EFEITO DO LASER NA CICATRIZAÇÃO POR 1 INTENCAO NO MODELO EXPERIMENTAL EM RATOS

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE 
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA 
NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA 
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE 
 
 
 
 
 
 
 
 
EFEITO DO LASER, λ904 nm, NA CICATRIZAÇÃO POR 
1ª INTENÇÃO NO MODELO EXPERIMENTAL EM 
RATOS 
 
 
MESTRANDA: DENISE CRISTINA S. DOS ANJOS 
 
ORIENTADOR: PROF. DR. VALDINALDO ARAGÃO DE MELO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
São Cristóvão 
Agosto de 2010 
1 
 
 
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE 
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA 
NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA 
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE 
 
 
 
 
 
 
 
 
EFEITO DO LASER, λ904 nm, NA CICATRIZAÇÃO POR 
1ª INTENÇÃO NO MODELO EXPERIMENTAL EM 
RATOS 
 
Dissertação apresentada ao Núcleo do Mestrado 
em Ciências da Saúde da Universidade Federal de 
Sergipe – UFS como requisito para obtenção do 
grau de mestre. 
 
DENISE CRISTINA S. DOS ANJOS 
 
_____________________________________ 
Prof. Dr. VALDINALDO ARAGÃO DE MELO 
ORIENTADOR 
 
 
 
 
 
São Cristóvão 
Agosto de 2010 
 
2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA SAÚDE 
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE 
 
 
 
 
A599e 
 
Anjos, Denise Cristina Santos dos 
 Efeito do laser, 904ּגnm, na cicatrização por 1ª intenção no 
modelo experimental em ratos / Denise Cristina Santos dos 
Anjos. – Aracaju, 2010. 
73 f. 
 
Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – 
Universidade Federal de Sergipe, Pró-Reitoria de Pós-
Graduação e Pesquisa, Núcleo de Pós-Graduação em 
Medicina. 
 
Orientador (a): Prof. Dr. Valdinaldo Aragão de Melo. 
 
 1. Cicatrização 2. Cirurgia 3. Laser 4. Ação terapêutica 5. 
Pesquisa experimental 6. Ratos 7. Medicina operatória I. 
Título 
 
CDU 617-089:615.849.19 
 
 
 
3 
 
 
EFEITO DO LASER, λ904 nm, NA CICATRIZAÇÃO POR 1ª 
INTENÇÃO NO MODELO EXPERIMENTAL EM RATOS 
 
DENISE CRISTINA S. DOS ANJOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DATA ____/____/_____ 
 
 
 
 
BANCA 
 
 
 
 
(1º examinador)________________________________________ 
nome do orientador (a) 
 
(2º examinador)________________________________________ 
nome do professor (a) 
 
(3º examinador)________________________________________ 
nome do professor (a) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
iii 
 
4 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“A diferença entre o vencedor e o perdedor não é a 
força nem o conhecimento, mas, sim, a vontade de 
vencer.” 
 
Vincent T. Lombard 
 
 
 
 
 
iv 
 
5 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedico aos meus pais e marido pelo incentivo e apoio 
incondicional durante todo o desenvolvimento desta pesquisa. 
 
 
 
 
v 
 
6 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
 
Primeiramente a Deus, por sempre se fazer presente em minha vida, guiando-me, 
dando força e coragem para prosseguir frente as dificuldades, iluminando meus passos quando 
parecia ser difícil encontrar a saída. 
 
A meus pais, pelo incentivo, paciência e por sempre me apoiar em todos os 
momentos, tudo o que sou e que conquistei devo a vocês, amo-os muito. 
 
A meus irmãos, meus cunhados e minha linda sobrinha Giovanna pela 
compreensão em virtude dos momentos em que não pude estar presente. 
 
A meu marido, Cláudio, nem tenho palavras para dizer o quanto foi importante o 
apoio e carinho a mim dado durante todo esse período. 
 
A clínica INTERMED, Drº Anderson, funcionários e pacientes que souberam 
entender o quanto foi importante a realização deste sonho, principalmente pela utilização do 
aparelho LASER usado nesta pesquisa. 
 
A meu orientador, Profº Valdinaldo Aragão, pela colaboração e confiança em mim 
depositada para a realização deste experimento. 
 
Ao Profº Ricardo Albuquerque Júnior, pelo incentivo, sabedoria, paciência, o meu 
muito obrigado de coração. 
 
A todos os funcionários da UFS, principalmente Sr. Osvaldo, e do ITP da 
Universidade Tiradentes, em especial Rose Nely, pela colaboração e dedicação deste trabalho. 
 
À FAPITEC que viabilizou a dedicação deste mestrado. 
vi 
 
7 
 
 
SUMÁRIO 
 
LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................ viii 
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ ix 
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................ x 
LISTA DE GRÁFICOS ......................................................................................................... xi 
RESUMO ............................................................................................................................... xii 
ABSTRACT .......................................................................................................................... xiii 
1- INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 14 
2- REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................ 16 
2.1- REPARAÇÃO TECIDUAL .......................................................................................... 16 
2.2- LASER ............................................................................................................................ 18 
3- OBJETIVOS ..................................................................................................................... 23 
4- MÉTODOS ........................................................................................................................ 24 
5- RESULTADOS ................................................................................................................. 29 
6- DISCUSSÃO ..................................................................................................................... 39 
7- CONCLUSÕES ................................................................................................................. 44 
REFERÊNCIAS .................................................................................................................... 45 
ANEXOS ................................................................................................................................ 53 
 
 
vii 
 
8 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
 
LASER – Light Amplification of Stimulated Emission of Radiation 
J/cm² – Joules por centímetro quadrado 
mW – Miliwatts 
HeNe – Hélio-Neônio 
AsGa – Arsenato de gálio 
Hz – Hertz 
nm - Nanômetros 
ATP – Adenosina Tri-Fosfato 
HE – Hematoxilina-eosina 
ADP – Adenosina Di-Fosfato 
viii 
 
9 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1: Incisão crânio caudal seguindo a linha Alba (A) e suturas contínuas por fio de nylon 
(B) ........................................................................................................................................... 24 
 
Figura 2: Aparelho de Laser KC-605 (A) e aplicação à distância de 0,5 cm da incisão 
cirúrgica (B) ............................................................................................................................ 25 
 
Figura 3: Reação inflamatória aguda nos grupos controle e irradiado, sacrificados ao 8º e 15º 
dia (Hematoxilina-eosina, 400x) ............................................................................................. 30 
 
Figura 4: Colagenização nos grupos controle e irradiado, sacrificados ao 8º e 15º dia. 
(Tricrômico Masson, 400 x) .................................................................................................... 33 
 
Figura 5: Caracterização das fibras de colágeno nos grupos controle e irradiados, sacrificados 
ao 8° e 15º dia. (Picrosirius Red, 400 x) ................................................................................. 35 
 
Figura 6: Vasos sanguíneos neoformados nos grupos controle e irradiado, sacrificados ao 8º e15º dia. (Anti-CD34, 400x) ..................................................................................................... 37 
 
 
 
 
 
 
 
ix 
 
10 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1: Análise morfológica do infiltrado inflamatório nos grupos controle e irradiado, 
sacrificados no 8º(G1 e G2) e 15º dia (G3 e G4)..................................................................... 29 
 
Tabela 2: Análise descritiva das fibras de colágeno nos grupos controle e irradiado, 
sacrificados ao 8º e 15º dia....................................................................................................... 32 
 
Tabela 3: Avaliação do colágeno nos grupos controle G1 e G3 e tratado G2 e G4 sacrificados 
ao 8º e 15º dia .......................................................................................................................... 54 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
x 
 
11 
 
 
LISTA DE GRÁFICOS 
 
Gráfico 1. Representação gráfica do nº médio e desvios de vasos neoformados por campo 
histológico ............................................................................................................................... 36 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
xi 
 
12 
 
 
RESUMO 
 
Anjos, D. C. S. Efeito do laser, λ904 nm, na cicatrização por 1ª intenção no modelo 
experimental em ratos [Dissertação]. Sergipe: Universidade Federal de Sergipe; 2010. 
 
O laser de baixa potência constitui um recurso terapêutico que atua na biomodulação 
intracelular, ocasionando diminuição do processo inflamatório, redução do edema intersticial, 
aumento da fagocitose, proliferação da síntese de colágeno e da neovascularização. Objetivo: 
Avaliar o efeito da terapia laser de baixa potência (TLBP) λ904 nm na cicatrização por 1ª 
intenção no modelo experimental de ratos. Métodos: Foram utilizados 40 ratos Wistar, 
machos, divididos em quatro grupos, submetidos a incisão na linha Alba abrangendo pele, 
subcutâneo e musculatura abdominal, suturados continuamente por fios de nylon 5-0. Oito e 
quinze dias após o procedimento cirúrgico, a área de reparo foi removida e os cortes 
histológicos foram corados com hematoxilina-eosina para avaliar celularidade do infiltrado 
inflamatório, Tricrômico de Masson e Picrosirius para quantificar as fibras de colágeno e 
técnica imuno-histoquímica para a contagem de vasos neoformados. Os dados foram 
comparados estatisticamente pela análise de variância ANOVA, com "teste de Tukey post-
hoc, p <0,05. Resultados: A TLBP reduziu a intensidade da reação inflamatória e influenciou 
a dinâmica da resposta imuno por induzir a mudança do padrão de infiltração de leucócitos 
(neutrófilos a infiltração mononuclear). Como também estimula a deposição e melhora padrão 
organizacional das fibras colágenas, apresentando um delicado colágeno tipo III. Além disso, 
verificou-se um aumento significativo no número médio de vasos neoformados (p = 0,001, 
em relação aos grupos G1 e G2; e p = 0,02, em G3 e G4). Conclusões: TLBP modula a 
resposta inflamatória, com melhor deposição de fibras colágenas e aumento do número médio 
de vasos neoformados. 
 
Descritores: Cicatrização, lasers, ratos. 
 
xii 
 
13 
 
 
ABSTRACT 
 
Anjos, D. C. S. Effect of laser, λ904 nm, on wound healing by 1st primary intention, on 
the experimental model in rats [Dissertation]. Sergipe: Federal University of Sergipe, 2010. 
 
The low level laser therapy is a therapeutic resource that acts on intracellular biomodulation, 
decreasing the inflammatory process, reduction of interstitial liquid, increased phagocytosis, 
proliferation, collagen synthesis and neovascularization. Purpose: To evaluate the effect of 
low-level laser therapy (LLLT), λ904 nm, on wound healing by first intention on the 
experimental model in rats. Methods: 40 male Wistar rats were used, divided into four 
groups, underwent incision along the lines Alba covering skin, subcutaneous and muscle 
abdominal, sutured continuously for nylon 5-0. Eight and fifteen days after the surgery 
process, the repairing area was removed and histological sections were stained with 
hematoxylin-eosin to assess cellularity inflammatory, Masson´s Trichrome and Picrossirus to 
quantify the collagen fibers and immunohistochemical technique for counting newly formed 
vessels. The data were compared statistically using analysis of variance ANOVA, with a 
"post-hoc Tukey test, p <0,05. Results: we found that LLLT reduced the intensity of the 
inflammatory reaction and influenced the dynamic of the immunoinflammatory response by 
inducing switching of the leukocyte infiltration pattern (neutrophilic to lymphoplasmacytic 
infiltration). Also stimulate the deposition and enhance the organization of collagen fibers, 
featuring a delicate collagen type III. Furthermore, it appeared to a significant increase in the 
average number of newly formed vessels (p = 0.001, in G1 and G2; and p = 0.02, in G3 e G4). 
Conclusions: LLLT resulted in modulate of the inflammatory response, enhanced deposition 
of collagen fibers and increase in the average number of newly formed vessels. 
 
