é finalizado. PROFs. OLEG / CLÁUDIO - UFPE 22 OS DIFERENTES TIPOS DE CANAIS PRESENTES NAS MEMBRANAS BIOLÓGICAS. Evidência experimental da presença de canais– A técnica de Patch-clamp (clampear um pedacinho da membrana). ALGUMAS FAMÍLIAS DE CANAIS. Família Subfamília representativa Efeito Canais catiônicos dependentes de voltagem. Canais de Na+ Canais de K+ Canais de Ca2+ Basicamente geração do potencial de ação. Canais iônicos dependentes de ligantes. Canais catiônicos dependentes de ACh Canais catiônicos dependentes de serotonina Canais catiônicos dependentes de glutamato Canais de cloreto dependentes de GABA Canais de cloreto dependentes de glicina Excitatório Excitatório Excitatório Inibitório Inibitório DIVERSIDADE DO GATING NOS CANAIS DE K. Tipo Abreviatura Características Retificador tardio IK Tipo do axônio gigante, abre tardiamente depois da despolarização. Dependente de Ca IK(Ca) O Ca interno e a despolarização sinergicamente promovem a sua abertura. Corrente A IA Abre transitoriamente com a despolarização e permanece inativado até Em> -50 mV Corrente M IM Não é inativado, lento, retificador tardio que é desligado por agonistas muscarínicos. Retificador para dentro Iir Conduz uma corrente de K para dentro que é rapidamente desativada pela despolarização.
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