Keywords: Wound healing, lasers, rats. 
 
 
 
 
 
 
xiii 
 
14 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
 
A pele consiste em uma barreira mecânica de proteção presente em toda superfície 
externa do corpo, que exerce inúmeras funções contra danos aos tecidos. Estruturalmente é 
representada por duas camadas: a epiderme e a derme. A primeira situa-se em contato direto 
com o meio externo, sendo constituída histologicamente por tecido epitelial estratificado 
queratinizado. A camada posterior fica sob a epiderme, sendo composta principalmente por 
tecido conjuntivo, fibroblastos e fibrócitos formadores de fibras colágenas, elásticas e 
reticulares, substancia fundamental e matriz extracelular (GRAY, 1988; GUYTON, 2002). 
 
A descontinuidade da integridade tecidual pode ser induzida ora por traumatismo 
ora por procedimentos cirúrgicos. Neste aspecto, são liberadas inúmeras substâncias químicas 
que ocasionam alterações teciduais compatíveis com um processo inflamatório agudo, 
inicialmente com estimulação, migração e proliferação de células parenquimatosas e 
conjuntivas, síntese da matriz extracelular, e finalmente, culminando em remodelamento do 
tecido conjuntivo objetivando a substituição das células lesadas (GUYTON, 2002; 
NASCIMENTO, 2001). 
 
Em alguns casos, quando o mecanismo de cicatrização ocorre pela aproximação 
das bordas da lesão não infectadas por sutura, denomina-se de primeira intenção ou união 
primária, onde o sangue extravasado pelo corte forma um coágulo que preenche o espaço 
entre as margens da ferida, havendo perda mínima do tecido, ausência de infecção e discreto 
edema. Assim, a coagulação sanguínea acontece de imediato após o surgimento da lesão, 
dependendo da atividade plaquetária e da cascata de coagulação (ROBBINS, 1994; 
MAVIOSO, 2003). 
 
Atualmente, existem métodos que amenizam o processo inflamatório, agindo na 
melhoria da nutrição celular das áreas lesionadas favorecendo o reparo tecidual. Dentre estes, 
destaca-se o laser de baixa potência utilizado clinicamente no controle da dor e na 
cicatrização de feridas. A eficácia desta terapêutica deve-se às respostas induzidas a nível 
celular através da fotobiomodulação promovendo aceleração do metabolismo celular, redução 
 
15 
 
 
do processo inflamatório, aumento da microcirculação local e do sistema linfático, diminuição 
do edema intersticial e aumento da síntese de colágeno (HONMURA et al., 1993; BAXTER, 
1994; THEODORO et al., 2002; KUMAR et al., 2005). 
 
Assim sendo, pesquisas têm sido realizadas para investigar os efeitos do laser no 
processo de reparação de vários tipos de tecidos. O mecanismo de cicatrização de feridas por 
1ª intenção despertou o interesse e a necessidade de investigar o efeito desta terapêutica no 
pós-operatório, por ser um modelo mundialmente utilizado na maioria das intervenções 
cirúrgicas e pela escassezde referencial na literatura. O laser, λ904 nm, possui um poder de 
penetração em torno de 3 centimetros, produzindo efeitos positivos no controle da inflamação, 
isto porque a energia liberada altera o potencial da membrana, promovendo diferenciação 
celular e estimulando a síntese de proteínas como o colágeno importante na cicatrização. Para 
tal, é aconselhável a execução de estudos em modelos animais, a fim de estabelecer um 
protocolo, já que o laser é uma alternativa terapêutica compatível com a natureza de ação de 
muitos antiinflamatórios não hormonais, tendo, como benefício, a exclusão de alguns efeitos 
adversos, como o alto risco de lesões gastroduodenais e renais. 
 
16 
 
 
2. REVISÃO DE LITERATURA 
 
2.1 REPARAÇÃO TECIDUAL 
 
O complexo processo de cicatrização tecidual envolve atividades locais e 
sistêmicas, sendo deflagrado por uma cascata de eventos quimiotáticos e pela liberação de 
mediadores químicos, juntamente com respostas vasculares, passando desde a inflamação, 
proliferação celular até a maturação com reconstituição da matriz extracelular com colágeno, 
elastina e fibras reticulares. Falhas desses eventos acarretam na acentuação do edema, redução 
da proliferação vascular e diminuição dos elementos celulares tais como leucócitos, 
macrófagos e fibroblastos (CARVALHO et al., 2003; KITCHEN, 2003). 
 
Após a lesão, a fase inflamatória inicia-se com vasoconstricção reflexa 
caracterizada por vasodilatação arteriolar e venular com aumento da pressão hidrostática e da 
permeabilidade na microcirculação, com consequente migração de líquido e de 
polimorfonucleares para o interstício, acúmulo de macrófagos e reação leucocitária no sítio da 
lesão. A agregação plaquetária e a deposição de fibrina ocorre durante 5 a 10 minutos, o que 
propicia o fechamento dos vasos lesados, favorecendo a hemostasia (GUYTON, 2002; 
VILELA, 2006). Posteriormente, aumenta-se a permeabilidade vascular das células 
endoteliais, facilitando a passagem de elementos sanguíneos para a ferida como eritrócitos e 
leucócitos. Tal processo previne a perda disseminada de fluido e eletrólitos do local da ferida, 
reduzindo a contaminação. Os neutrófilos são as primeiras células de defesa a chegarem ao 
local da lesão. Eles contêm uma grande quantidade de grânulos citoplasmáticos lisossomais 
ricos em enzima proteolítica, capazes de degradar restos celulares e bactérias (ABBAS et al., 
1997; MONACO; LAWRENCE, 2003; VILELA, 2006). 
 
Os monócitos circulantes no sangue migram para o local da lesão e se diferenciam 
em macrófagos, componente importante da inflamação crônica, desempenhando papel ativo 
no processo de reparo. Os macrófagos são células de grandes dimensões do tecido conjuntivo, 
fagocitam elementos estranhos ao corpo e se diferenciam quanto à sua morfologia, que é 
variável conforme o estado funcional e a localização. A ativação destas células, normalmente 
17 
 
 
em latência, favorece suas funções de fagocitose, destruição de bactérias, lise de tecido 
desvitalizado e geração de mediadores químicos (ABBAS et al., 1997). 
 
Na fase proliferativa ocorre o brotamento vascular a partir dos capilares 
preexistentes no local próximo da lesão, o tecido danificado é substituído por tecido de 
granulação rico em capilares interconectantes, células inflamatórias e fibroblastos. O 
miofibroblasto é outro tipo celular presente no tecido de granulação que facilita a epitelização 
por ter uma grande capacidade contrátil. Em suma, a fase de reepitelização é decorrente do 
aumento de tamanho, da divisão e migração das células da camada basal da epiderme por 
sobre a área de reparação do tecido conjuntivo subjacente (RESENDE; PEREIRA; CASTRO, 
2005; CARVALHO et al., 2003). 
 
Por conseguinte, na fase de maturação tem-se a caracterização de dois eventos: 
deposição e remodelação do colágeno com regressão endotelial que decorre da redução de 
todos os elementos celulares e da diminuição progressiva de vasos neoformados. O tamanho 
da ferida é diminuído, ocorre reorganização do colágeno e a cicatriz torna-se menos espessa 
passando de uma cor rosada para a coloração semelhante à pele adjacente (CARVALHO et 
al., 2003; GUYTON, 1998). 
 
O colágeno é uma proteína fibrilar da matriz extracelular que possui papel 
fundamental na arquitetura tecidual, sua finalidade é proporcionar força tensiva aos tecidos 
pela formação das fibras colágenas. Sua classificação se dá pela organização molecular: o tipo 
I é o mais comum na matriz extracelular de tendões, sendo encontrados na pele, ossos e 
ligamentos. O tipo II é encontrado em cartilagens e humor vítreo, e o tipo III é mais 
abundante no tecido conjuntivo frouxo, na derme, nas paredes dos vasos sanguíneos e trato 
gastrintestinal (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). Os subtipos de colágenos mais envolvidos 
na cicatrização são os do tipo I e III. O tipo III é depositado na área da ferida após dois dias da 
lesão sendo posteriormente substituído por colágeno tipo I (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 
2004; KUMAR et al., 2005). 
 
Em alguns casos quando o mecanismo de cicatrização ocorre pela aproximação 
das bordas da lesão, denomina-se de primeira intenção ou união primária na qual o sangue 
18 
 
 
extravasado pelo corte forma um coágulo que preenche o espaço entre as margens da ferida, 
com perda mínima do tecido, ausência de infecção e discreto edema (ROBBINS et al., 1994; 
TATARUNAS et al, 1998). Proporcionalmente, as células fagocitárias vão desaparecendo e o 
tecido de granulação passa a ser constituído por um tecido conjuntivo progressivamente mais 
denso (BAYNES, 2000). 
 
Fatores locais e sistêmicos como a presença de infecção, necrose, diabetes, idade 
avançada e alterações cardiocirculatórias podem interferir na cicatrização tecidual e ocasionar 
falhas nos estágios iniciais, desencadeando acentuação do edema, redução da proliferação de 
vasos sanguíneos, leucócitos, macrófagos e fibroblastos, com consequente diminuição na 
síntese de colágeno e maior risco de infecções (DÂNGELO, FATTINI, 1998; CARVALHO 
et al., 2003). 
 
2.2 LASER 
 
Analisando o significado da palavra LASER – Light Amplification of Stimulated 
Emission of Radiation – que se traduz por Amplificação luminosa da Luz por Emissão 
Estimulada da Radiação, cuja teoria é creditada ao físico Albert Einstein que, em 1917, expôs 
o “Principio Físico da Emissão Estimulada” sobre o qual o fenômeno laser está configurado. 
Assim sendo, quando a energia é absorvida por um átomo, um elétron orbital pode se tornar 
excitado e mover-se para uma órbita mais alta. Quando o elétron retorna para seu nível 
original, a energia (fóton) é liberada e estimularia outro átomo igualmente excitado para 
liberar um fóton idêntico (VEÇOSO, 1993; PRENTICE, 2002). 
 
A luz ampliada por emissões estimuladas é produzida, manifestando-se em forma 
de luz monocromática (fótons da mesma cor e mesmo comprimento de onda), sendo o feixe 
de luz estreito, paralelo e uniforme, com ondas idênticas superpondo-se umas às outras, 
conferindo-lhe um efeito de amplificação e mínima divergência. Estas características 
diferenciam a luz laser de outras fontes de luz (HACZEKI,1989 apud ALBERTINI et al., 
2000). 
 
19 
 
 
Os inúmeros tipos de Lasers diferem seus efeitos de acordo com o comprimento 
de onda (expresso em nanômetro – nm), dose (Joules por centímetro quadrado – J/cm²), 
intensidade de luz (Hertz – Hz) e natureza do material colocado entre duas superfícies de 
reflexão que pode ser constituído por cristal, vidro, gás, semicondutor, tintura líquida e 
química (PRENTICE, 2002). 
 
O aparelho é composto basicamente por três partes: meio ativo, cavidade óptica e 
fonte de ativação. O meio ativo é caracterizado pela natureza do material onde ocorre a ação 
laser. A segunda parte é a cavidade óptica, espaço que apresenta dois espelhos onde o meio 
ativo fica alojado e a amplificação da luz ocorre. A última parte é a fonte de excitaçãoque 
consiste no sistema de “bombeamento” ou fonte de ativação, utilizado para cada tipo de Laser 
que pode ser elétrica ou óptica (PINHEIRO, 1998; LIZARELLI, 2005). 
 
Além disso, são categorizados em laser cirúrgico ou de alta potência (>1W), com 
efeito destrutivo e resposta térmica, e não cirúrgico ou de baixa potência (<1W), com efeito 
fotoquímico, usado no tratamento clínico da dor e cicatrização de feridas (ORTIZ et al, 2001; 
PRENTICE, 2002). 
 
Os Lasers comumente usados são o Hélio-Neônio (HeNe) e o Arsenieto de gálio 
(AsGa). O primeiro utiliza uma combinação gasosa em um tubo pressurizado o que forma um 
feixe na porção vermelha do espectro eletromagnético, com um comprimento de onda entre 
(λ630 a λ700 nm), e poder de penetração menor em torno de até dezenove milímetros de 
profundidade da derme. Já os aparelhos de Arsenieto de gálio utilizam um diodo 
semicondutor, com comprimento de onda entre λ770 nm até λ904 nm, garantindo maior poder 
de penetração em torno de três centímetros (ORTIZ et al, 2001; PRENTICE, 2002). 
 
Ao aplicar-se o Laser sobre uma área do corpo, a energia depositada nos tecidos 
transformar-se-á em outro tipo de energia. Tal emissão de fótons pode produzir reações 
fotoquímicas que conforme Kottke & Lehmann (1994) produzem intensidade da reação 
biológica dependente da absorção, reflexão e transmissão do comprimento de onda, da 
densidade de energia, do tempo de exposição e do fluxo sanguíneo. 
20 
 
 
A interação fotoquímica se dá com o fornecimento de energia para as 
mitocôndrias da célula que possui estruturas fotossensíveis e convertem ADP em ATP 
regulando seu metabolismo (síntese de proteínas, replicação, motilidade celular e manutenção 
do potencial da membrana), induzindo diferentes efeitos terapêuticos como antiinflamatório, 
antiedematoso, analgésico e cicatrizante (LABBE et al., 1990; THEODORO et al., 2002). 
 
A energia absorvida exerce um estímulo na produção de ATP no interior das 
células provocando a aceleração das mitoses, aumento da lise de fibrina e liberação de 
substâncias pré-formadas como a histamina, serotonina e bradicinina, com inibição da 
produção de prostaglandinas, mecanismo similar produzido por outros antiinflamatórios não 
hormonais (RODRIGUES; GUIMARÃES, 1998). 
 
A ação primária para o controle da inflamação e do edema dar-se-á, segundo 
Prentice (2002), pela interrupção da formação dos substratos intermediários essenciais para a 
produção dos mediadores químicos inflamatórios como quininas, histaminas e 
prostaglandinas. Acredita-se também que possa aprimorar a permeabilidade da membrana 
celular que regula a pressão osmótica-hidrostática intersticial. Desta maneira, durante o 
trauma tecidual o fluxo do liquido nos espaços intracelulares seria reduzido. 
No que se refere à ação cicatrizante, o aumento da produção de ATP acelera a 
velocidade mitótica e de cicatrização, proporcionando melhor trofismo dos tecidos. Kitchen 
(2003) relata os efeitos positivos da radiação em diversas feridas experimentais incluindo 
lesões musculares, tendíneas, queimaduras e feridas abertas de pele de vários tipos. Em 
pesquisas experimentais, a revascularização de feridas cirúrgicas foi constatada após o décimo 
quinto dia de irradiação o que influencia positivamente em tecidos com déficit vascular 
(TATARUNAS et al, 1998). 
 
O procedimento desta terapêutica é relativamente simples, somente o tempo de 
aplicação e o pulso variam. O aplicador é dirigido perpendicularmente para o tecido em 
tratamento. Uma alternativa é a técnica da varredura, em que a ponta do laser deve ser 
mantida de 5 a 10 milímetros de distância da ferida (PRENDICE, 2002). 
 
21 
 
 
Sobre o processo de reparo tecidual, Amaral (1998) investigou as aplicações de 
diferentes dosagens realizadas pontualmente sobre a pele na região correspondente ao ventre 
do músculo tibial anterior direito de camundongos, à dose 2.6, 8.4 e 25J/cm2. O músculo 
contralateral foi submetido a placebo. Os resultados através da análise morfométrica 
mostraram o aumento da densidade mitocondrial dessas fibras, além de promover uma 
melhora qualitativa no processo de cicatrização à dosagem de 2.6J/cm2. Num estudo triplo-
cego em humanos, Hopkins e colaboradores (2004) concluíram que esta modalidade 
terapêutica foi efetiva para potencializar a cicatrização da ferida e a redução da dor em 
desordens músculo esqueléticas. 
 
Nos processos inflamatórios, o limiar de excitabilidade dos receptores dolorosos 
encontra-se reduzido, proporcionando o chamado quadro de “hiperalgia”. Esse fato se deve à 
ação da bradicinina que é potencializada na presença das prostaglandinas. Segundo Veçoso 
(1993) um dos efeitos bioquímicos do laser diz respeito à interferência na síntese de 
prostaglandinas, inibindo-a, confirmando a ação de muitos antiinflamatórios não-hormonais. 
 
Uma das ações da laserterapia é na reorganização celular e nos vasos sanguíneos, 
modulando a neovascularização, tendo como conseqüência diminuição da perda funcional, 
incremento da oxigenação tecidual e aumento da microcirculação regional. A neoformação 
vascular ou angiogênese serviria como fonte de nutrientes e oxigênio, além de meio de 
condução de células fibroblásticas, o que contribui para o processo de cicatrização tecidual 
(VICENSI; CARVALHO, 2002). 
 
A revascularização de feridas cirúrgicas foi constatada por Tatarunas e 
colaboradores (1998) após o décimo quinto dia de irradiação do laser o que influenciou 
positivamente na cicatrização de tecidos com déficit vascular. Schindl (1998) observou em 
pacientes portadores de diabetes submetidos ao laser do tipo HeNe durante nove dias 
consecutivos, que a densidade volumétrica dos capilares foi duas vezes maior que o grupo 
controle, porém não verificou diferenças significativas após o décimo quinto dia de 
irradiação. 
 
22 
 
 
Em células eucarióticas o laser promove a proliferação celular sendo que nos 
neurônios ocorre o mesmo efeito, potencializando o crescimento do nervo. Anders et al. 
(2005) comprovaram que esta irradiação alterou a taxa de regeneração do nervo facial em 
ratos. Em nível de condução elétrica nervosa, Belkin & Schwartz (1994) evidenciaram a 
estimulação do limiar de excitabilidade, alívio da dor e retardamento da degeneração nervosa 
pós-traumática. 
 
A hipótese de que a radiação a laser era absorvida por sensibilizadores endógenos 
como: porfirinas ou fotorreceptores, que são componentes da cadeia respiratória, foi proposta 
por Rochkind & Ouaknine (1992). Tal radiação aumenta a liberação de Ca2+ pela mitocôndria 
para o citoplasma juntamente ao aumento da produção de ATP. Karu e colaboradores (1995) 
comprovaram que o laser HeNe ampliou o nível de ATP em células cultivadas in vitro. 
Costardi e colaboradores (2008) demonstraram o efeito do laser λ 670 nm, na lesão do 
músculo gastrocnêmio de ratos, tais como menor edema, melhor organização do tecido 
muscular e conjuntivo em relação ao grupo controle. 
23 
 
 
3. OBJETIVOS 
 
Geral 
 
Avaliar o efeito do laser, λ904 nm, na cicatrização por 1ª intenção no modelo experimental 
em ratos. 
 
Específicos 
 
Avaliar, semi-quantitativamente, o infiltrado inflamatório na ferida cirúrgica após aplicação 
do laser por 7 e 14 dias. 
 
Analisar, descritivamente, a formação do colágeno após administração do laser por 7 e 14 
dias. 
 
Identificar o número de vasos neoformados nos grupos irradiados por laser ao 7º e 14º dias. 
 
 
 
24 
 
 
4. MÉTODOS 
 
4.1 ANIMAIS E ASPECTOS ÉTICOS 
 
Trata-se de uma pesquisa experimental de caráter quantitativa que foi aprovada 
pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da Universidade Federal de Sergipe, sob o 
protocolo 05/08 (anexo A). Foram utilizados quarenta ratos adultos, machos, da linhagem 
Wistar, pesando entre 150 e 250 gramas, idade aproximada de dois meses e procedentes do 
biotério. Estes permaneceram acondicionados em gaiolasde polipropileno contendo três 
roedores por caixa, mantidos à temperatura ambiente, recebendo água e ração ad libitum. Os 
animais foram divididos em 4 grupos contendo 10 ratos, posteriormente foram submetidos ao 
corte cirúrgico e suturados: 
 
- Grupo 1 (G1) – Controle. Os animais foram submetidos ao estresse da aplicação 
do laser, porém com o aparelho desligado e sacrificados ao 8º dia. 
- Grupo 2 (G2) – Irradiado. Os animais foram submetidos a aplicação do Laser e 
sacrificados ao 8º dia. 
- Grupo 3 (G3) – Controle. Os ratos foram submetidos à aplicação do laser, porém 
com o aparelho desligado e sacrificados ao 15° dia. 
- Grupo 4 (G4) – Irradiado. Os ratos foram submetidos a aplicação do Laser e 
sacrificados ao 15° dia. 
 
4.2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
 
Os procedimentos anestésicos e de técnica operatória foram baseados em 
metodização já descrita (POOLE Jr et al., 1984). Os animais foram posicionados em decúbito 
dorsal, tricotomizados e submetidos à incisão por abertura crânio-caudal, seguindo a linha 
Alba da parede abdominal, por bisturi lâmina nº 15 (Solidor). A incisão teve o comprimento 
de um centímetro, demarcado por régua, abrangendo pele, tecido subcutâneo e musculatura 
abdominal sendo posteriormente suturados de maneira contínua por fios de nylon 5-0 (Med 
Goldman) (figura 1). 
 
25 
 
 
A seleção do tipo de corte e da sutura baseou-se na similaridade do procedimento 
cirúrgico desses animais a dos seres humanos, sendo os mesmos adequados para estudos que 
caracterizam a cicatrização por união primária das bordas da lesão. 
 
Houve uma preocupação em manter eqüidistância entre os pontos das suturas de 
maneira padronizada, para não considerar este fator como variável. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 1 – Incisão por abertura crânio-caudal seguindo a linha Alba (A) e suturas contínuas por fio de nylon 5-0 
(B). 
Fonte: Dados da Pesquisa (UFS, 2010). 
 
4.3 PROTOCOLO DE IRRADIAÇÃO A LASER λ904 nm 
 
Foi utilizado um aparelho de laser Diodo de GaAlAs (KROMAN – Registro no 
Ministério da saúde: 800996-8/ CREA: 0600538296/ São Paulo/Brasil), densidade de 
potência = 45 W, densidade de energia = 3J/cm2, área de sport do feixe = 0,02 cm², 
comprimento de onda infravermelho λ904 nm, emissão da luz contínua, com técnica de 
aplicação por varredura, perpendicular a lesão, à distância de 0,5 cm da incisão (figura 2), 
perfazendo um tempo de dois minutos com a utilização de um cronômetro digital. 
 
 B 
26 
 
 
O aparelho foi calibrado antes e após o experimento. As sessões foram iniciadas 
logo após o procedimento cirúrgico e mantidas aplicações diárias, perfazendo um número 
total de sessões de 7 e 14 dias. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 2 – Aparelho de Laser KC-605 (A) e aplicação do mesmo à distância de 0,5 cm da incisão cirúrgica (B). 
Fonte: Dados da Pesquisa (UFS, 2010). 
 
4.4 AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA 
 
Oito dias após os experimentos, os animais dos grupos 1 e 2 foram sacrificados 
por inalação excessiva de éter para retirada do segmento de tecido da cicatriz cirúrgica. Em 
seguida, os espécimes foram fixados em solução de formol a 10% tamponado, durante 24 
horas, a temperatura ambiente. Posteriormente, estes foram processados histologicamente, 
emblocados em parafina e mantidos a cortes seriados com 4 µm de espessura, escolhendo-se, 
aleatoriamente, dois cortes a serem fixados nas lâminas. Ao término de 15 dias, os grupos 3 e 
4 passaram pelo mesmo procedimento. 
 
Os cortes foram submetidos à coloração por Hematoxilina-Eosina (HE) para 
avaliação histológica (1) do edema intersticial, (2) da celularidade do infiltrado inflamatório 
(qualitativa e quantitativa), (3) da fibrose, (4) da angiogênese e (5) de outras alterações 
B A 
27 
 
 
celulares. A intensidade do processo inflamatório foi analisada de acordo com os seguintes 
critérios: 
+1 (Escasso) – quando as células inflamatórias, independentemente de seu 
fenótipo, constituírem menos de 10% da população celular na área da lesão. 
+2 (Moderado) – quando as células inflamatórias, independentemente de seu 
fenótipo, constituírem entre 10% e 50% da população celular observada na área da lesão. 
+3 (Intenso) – quando as células inflamatórias, independentemente de seu 
fenótipo, constituírem mais de 50% da população celular na área da lesão. 
 
Além disso, os cortes foram submetidos ao método histoquímico Tricrômico 
Masson para análise descritiva da deposição de colágeno. Para tanto, as fibras colágenas 
destacadas em azul foram semi-quantificadas e categorizadas de acordo com sua disposição e 
aparência em: 
+1 (Escasso) – fibras colágenas exibindo disposição entrelaçada, de aparência 
delgada e delicada dispostas em toda a extensão da ferida. 
+2 (Moderado) – fibras colágenas exibindo disposição entrelaçada, de aparência 
delgada e delicada na superfície da lesão, mas espessa e grosseira na região central. 
+3 (Intenso) – quando predominaram fibras colágenas, exibindo disposição 
entrelaçada e/ou paralela, de aparência espessa e grosseira. 
 
A técnica de Picrosirius Red foi eleita para examinar e classificar as fibras 
colágenas qualitativamente, o que de acordo com a sua tipagem, a orientação espacial, a 
espessura e a dimensão das fibras. Quando observadas ao microscópio de luz polarizada, as 
fibras revelavam-se birrefringentes, aparecendo brilhantes contra o fundo escuro, 
evidenciando-se a ocorrência do colágeno do tipo I nas regiões de coloração que variava do 
amarelo, laranja escuro, chegando ao vermelho brilhante; o colágeno do tipo III foi 
visualizado na cor verde brilhante. 
A contagem dos vasos sanguíneos neoformados foi reforçada pelo emprego da 
técnica de imuno-histoquímica, utilizando anticorpos primários anti-CD34 e pela análise por 
técnicas de morfometria do número de vasos neoformados e células endoteliais. O número 
médio de vasos sanguíneos foi determinado pela contagem de capilares selecionados 
transversalmente em cada campo histológico e a média foi obtida por meio da razão entre o 
somatório de vasos contados e o quantitativo de campos analisados. 
 
28 
 
 
Para a avaliação das variáveis, utilizou-se, a contagem diferencial de células 
inflamatórias e de células endoteliais, pelas respectivas técnicas supracitadas, em dez campos 
histológicos alternados e selecionados da esquerda para a direita e de cima pra baixo, por 
meio de um microscópio óptico acoplado a uma câmara de vídeo e a um computador com a 
objetiva de 40X, realizadas por fração de área através de técnicas de processamento de 
imagens fotomicrografadas por meio de software de captura de imagens Olympus 2000®. 
 
4.5 ANÁLISE ESTÁTISTICA 
 
Para verificação de existência ou não de diferença estatisticamente significativa 
entre os grupos na avaliação do infiltrado inflamatório, quantificação das fibras colágenas e 
número médio de vasos neoformados, as médias de cada grupo foram comparadas através do 
teste de Shapiro wilk para examinar estimativa paramétrica das amostras. Posteriormente, 
utilizou-se a análise de variância ANOVA com extensão “post-hoc” teste de Tukey, o qual é 
indicado para comparações múltiplas de grupos independentes, observando a diferença entre 
as duas médias, o desvio-padrão dos grupos e o tamanho de cada amostra. 
 
Os campos histológicos oriundos da distribuição das fibras de colágeno, pela 
técnica de Picrosirius, foram comparados de maneira descritiva. Foi considerado um intervalo 
de confiança de 95%. Todas as análises dos dados foram realizadas através do Microsoft 
Office Excel 2003. 
 
29 
 
 
5. RESULTADOS 
 
5.1 AVALIAÇÃO DO INFILTRADO INFLAMATÓRIO 
 
Conforme apresentado na tabela 1, amostras que compunham o grupo controle 
(G1) demonstraram uma reação de infiltração inflamatória intensa. Em alguns espécimes, 
observou-se maior predomínio de células leucocitárias do tipo polimorfonucleares, como 
neutrófilos (04 casos) e eosinófilos(02 casos), no sítio da lesão, caracterizando um intenso 
infiltrado inflamatório com acúmulo de macrófagos em nove dos cortes histológicos (figura 
3). 
 
Com relação ao grupo G2, verificou-se a redução do número de células 
leucocitárias do tipo polimorfonucleares em todas as amostras. Além disso, evidenciou-se a 
diminuição de células fagocitárias, como macrófagos, no local da lesão em 80% dos casos. 
Desta forma, o infiltrado inflamatório foi categorizado como subagudo em razão da 
observância de uma quantidade mais expressiva de leucócitos mononucleares classificados 
como linfócitos. 
 
Os cortes histológicos dos grupos G3 e G4 mostraram um tecido conjuntivo 
dotado de infiltrado inflamatório de moderada intensidade exibindo mesma proporção de 
células leucocitárias (mononucleadas e polimorfonucleadas). Os dados foram analisados 
estatisticamente e não evidenciaram diferenças significativas entre os grupos sacrificados ao 
8º dia (p= 0,08), bem como entre os grupos sacrificados ao 15º dia (p = 0,3). 
 
30 
 
 
Tabela 1: Análise morfológica da reação do infiltrado inflamatório nos grupos controle e 
irradiado, sacrificados ao 8º (G1 e G2) e 15º dia (G3 e G4). 
 
ANIMAIS GRUPOS 
Ratos G1-Controle G2-Irradiado G3-Controle G4-Irradiado 
 CI E N M L CI E N M L CI E N M L CI E N M L 
R1 +3 +1 +1 +3 +1 +2 +1 +1 +2 +2 +2 +1 +1 +2 +1 +2 +1 +1 +2 +1 
R2 +3 +1 +1 +3 +1 +3 +1 +1 +2 +2 +2 +1 +1 +2 +1 +2 +1 +1 +2 +1 
R3 +3 +1 +1 +2 +1 +2 +1 +1 +2 +1 +2 +1 +1 +2 +1 +2 +1 +1 +2 +1 
R4 +3 +1 +2 +3 +1 +2 +1 +1 +2 +2 +2 +1 +1 +2 +1 +2 +1 +1 +2 +1 
R5 +3 +1 +1 +3 +1 +3 +1 +1 +2 +1 +2 +1 +1 +2 +1 +2 +1 +1 +2 +1 
R6 +3 +1 +1 +3 +1 +2 +1 +1 +2 +1 +2 +1 +1 +2 +1 +2 +1 +1 +2 +1 
R7 +3 +2 +2 +3 +1 +3 +1 +1 +2 +1 +2 +1 +1 +2 +1 +2 +1 +1 +2 +1 
R8 +3 +1 +2 +3 +1 +2 +1 +1 +2 +1 +2 +1 +1 +2 +1 +2 +1 +1 +2 +1 
R9 +3 +2 +1 +3 +1 +3 +1 +1 +3 +2 +2 +1 +1 +2 +1 +2 +1 +1 +2 +1 
R10 +3 +1 +2 +3 +1 +3 +1 +1 +3 +2 +2 +1 +1 +2 +1 +2 +1 +1 +2 +1 
R = Rato; E = Eosinófilos; N = Neutrófilos; M = Macrófagos; L = Linfócitos; CI = Celularidade do Infiltrado 
+ 1 (Leve) = quando as células inflamatórias representam menos que 10% da população celular; + 2 (Moderada) 
= quando as células inflamatórias constituíram entre 10 e 50% da população celular; + 3 (Intensa) = quando as 
células inflamatórias representam mais que 50%, da população celular observada no foco da lesão. 
 
Fonte: Dados da Pesquisa (UFS, 2010). 
31 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 3 – Reação inflamatória aguda no grupo controle G1 (A) e subaguda no grupo irradiado G2 (B) sacrificados 
ao 8º dia. Redução da inflamação em ambos os grupos sacrificados ao 15º dia, controle G3(C) e irradiado G4 
(D). (Hematoxilina-eosina, 400x). 
Fonte: Dados da Pesquisa (UFS, 2010). 
32 
 
 
5.2 ANÁLISE DESCRITIVA DAS FIBRAS DE COLÁGENO 
 
De acordo com a tabela 2, nas amostras que compunham o grupo controle (G1) 
sacrificados ao 8º dia, demonstrou-se fibras colágenas de aparência delgada, aspecto delicado 
e disposição entrelaçada na maioria dos animais (06 casos), sendo classificadas como padrão 
+1 (Escasso). Quando comparadas com o grupo irradiado (G2), as fibras colágenas exibiram 
um padrão misto, ora com uma aparência mais espessa, de aspecto denso em toda a extensão 
da área da ferida padrão +3 (Intenso), ora mais delgado, particularmente nas margens da 
ferida, apesar de, na região central, ter havido persistência do arranjo denso compactado, 
caracterizando o padrão +2 (Moderado). 
 
Nos grupos sacrificados ao 15º dia, observou-se no grupo controle (G3) um 
colágeno mais espesso com fibras densamente arranjadas em toda a área da ferida, mostrando 
um padrão +3 em todos os cortes. Já no grupo irradiado (G4), verificou-se um misto de fibras 
colágenas, ora mais espessas, com fibras densamente arranjadas em toda a extensão da lesão, 
caracterizadas como um padrão de colagenização +3 em sete cortes, ora apresentando-se mais 
delgadas nas margens da lesão, porém com fibras densas na região central em três das 
amostras, classificada como padrão +2 (figura 4). 
 
Identificou-se, através da análise descritiva das fibras de colágeno que os grupos 
irradiados tiveram tendência a padrões similares de colagenização, variando, ora padrão +2, 
ora +3 em sua maioria, quando comparados aos grupos controles. Não houve diferenças 
estatísticas entre os grupos sacrificados ao 8º dia (p= 0,06), bem como entre os grupos 
sacrificados ao 15º dia (p = 0,15). 
 
33 
 
 
Tabela 2: Análise descritiva das fibras de colágeno nos grupos controle e irradiado, 
sacrificados ao 8º e 15º dia. 
 
ANIMAIS GRUPOS 
 G1-Controle G2-Irradiado G3-Controle G4-Irradiado 
R1 +1 +3 +3 +2 
R2 +1 +1 +3 +2 
R3 +1 +2 +3 +3 
R4 +2 +3 +3 +3 
R5 +3 +3 +3 +3 
R6 +1 +2 +3 +3 
R7 +3 +3 +3 +3 
R8 +1 +3 +3 +3 
R9 +1 +2 +3 +3 
R10 +2 +2 +3 +2 
Escore de Colagenização: +1 (Escasso) = colágeno delgado, com fibras frouxamente dispostas em toda a 
extensão da ferida; +2 (Moderado) = colágeno fino nas margens da ferida, porém com fibras densas na região 
central; +3 (Intenso) = colágeno espesso, com fibras densamente arranjadas em toda a área da ferida. 
Fonte: Dados da Pesquisa (UFS, 2010). 
34 
 
 
 
 
Fig.4 – Colagenização dos animais sacrificados ao 8° dia; colágeno delgado, com fibras frouxamente dispostas, 
escore +1 no grupo controle G1 (A); colágeno espesso, com fibras densamente arranjadas, escore +3 no grupo 
irradiado G2 (B). Escore de Colagenização similares nos ratos sacrificados ao 15° dia; colágeno espesso, com 
fibras densamente arranjadas em toda área da ferida, nos grupos controle G3(C) e irradiado G4 (D). (Tricrômico 
Masson, 400 x). 
Fonte: Dados da Pesquisa (UFS, 2010). 
35 
 
 
5.3 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DAS FIBRAS DE 
COLÁGENO 
 
No sétimo dia, observou-se, no grupo controle (G1), a predominância de 
deposição de colágeno do tipo I (08 casos), com fibras orientadas paralelamente em 06 
amostras, de aparência espessa em sua maioria (07 casos), e alongada em 08 lâminas. Já no 
grupo G2 (irradiado, uma combinação de colágeno tipo III e I em proporções similares foi 
evidenciada em 02 casos predomínio de colágeno tipo III em 05 casos e tipo I em 03 
amostras; em 06 casos, destacou-se uma orientação paralela, de aparência espessa ou delgada 
(08 casos), e entrelaçada nos demais. Além disso, os feixes se mostraram ora mais curtos, ora 
mais alongados, sem, contudo, demonstrar um padrão específico de comprimento (figura 5). 
 
No décimo quarto dia, verificou-se, no grupo controle (G3), uma caracterização 
de colágeno do tipo I em todos os espécimes, com orientação reticulada das fibras, em sua 
maioria (07 cortes), de aparência espessa em sua totalidade, e com feixes mais alongados em 
90% dos casos. Em comparação com o grupo irradiado (G4), as fibras de colágeno 
apresentaram uma mescla do tipo III e I em quantidades parecidas em quatro dos casos, 
predomínio do tipo III em três amostras, e elevado agrupamento de colágeno tipo I em três 
espécimes. De acordo com a orientação, comportavam-se ora paralelamente ora 
entrelaçadamente em proporções idênticas, de aparência delgada (04 espécimes) e feixes 
curtos em quatro dos casos. 
 
Notou-se que a caracterização morfológica das fibras de colágenos (anexo B) nos 
grupos irradiados teve tendência a um rearranjo de colágeno incipiente de predomínio ora tipo 
III, ora tipo III e I, quando confrontados com os grupos controles. 
 
 
 
 
 
36 
 
 
 
 
Fig. 5 – Nos animais sacrificados ao 8° dia; observou-se no grupo controle (A) a predominância de deposição de 
colágeno do tipo I nas regiões de coloração que variava do amarelo a laranja escuro, chegando ao vermelho 
brilhante. Já no grupo irradiado (B) predomínio de colágeno tipo III visualizado nas áreas de cor verde brilhante. 
No 15º dia, verificou-se no grupo controle (C), uma caracterização decolágeno do tipo I em todos os espécimes, 
contrastando com o grupo irradiado (D) em que as fibras de colágeno apresentaram uma mescla do tipo III e I 
(Picrosirius Red, 400 x). 
Fonte: Dados da Pesquisa (UFS, 2010). 
37 
 
 
5.4 QUANTIFICAÇÃO DE VASOS SANGUÍNEOS 
NEOFORMADOS 
 
Com relação à análise morfométrica (figura 6), verificaram-se diferenças 
significativas no quantitativo de vasos sanguíneos neoformados entre as amostras dos animais 
irradiados, sacrificados ao 8º dia, G1 e G2 (p=0,001), e nos sacrificados ao 15º dia G3 e G4 
(p=0,02). Assim, observou-se que o número médio de vasos nos grupos irradiados por laser 
(G2) foi 0,66±0,36, expressivamente superior a média de 0,168±0,009, obtida no grupo 
controle (G1). Notou-se, também, nos grupos sacrificados ao 15º dia, que a quantidade de 
vasos novos de 0,532±0,16 observada no grupo irradiado (G4) significativamente maior que a 
média de 0,374±0,10, obtida no controle (G3). Não houve diferenças entre os grupos 
irradiados G2 x G4 (p=0,30), bem como entre os grupos controles G1 x G3 (p=0,001). 
 
Verificou-se que a quantidade do número médio de vasos sanguíneos 
neoformados nos grupos irradiados teve expressivo aumento em relação aos grupos controles. 
 
Gráfico 1: Análise do número médio de vasos neoformados por campo histológico. 
 
 
 
Fonte: Dados da Pesquisa (UFS, 2010). 
 
38 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 6 – Vasos sanguíneos neoformados (setas pretas) nos grupos sacrificados ao oitavo dia nos grupos controle 
G1 (A) e irradiado G2 (B); Redução do número de vasos neoformados nos ratos sacrificados ao 15° dia nos 
grupos controle G3(C) e irradiado G4 (D) (Anti-CD34, 400 x). 
Fonte: Dados da Pesquisa (UFS, 2010). 
39 
 
 
6. DISCUSSÃO 
 
O modelo utilizado neste estudo foi devido a sua fácil obtenção e manuseio 
associando-se às considerações que indicam similaridades anatômicas e biológicas entre as 
paredes abdominais desses animais e a dos seres humanos, principalmente quanto à estrutura 
do tecido epitelial. Além disso, o processo de reparação total na derme dos roedores ocorre 
em 50 dias após o procedimento cirúrgico, que é semelhante ao que ocorre nos seres humanos 
(MEEKS, et al., 1995; VIDINSKY et al., 2006). A seleção dos períodos de sacrifício em 8 e 
15 dias baseou-se na existência de alterações morfológicas suficientes para serem observadas, 
avaliadas e quantificadas entre os dois grupos (controle e irradiado) (NASCIMENTO, 2001; 
CAMPANHA, 2003; CARVALHO, 2003). O que pode ser justificado pela sua eleição como 
modelo experimental nesta pesquisa. 
 
Na presente pesquisa, a lesão tecidual foi suturada assemelhando-se com o 
mecanismo de cicatrização realizado nos procedimentos cirúrgicos hospitalares, evento pouco 
explorado na literatura, podendo ser uma alternativa terapêutica em episódios que possam 
interferir na cicatrização tecidual, embora diversos estudos abordem os efeitos da 
fotobiomodulação laser em ferimentos cutâneos abertos (NASCIMENTO, 2001; 
CARVALHO, 2003; KITCHEN, 2003; HOPKINS et al., 2004; MEIRELLES et al., 2005). 
 
Não existe consenso na literatura em relação à escolha da dosimetria durante a 
aplicação do laser. Albertini e colaboradores (2000) investigaram o efeito do laser no 
processo inflamatório agudo, em modelo clássico de edema em pata de ratos, induzido por 
injeção de carragenina, baseado em diferentes protocolos para determinar densidade de 
energia, período e taxa de repetição. Os resultados demonstraram que a densidade de energia 
para obter o efeito antiinflamatório com Laser de GaAsAl foi de 1J/cm² e 2,5J/cm², reduzindo 
o edema em 27%. A densidade de energia de 2,5J/cm² produz efeitos antiinflamatórios 
similares ao diclofenaco de sódio na dose de 1 mg/kg. Medrado e colaboradores (2003), 
analisando o efeito cicatrizante nas intensidades de 4 e 8J/cm² em ferimentos cutâneos em 
ratos, observaram que a dose adequada capaz de promover a bioestimulação foi de 4J/cm². 
Embora os animais irradiados com 8 J/cm² apresentassem diferenças estatísticas em relação 
ao controle no que diz respeito a redução do infiltrado inflamatório e do edema tecidual. 
Outros autores remetem que a dosimetria de 3J/cm² é capaz de produzir ação antiinflamatória, 
40 
 
 
analgésica e cicatrizante (VEÇOSO, 1993; RODRIGUES; GUIMARÃES, 1998; PRENTICE, 
2002). Concordando com esse tipo de entendimento é que esta densidade de energia de 3J/cm² 
foi eleita para o desenvolvimento desta pesquisa. Ademais, há uma concordância dos autores 
quanto às dosagens muito elevadas o que poderiam inclusive exercer um efeito inibitório 
sobre as atividades metabólicas celulares. 
 
Ao analisarmos o infiltrado inflamatório na ferida pela contagem diferencial de 
células, verificou-se, neste experimento, tendência a redução quantitativa de células 
inflamatórias, do tipo neutrófilo e macrófago no grupo irradiado, apesar de não existirem 
diferenças significativas entre as amostras. Também, observou-se maior infiltração linfocitária 
no grupo irradiado em detrimento de maior infiltração neutrófilica no grupo controle 
sugerindo que a fotobiomodulação do laser exerce um estímulo na produção de ATP nas 
células promovendo aumento da velocidade das mitoses e incremento à microcirculação, 
intensificando a nutrição celular e proporcionando a modulação nas fases do processo 
inflamatório como ocorreu nos grupos irradiados tanto naqueles sacrificados ao 8º quanto ao 
15º dia. É relevante salientar que estes diferentes resultados podem ser justificados pela 
metodologia utilizada em cada estudo, concordando com os achados da literatura sobre os 
efeitos da biomodulação laser na redução do contingente de células inflamatórias. Carvalho 
(2003) analisou os efeitos do Laser Diodo de GaAs (Arseneto de Gálio 904 nm) em 
diferentes fases do processo de cicatrização, ao 5°, 8°, 18°, 28° dias após lesão. Na análise 
histológica, observou nos animais irradiados aceleração da fase inflamatória, com antecipação 
da fase de maturação, favorecendo o surgimento mais intenso de fibroblastos e com maior 
quantidade de fibras colágenas bem organizadas. No estudo de Ribeiro e colaboradores (2009-
b), ao analisar morfologicamente a cicatrização de feridas de segunda intenção em ratos 
submetidos à irradiação diária de laser com intensidade de 16J/cm2, verificaram a redução da 
intensidade da reação inflamatória e incremento substancial do processo de epitelização ao 7º 
e 14º dias, além de estimular a deposição de fibras colágenas nos estágios finais da reparação 
tecidual. Outros autores consideram que a radiação laser provoca uma aceleração da fase 
inflamatória, observando uma transição do fenótipo leucocitário de polimorfo para 
mononuclear, ou seja, a redução do número de células leucocitárias (neutrófilos e eosinófilos) 
e o aumento de linfócitos no sítio da lesão (KARU, 1995; CORREA et al., 2003; PUGLIESE 
et al., 2003; ROCHA-JÚNIOR et al., 2006; RIBEIRO et al., 2009a). 
 
41 
 
 
Em relação à análise descritiva das fibras de colágeno, constatou-se nas secções 
histológicas dos grupos irradiados padrões singulares de deposição colagênica. Nos grupos 
sacrificados ao 8º dia, as fibras de colágeno exibiram um padrão bifásico, caracterizando um 
colágeno espesso com fibras densamente arranjadas em toda a área da lesão ou na região 
central identificando o padrão em +2. Sendo que ao 15º dia, a colagenização era intensa, em 
sua maioria, apresentando fibras grosseiras e espessas refletindo a aparência de tecido 
conjuntivo fibroso denso. É necessário ressaltar que, na pele íntegra, o colágeno verificado na 
derme exibe feixes que não possuem uma disposição paralela e se interconectam em vários 
pontos, evidenciando uma multiplicidade de direções (BURKITT et al., 1994). Todavia, 
maior número de estudos aponta que a fotobiomodulação laser parece interferir no arranjo das 
fibrilas à medidaque são sintetizadas e agrupadas em feixes mais densos. De fato, estes 
aspectos organizacionais têm sido cada vez mais ratificados na literatura (REIS et al., 2007). 
Tal investigação foi fonte de estudo desenvolvido por diversos autores que constataram 
expressiva redução de edema e infiltrado inflamatório, com aceleração da síntese de colágeno, 
alterando o padrão de orientação e melhorando a organização das mesmas durante a 
cicatrização tecidual (PUGLIESE et al., 2003; GARAVELLO-FREITAS et al., 2003; 
SALATE et al., 2005; MEDRADO, 2007). Isto porque durante a fase de reparo, 
correspondente ao remodelamento da matriz extracelular, ocorre simultaneamente síntese e 
degradação do colágeno intersticial, tal processo é desencadeado pelos fibroblastos e pelas 
células inflamatórias remanescentes no local da lesão. Acredita-se que a ação fibrinolítica do 
laser proporciona a dissolução do cancelamento decorrente da coagulação do plasma 
estimulando a proliferação de fibroblastos e aumentando a síntese de fibras colágenas 
(RODRIGUES; GUIMARÃES, 1998). 
 
Uma caracterização morfológica das fibras de colágeno, constatou-se, em sua 
maioria, um arranjo de colágeno classificado como tipo III nos grupos irradiados ao 7º dia, 
porém, nas secções histológicas dos grupos irradiados ao 14º dia, verificou-se uma mescla de 
predomínio ora tipo III, ora tipo III e I, com orientação paralela, de aparência delgada e 
comprimento curto, contrastando com o grupo controle identificado por um colágeno do tipo 
I. É importante salientar que nas fibras colágenas, coradas com Sirius Red e analisadas através 
de luz polarizada, demonstrou que nas fases iniciais da cicatrização tecidual as fibras são 
delicadas, exibindo um arranjo frouxo e uma tonalidade amarelo-esverdeada, caracterizando 
um colágeno do tipo III. Por outro lado, nas etapas mais tardias do processo de reparo as 
42 
 
 
fibras exibem um padrão organizacional mais compacto, com feixes mais espessos, de 
coloração vermelho-alaranjada, configurando um colágeno do tipo I (RICH; WHITTAKER, 
2005; MEDRADO, 2007). O predomínio do colágeno do tipo III proporciona uma cicatriz 
frágil no seu tensionamento, por outro lado, o excesso de colágeno do tipo I (maduro) é 
responsável por uma cicatrização de má qualidade, apresentando aspecto hipertrófico na 
aparência da pele (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). 
 
Outros autores relatam que o laser pode influenciar na microcirculação sanguínea, 
agindo sobre os esfíncteres pré-capilares, redistribuindo o fluxo sanguíneo e aumentando o 
aporte de nutrientes às células lesionadas através da formação de novos vasos a partir dos pré-
existentes. Este efeito acelera a microcirculação, de forma a criar alterações na pressão 
hidrostática capilar, que reabsorve edema e eliminam metabólicos, favorecendo o processo de 
cicatrização tecidual (RODRIGUES; GUIMARÃES, 1998; TATARUNAS et al., 1998; 
NUNEZ 2002; SCHINDI et al., 2003; CORAZZA; BAGNATO, 2005; VIEIRA, 2006). Tais 
achados concordam com os resultados do experimento, em que a proliferação de novos vasos 
sanguíneos nos grupos irradiados foi estatisticamente superior quando comparados com o 
controle. A maior quantidade vascular identificada nos grupos irradiados por laser (G2 e G4) 
pode refletir uma estimulação exacerbada da proliferação endotelial por citocinas liberadas 
pelas células inflamatórias. Sugere-se uma relação estreita entre a evolução dos eventos 
cicatriciais e a redução progressiva da neoformação vascular durante as etapas da fase de 
cicatrização tecidual, conforme ocorreu entre os grupos irradiados ao 7º e 14º dia, onde o 
número de vasos sangüíneos foi gradativamente reduzindo, porém ainda em maior quantidade 
quando comparado com o grupo controle neste mesmo período. 
 
Novos estudos tornam-se necessários para esclarecer os efeitos da 
fotobioestimulação do laser de baixa potência nas fases de cicatrização de tecidual por união 
primária das bordas da lesão. No entanto, ainda é premente a necessidade de ensaios 
biológicos posteriores que permitam esclarecer adequadamente o mecanismo de ação 
específico da irradiação laser sobre as diferentes populações celulares que participam do 
processo de reparo, antes de iniciar quaisquer ensaios clínicos. Considerando que a interação 
da microcirculação com os elementos da matriz extracelular caracterizam o desenvolvimento 
e a migração fibroblástica para o interior da ferida, garantindo melhor síntese de colágeno e 
melhor qualidade na cicatrização. 
43 
 
 
7. CONCLUSÕES 
 
Pode-se concluir que o laser λ904 nm na cicatrização por 1ª intenção no modelo 
experimental de ratos: 
 atuou como modulador da resposta inflamatória, acelerando o mecanismo 
de cicatrização por união primaria das bordas da lesão, visto que os 
animais tratados apresentaram tendência ao controle do processo 
inflamatório e do edema intersticial; 
 otimizou o arranjo e o padrão organizacional da maioria das fibras de 
colágeno do tipo III nos grupos irradiados; 
 estimulou a angiogênese, provocando um aumento no número médio de 
vasos neoformados nos animais irradiados. 
 
44 
 
 
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51 
 
 
 
52 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ANEXOS
53 
 
 
ANEXO A – COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ANIMAL 
(CEPA) 
54 
 
 
ANEXO B - ANÁLISE QUALITATIVA TRICRÔMICO DE 
MASSON 
 
Tabela 3: Caracterização morfológica do colágeno nos grupos sacrificados ao 8º dia, controle 
(G1) e experimental (G2) e animais sacrificados ao 15º dia, controle (G3) e experimental 
(G4). 
 
ANIMAIS TIPO ORIENTAÇÃO APARÊNCIA COMPRIMENTO 
 G1 G2 G3 G4 G1 G2 G3 G4 G1 G2 G3 G4 G1 G2 G3 G4 
R1 I III I III P P P R G D G D L C L C 
R2 I I I I E P R R/P D G G D/G L L C C/L
R3 I III I III P P/R R R G D/G G D L C/L L L 
R4 I I/III I I/III E P/R R R/P D D/G G D/G L C/L L C/L
R5 I I I I E E R R G G G D L L L C 
R6 I/III I I I/III P/R P P R/P D/G G G D/G C/L L L C/L
R7 I III I III P P P R G D G D L C L C 
R8 III III I I E P R E D G G G C C L L 
R9 I I/III I I/III P P/R R R/P G D/G G D/G L C L C/L
R10 I III I I/III P P R R/P G D G D/G L C L C/L
Legenda: 
Tipagem das fibras de colágeno: 
I = Tipo I de colágeno III = Tipo III de colágeno P = Paralelas 
R = Reticuladas E= Entrelaçadas G = Espessas 
D = Delgadas C = Curtas L = Longas 
Fonte: Dados da Pesquisa (UFS, 2010). 
 
 
55 
 
 
 
 
 
 
 
Effect of low level laser on sutured wound healing in rats 
 
 
Artigo submetido à Revista Acta Cirúrgica 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
56 
 
 
10 – ORIGINAL ARTICLE 
 
Wound Healing 
 
 
Effect of low level laser on sutured wound healing in rats1 
Efeito do laser de baixa potência na cicatrização de ferida cirúrgica em ratos 
 
Valdinaldo Aragão de MeloI, Denise Cristina Santos dos AnjosII, Ricardo Albuquerque 
JúniorIII, Daniel Barreto MeloIV, Fábio Ursulino Reis CarvalhoV 
 
1 Research performed at Postgraduate Program, Department of Medicine, Federal University 
of Sergipe, Brazil. Part of Master degree Thesis. 
 
I Full Professor, Department of Experimental Surgical, Federal University of Sergipe, 
Aracaju-SE, Brazil. Tutor, conception and design of the study and critical revision. 
 
II Fellow Master degree, Postgraduate Program in Health Sciences, Federal University of 
Sergipe, Aracaju-SE, Brazil. Intelectual and scientific contente of the study. 
 
III Full Professor, Department of Pathology of Institute of Technology and Research, 
Tiradentes University, Aracaju-SE, Brazil. Histological examinations. 
 
IV Graduate student, Faculty of Physical Education, Federal University of Sergipe, Aracaju-
SE, Brazil. Helped with technical procedures. 
 
V Graduate student, Faculty of Medicine, Federal University of Sergipe, Aracaju-SE, Brazil. 
Helped with technical procedures. 
 
ABSTRACT 
Purpose: To evaluate the effect of low-level laser therapy (LLLT) λ904 nm on healing of 
surgical wounds in rats. Methods: Forty male Wistar rats were used, divided into four groups, 
underwent incision along the lines Alba covering skin, subcutaneous and muscle abdominal, 
sutured continuously for nylon 5-0. Eight and fifteen days after the surgery process, the 
repairing area was removed and histological sections were stained with hematoxylin-eosin to 
assess cellularity inflammatory, Masson´s Trichrome and Picrossirus to quantify the collagen 
fibers and immunohistochemical technique for counting newly formed vessels. The data were 
compared statistically using analysis of variance ANOVA, with a "post-hoc Tukey test, p 
<0.05. Results: Low-level laser therapy reduced the intensity of the inflammatory reaction 
and influenced the dynamic of the immunoinflammatory response by inducing switching of 
the leukocyte infiltration pattern (neutrophilic to lymphoplasmacytic infiltration). Also 
stimulate the deposition and enhance the organization of collagen fibers, featuring a delicate 
collagen type III. Furthermore, it appeared to a significant increase in the average number of 
newly formed vessels (p = 0.00 and p = 0.02, respectively). Conclusion: Low-level laser 
therapy resulted in modulate of the inflammatory response, enhanced deposition of collagen 
fibers and increase in the average number of newly formed vessels. 
Key words: Wound Healing. Lasers, semiconductor. Collagen. Macrophages. Rats. 
 
 
 
57 
 
 
RESUMO 
Objetivo: Avaliar o efeito da terapia laser de baixa potência (TLBP) λ904 nm na cicatrização 
de feridas cirúrgicas em ratos. Métodos: Foram utilizados 40 ratos Wistar, machos, divididos 
em quatro grupos, submetidos à incisão na linha Alba abrangendo pele, subcutâneo e 
musculatura abdominal, suturados continuamente por fios de nylon 5-0. Oito e quinze dias 
após o procedimento cirúrgico, a área de reparo foi removida e os cortes histológicos foram 
corados com hematoxilina-eosina para avaliar celularidade do infiltrado inflamatório, 
Tricrômico de Masson e Picrosirius para quantificar as fibras de colágeno e técnica imuno-
histoquímica para a contagem de vasos neoformados. Os dados foram comparados 
estatisticamente pela análise de variância ANOVA, com "teste de Tukey post-hoc, p <0,05. 
Resultados: A terapia laser de baixa potência reduziu a intensidade da reação inflamatória e 
influenciou a dinâmica da resposta imuno por induzir a mudança do padrão de infiltração de 
leucócitos (neutrófilos a infiltração mononuclear). Como também estimula a deposição e 
melhora padrão organizacional das fibras colágenas, apresentando um delicado colágeno tipo 
III. Além disso, verificou-se um aumento significativo no número médio de vasos 
neoformados (p = 0,00 e p = 0,02, respectivamente). Conclusão: A terapia laser de baixa 
potência modula a resposta inflamatória, com melhor deposição de fibras colágenas e 
aumento do número médio de vasos neoformados. 
Descritores: Cicatrização de feridas. Lasers semicondutores. Colágeno. Macrófagos. Ratos. 
 
Introduction 
The discontinuity of tissue integrity can be induced either by trauma or by surgical 
procedures. In this regard, numerous chemicals are released into the injured area causing 
tissue changes consistent with an acute inflammatory process. This phenomenon is 
characterized by stimulation, migration and proliferation of stromal cells, synthesis of 
extracellular matrix, and finally culminating in tissue remodeling1-3. 
Currently, there are methods to alleviate the inflammatory process, providing the 
improvement of cellular nutrition and favoring the injured tissue repair, particularly the low 
level laser therapy (LLLT)2,4. The LLLT has been clinically used for pain control and wound 
healing. The effectiveness of this therapy is due to responses induced by the cellular level 
photobiomodulation promoting acceleration of cellular metabolism, reducing inflammation, 
increasing local microcirculation and the lymphatic system, leading to the decrease of the 
interstitial edema and increase of the collagen synthesis4-7. 
This biological activity of LLLT is probably a result of photo-inducedacceleration of electron 
transfer in the respiratory chain and consequently the increase of mitochondrial ATP 
58 
 
 
synthesis. Thus, this electronically excited state of molecules is supposed to promote enhance 
of cellular metabolism in a several tissues and improve a variety of physiologic and 
physiopathologic processes, such as wound healing7. 
Due to the extensive controversy observed in the literature concerning the role played by 
phototherapy on stromal and inflammatory cells involved in the cicatricial repair, the goal of 
this study is to analyze the effect of a specific protocol of low-energy Laser irradiation on the 
intensity of the inflammatory response, deposition of collagen fibers and number of newly 
formed vessels during two different phases of wound healing in rodents. 
 
Methods 
The sample consisted of 40 adult male albino Wistar rats (Rattus norvegicus albinus), 
with body weight ranging from 200 ± 20 grams, from the animal colony of the Federal 
University of Sergipe (UFS), Sao Cristovao, State of Sergipe, Brazil. All experimental 
procedures were carried out in accordance with the norms of the Brazilian College for Animal 
Experimentation (COBEA). This study was approved by the Committee of Ethics in Research 
at, University of Sergipe protocol number 05/08/CEPA/UFS. 
The rats were confined in plastic cages (three animals per cage), and supplied with food and 
water ad libitum in a temperature and humidity-controlled environment. Forty rats were 
subjected to the anesthesia and the surgical procedures as described by Poole Jr et al.8. The 
incision length was an inch, demarcated by rule, including skin, subcutaneous tissue and 
abdominal muscle was subsequently sutured continuously by a nylon thread 5-0 (Med 
Goldman). 
Subsequently, rats were separated into four groups of six animals each, which were randomly 
assigned to one of the four treatment groups: (G1) untreated group euthanized 8 days after 
surgical procedures, (G2) photoirradiated group euthanized 8 days after surgical procedures, 
59 
 
 
(G3) untreated group euthanized 15 days after surgical procedures, and (G4) photoirradiated 
group euthanized 15 days after surgical procedures. 
Laser therapy application 
Each animal in the treated subgroups received daily transcutaneous GaAlAs laser irradiation 
(KROMAN, Sao Paulo, Brazil) application during 7 and 14 days at 904nm for 2 min, potency 
of 45mW; spot area of 0,02cm² and energy density of 3J/cm². Laser array was positioned 
directly over the animal at a vertical distance of 0.5cm from the edge of the wound. The 
irradiation technique was by scanning the entire perimeter of the wound, comprising a time of 
two minutes using a stopwatch digital. 
Histological analysis 
After the sacrifice of the animals, the wound area was surgically removed, fixed in buffered 
10% formalin and paraffin embedded. Subsequently, serial 4µm sections were obtained and 
stained in hematoxylin-eosin to assess the inflammatory reaction, Masson´s trichrome and 
Picrossirus to semiquantify the collagen fibers and immunohistochemical technique for 
counting newly formed blood vessels. The intensity of the inflammatory response was 
assessed as following: +1 (inflammatory cells representing less than 10% of the cell 
population observed within the wound area), +2 (inflammatory cells representing in between 
10 and 50% of the cell population observed within the wound area) and +3 (inflammatory 
cells representing more than 50% of the cell population observed within the wound area). 
The analysis of the intensity and pattern of the collagenization was performed according to 
the disposition and appearance of the collagen fibers deposited in the wound site. These fibers 
were then categorized in +1 (thin, delicate loosely arranged collagen fibers seen throughout 
the wound area), +2 (thin, delicate loosely arranged collagen fibers are seen in the surface and 
60 
 
 
center of the wound area, but thicker and gross in the deep and margins) and +3 (thick, gross 
densely arranged collagen fibers seen throughout the wound area). Moreover, the slides also 
underwent Picrosirius Red technique to examine the collagen fibers, descriptively classified 
according to its typing, spatial orientation, thickness and size of fibers. When observed under 
polarized light microscope, the fibers were birefringent, appearing bright against the dark 
background, indicating the occurrence of type I collagen staining in areas ranging from 
yellow, through orange dark, reaching the red bright; the description of type III collagen was 
visualized in the areas of green color bright. The count of newly formed blood vessels was 
aided by use of the technique of immunohistochemistry (streptoavidin-biotin-peroxidase) 
using primary antibodies anti-CD34 (Clone Q B End 10, dilution 1:50, Mouse anti-human 
CD34, lot 512, Novocastra) and analyzed by morphometric techniques in the number of 
newly formed vessels and endothelial cells. The average number of blood vessels was 
determined by counting the capillaries across selected in 10 histological fields (400x 
magnification) of each wound and the mean was obtained by the ratio of the sum of vessel 
count and the amount of fields analyzed. 
Statistical analysis 
The results obtained were subjected to statistical analysis of variance (ANOVA), with 
extension "post-hoc” Tukey test. The significance level was set at 0.05 or 5%. 
Results 
As indicated in the Table 1, the intensity of the inflammatory response was severe in all the 
samples of G1. Besides, the leukocyte infiltrate was predominantly composed of neutrophils, 
and macrophage, characterizing an acute inflammatory reaction. In general, neutrophils were 
distributed along the wound surface, particularly close to the fibrinous exudates membrane 
61 
 
 
[Figure 1A]. Lymphocytes were also observed, but they always represented less than 10% of 
the leukocyte population. The wounds of the irradiated animals of G2 presented severe 
inflammatory response (+3) in 50% of the samples and moderate in the other half. 
Lymphocytes were the most frequently observed leukocytic subsets [Figure 1B]. Eosinophils 
and neutrophils were not observed the site of injury. In 14 days, the intensity of the 
inflammatory response in G3 and G4 was predominantly moderate [Figure 1C], exhibiting 
predominance of mononuclear chronic inflammatory cells [Figure 1D]. The data were 
statistically analyzed and revealed no significant differences between the groups sacrificed at 
day 8 (p = 0.08) and between the groups sacrificed on day 15 (p = 0.3). 
TABLE 1 - Assessment of the profile of the inflammatory reaction intensity in the control 
and photoirradiated groups after surgical procedures, sacrificed at the 8th and 15th day 
 
Animals Groups 
 G1 G2 G3 G4 
R1 +3 +2 +2 +2 
R2 +3 +3 +2 +2 
R3 +3 +2 +2 +2 
R4 +3 +2 +2 +2 
R5 +3 +3 +2 +2 
R6 +3 +2 +2 +2 
R7 +3 +3 +2 +2 
R8 +3 +2 +2 +2 
R9 +3 +3 +2 +2 
R10 +3 +3 +2 +2 
+ 1 = representing less than 10%; + 2 = representing between 10 and 50%; + 3 = representing 
more than 50%. 
 
 
62 
 
 
 
FIGURE 1 - (A) Acute inflammatory reaction in the control group G1; (B) and subacute in 
the irradiated group G2, sacrificed at day 8. Reduction of inflammation in both groups killed 
on day 15, control G3 (C) and irradiated G4 (D). (H and E, 400x). 
 
As showed in Table 2, fibroplasias were assessed by analyzing the appearance and disposition 
of collagen fibers stained in blue by Masson’s trichrome. In G1, thin collagen fibers arranged 
in delicate interlaced bundles were observed within a loose connective tissue (pattern +1) in 
the entire cases studied [Figure 2A]. On the other hand, in G2 showed thick, gross collagen 
fibers densely arranged in parallel bundles (pattern +3), although in 40% cases the pattern +2 
of collagen deposition had persisted [Figure 2B]. In G3, thicker collagen fibers arrangeddensely in the whole area of the wound (pattern +3) were evidenced in all histological slides 
[Figure 2C]. In the irradiated group (G4), there was a mixture of collagen fibers, sometimes 
thicker, with densely arranged fibers, in 70% cases, sometimes presenting thinner fibers close 
63 
 
 
to the the edges of the lesion, but densely compacted gross fibers in the central region in 30% 
of the samples [Figure 2D]. In general, collagen fibers appeared to be less abundant and 
thicker in G3 than in G4. However, there was no statistical difference between the groups 
sacrificed at day 8 (p = 0.06) and between the groups sacrificed on day 15 (p = 0.15). 
TABLE 2 - Morphological assessment of the fibroplasia degree in both experimental and 
control groups, sacrificed at the 8th and 15th day 
 
Animals Groups 
 G1- G2 G3 G4 
R1 +1 +3 +3 +2 
R2 +1 +1 +3 +2 
R3 +1 +2 +3 +3 
R4 +2 +3 +3 +3 
R5 +3 +3 +3 +3 
R6 +1 +2 +3 +3 
R7 +3 +3 +3 +3 
R8 +1 +3 +3 +3 
R9 +1 +2 +3 +3 
R10 +2 +2 +3 +2 
+1 = thin, delicate, loosely arranged collagen fibers seen throughout the wound area; +2 = 
thin, delicate, loosely arranged collagen fibers seen in the deeper regions and margins of the 
wound area, but thicker and gross in the central region; +3 = thick, gross, densely arranged 
collagen fibers seen throughout the wound area. 
64 
 
 
 
FIGURE 2 - Collagen of animals sacrificed at 8 days; slender collagen, with fibers arranged 
loosely, +1 score in the control group G1 (A), collagen thick with densely arranged fibers, 
score +3 in the irradiated group G2 (B). Score of similar collagen in mice sacrificed at 15 
days; collagen thick with thick fibers arranged throughout the wound area, in the control 
groups G3 (C) and irradiated G4 (D). (Trichrome, x 400). 
 
The morphological characterization of collagen fibers using the technique of Sirius red 
[Figure 3] showed that the treated groups (G2 and G4) had a tendency to present 
predominance of type III collagen, or a mixture of type III and I collagen, disposed in a 
parallel arrangement, whereas the control groups (G1 and G3) showed clear abundance of 
type-I collagen, sometimes parallel-arranged sometimes reticularly organized. 
65 
 
 
 
FIGURE 3 - In animals sacrificed at the 8th day, it was observed in the control group (A) the 
predominance of deposition of collagen type I in regions of color ranging from yellow to dark 
orange, up to bright red. In the irradiated group (B) a predominance of collagen type III were 
seen in areas of bright green color. On the 15th day, it was found in the control group (C) A 
characterization of type I collagen in all specimens, contrasted with the irradiated group (D) 
where the collagen fibers showed a mixture of type III and I (Picrosirius Red , 400 x). 
 
Concerning to the quantitative analysis of the vascularization, it was observed a higher 
content of newly formed blood vessels in G2 (0.66±0.36) than in G1 (0.16±0.009) (p=0.001) 
in 8 days, as well as in G4 (0.53±0.16) when compared to G3 (0.37±0.10) (p=0.02) in 15 days 
[Figures 4 and 5]. Nevertheless, no significant difference was observed between the groups 
irradiated G2 and G4 (p = 0.30), and between the control group G1 and G3 (p = 0.00). 
 
66 
 
 
 
 
FIGURE 4 - Quantitative analysis of the average number of newly formed vessels by 
histological field. 
 
 
FIGURE 5 - Newly formed blood vessels in the groups sacrificed on the eighth day in the 
control groups G1 (A) and irradiated G2 (B) Reduction in the number of newly formed 
67 
 
 
vessels in mice sacrificed at 15 days in the control groups G3 (C) and irradiated G4 (D) (Anti-
CD34, 400 x). 
 
Discussion 
Although the clinical efficacy of the LLLT has been proved through controlled studies9,10, 
little is known about the histological alterations that can occur due to its use, particularly 
regarding modulation of the extracellular matrix elements. Several studies on laser 
photobiomodulation ensured the improvement of cicatricial repair in wounds with loss of 
tissue, a particular sort of cicatrization phenomenon known as second-intention wound 
healing2,7,11. However, in this study, the experimental lesions were sutured wounds, 
resembling the ones carried out after elective surgical procedures, in order to asses the role of 
LLLT as an alternative therapy to improve the healing process in cases in which the 
cicatrization might be somehow impaired. 
The inflammatory reaction represents the earliest event to take place after tissue injury, whose 
main function is to eliminate eventual microorganisms and provide wound cleaning. This 
inflammation is absolutely required to provide wound healing, although its long-term 
persistence is considered one of the most important reasons of delay in the healing process12. 
During the first days of healing, biological events such as formation of new capillary blood 
vessels associated with progressive deposition and remodeling of collagen fibers will 
culminate in a complete cicatricial repair of the injured area13. 
In this study, LLLT reduced the intensity of the inflammatory reaction in both 8 and 15 days 
after performing the surgical cutaneous wounds. These findings suggest that this protocol of 
light Laser irradiation is able to downregulate the inflammatory response and favor the 
acceleration of biological events responsible for the healing process. Similar findings attesting 
68 
 
 
a remarkable anti-inflammatory activity of LLLT in other different protocols have been 
previously reported14,15. Additionally, LLLT apparently influenced the dynamic of the 
immunoinflammatory response at early stages of wound healing process, once it clearly 
induced switching of the leukocyte infiltration pattern (neutrophilic to lymphoplasmacytic 
infiltration) into the damaged tissue of irradiated wounds. 
Both modulatory effects of LLLT over the inflammatory response might be a result of an 
important inhibitory role played by Laser arrays, in a variety of cells, on the synthesis of 
prostaglandin, a chemical mediator widely supposed to provide chemotactic signals for 
leukocytes polymorphonuclear neutrophils, as well as on lymphocyte proliferation and 
maturation16. Besides, elevated numbers of polymorphonuclear cells within the first 
experimental hours, followed by decreased levels on day 3 post-treatment in laser treated 
wounds have been reported in previous studies, and a close relation between this phenomenon 
and the stimulation of mast cells degranulation has been pointed19. Therefore, LLLT might 
provide a short term acute inflammatory response in earlier stages of wound healing, 
accelerating the phagocutic inflammatory phase of the cicatricial repair. 
As long as the healing process takes place, the inflammatory phase is gradually substituted by 
proliferating phase, which is characterized by wide migration of fibroblasts into the wound 
area12. This cell subset is responsible for synthesizing, depositing and remodeling the collagen 
fibers required to cicatricial repair after tissue injury. In normal tissues, collagen fibers 
provide strength, integrity and structure; so, when tissues are disrupted following injury, 
collagen deposition is essential for replacing the lost tissue and restoring anatomic structure 
and function17. In this study, although LLLT appeared to stimulate the deposition of collagen 
fibers at both evaluated stages of wound healing, these findings were not statistically 
significant. 
69 
 
 
Thus, it seems that despite laser arrays is able to upregulate the activity of enzymes 
responsible for the synthesis of collagen fibers2,7, this activity, in sutured wounds, seems not 
to be expressive enough to lead to an overproduction of collagen fibers. These data appears to 
suggest that the upregulatory effects of LLLT on collagenization, particularly observed in 
second-intention wound healing2,9,11, do not enhance the possibilityof hypertrophic scars 
formation in sutured wounds. However, further investigations are required to clarify this 
mechanism and order to assure the liability of these observations. 
The classification of collagen fibers stained with Sirius Red and analyzed using polarized 
light showed that in the earlier stages of tissue healing, fibers are delicate, showing a loose 
arrangement and a yellow-green birefringence, featuring a type III collagen. On the other 
hand, in the later stages of the repair process the fibers exhibit an organizational pattern more 
compact, thicker bundles of red-orange color, indicating a type I collagen2,11,19. 
In fact, these data disagree with the survey results, where it was noted that the morphological 
characterization of collagen fibers in the irradiated groups had a predominance of either type 
III collagen, or the presence of both type III and I collagen in equal proportions, with in 
parallel orientation, whereas poorly organized type I collagen was dominating in the control 
groups. It is noteworthy that the predominance of type III collagen, provides a fragile scar on 
your tension, but on the other hand, excess type I collagen is responsible for a healing of poor 
quality, showing hypertrophic appearance. Notwithstanding increased collagen synthesis is 
considered a good marker of healing evolution, over deposition of these fibers within the 
wound area may provoke excessive accumulation of scar tissue, resulting in hypertrophic 
scars or keloids18. However, this undesirable effect can be minimized by applying correct 
dosages of Laser irradiation in order avoid over stimulation of fibroblastic activity. 
70 
 
 
Since no sign of excessive collagen synthesis was observed, it is possible to suppose that the 
protocol of photobiomodulation employed in this study was suitable to be applied in sutured 
wounds. Besides, the better orientation of the collagen bundles, as well as the presence of 
equal proportions of both type I and III collagen fibers, closely resembling the appearance of 
the normal tissue, seems to point out an important role played by LLLT in the architectural 
organization of the collagen during wound healing, as suggested in previous investigations2. 
These data indicate that this protocol was successful in improving wound healing without any 
apparent deleterious or side effect on scar formation. The exact explanation for these quite 
beneficial results is not completely understood yet, so that further investigations are still 
demanded in order to fully elucidate the mechanisms underlying the effects observed in this 
study. 
In this study, LLLT appeared to stimulate the proliferation of new blood vessels, but the 
pathways of laser-induced endothelial activation are still unclear. It is possible that such pro-
vascular effects may reflect an over stimulation of endothelial proliferation by cytokines 
released by inflammatory cells16 or result from laser-related direct stimulation of the cell cycle 
in angioblasts11,12. However, the blood vessels content in 8 days was significantly reduced in 
both irradiated and non-irradiated groups when compared to 15 days. Similar findings were 
reported in previous investigations11, so that it is suggested a close relationship between the 
evolution of the scarring events and progressive reduction of neovascularization during the 
healing process. 
Conclusion 
Low-level laser therapy resulted in modulate of the inflammatory response, enhanced 
deposition of collagen fibers and increase in the average number of newly formed vessels. 
71 
 
 
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Conflict of interest: none 
Financial source: FAPITEC 
Correspondence: 
Valdinaldo Aragão de Melo 
Rua Álvaro Brito, 14/301 
49020-400 Aracaju - SE Brasil 
Phone: (55 79)9982-2438 
vamelo@infonet.com.br 
Received: September 21, 2010 
Review: November 18, 2010 
Accepted: December 20, 2010 
 
*Color figures available from: www.scielo.br/acb