Tema X 4-DNA recombinante

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- DNA recombinante
- Procedimentos da tecnologia 
- Enzimas de restrição
- Principais Vectores
Tema X.4: Biologia Molecular
Conteúdo:
DNA recombinante
➢ No presente tema são explicados os método básicos da tecnologia
de DNA recombinante que são usados para:
- Isolar
- Replicar e 
- Analisar os genes dentro de uma molécula de DNA
➢ O termo DNA recombinante refere-se a:
▪ Criação de novas combinações de segmentos ou de moléculas de
DNA, que não se encontram juntas de forma natural,
▪ Ou seja, moléculas de DNA produzidas pela união de segmentos
provenientes de diferentes fontes biológicas.
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Alguns procedimentos básicos da tecnologia de DNA 
recombinante 
1. Os segmentos de DNA são obtidos com a utilização de Endonucleases
de restrição (enzimas de restrição), que reconhecem e cortam as
moléculas de DNA por sequências nucleotídicas específicas;
2. Os fragmentos resultantes da digestão (ou corte) com as enzimas de
restrição são unidos a outras moléculas de DNA que servem de
vectores.
3. A molécula de DNA recombinante, formada por um vector que leva
um segmento de DNA inserida, é transferida para a célula
hospedeira.
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➢ Estes vectores podem replicar-se automaticamente numa célula
hospedeira e facilitar a manipulação da molécula de DNA
recombinante recém criada.
➢ A molécula de DNA recombinante se replica produzindo várias
cópias idênticas denominadas clones.
4- Quando as células hospedeiras se replicam, as células
descendentes herdam o DNA recombinante, criando deste
modo uma população de células idênticas que transportam todas
as sequências clonadas
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5 - Os segmentos de DNA clonadas podem ser recuperados das
células hospedeiras, ser purificados e analisadas.
6 - O DNA clonado pode potencialmente ser transcrito, o seu mRNA
pode ser traduzido e o produto génico final pode ser isolado e
examinado.
➢ O desenvolvimento de tecnologias de DNA recombinante
oferecem novas oportunidades para a investigação, pois
simplificam a obtenção de grandes quantidades de DNA que
codificam genes específicos o que facilita as investigações sobre:
- Organização
- Estrutura e
- Expressão génica,
➢ O que torna grande o desenvolvimento da indústria
biotecnológica.
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Princípios básicos do DNA recombinante
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Enzimas de restrição
A pedra angular da tecnologia de DNA recombinante são as
endonucleases de restrição ou chamadas enzimas de restrição.
➢ Estas enzimas são isoladas de bactérias e recebem este nome
devido ao facto de terem o poder de limitar ou prevenir as
infecções víricas, através da degradação do ácido nucléico do
invasor.
➢ Estas enzimas reconhecem uma sequência específica de
nucléotidos de uma molécula de DNA de cadeia dupla e cortam o
DNA por essa sequência,
➢ A esta sequência se denomina sítio de restrição.
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A enzima de restrição EcoRI
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Tipos de enzimas de restrição
1- Enzimas de restrição do tipo I
2- Enzimas de restrição do tipo II
1- Enzimas de restrição do tipo I
São as que cortam as cadeias de DNA numa posição aleatória a certa
distância do sítio de restrição.
Desvantagem:
- Têm falta de precisão no corte.
- Não são geralmente usadas em tecnologia de DNA recombinante
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2- Enzimas de restrição do tipo II 
➢ Fazem o corte em sítios específicos, são amplamente usadas na
tecnologia de DNA recombinante.
➢ As sequências reconhecidas pelas enzimas do tipo II são:
- Simétricas,
- São sequências palindrómicas.
Sequências palindrómicas:
São sequências que se lêem igual da extremidade 5’-3’ de uma
cadeia bem como na mesma direcção da cadeia complementar.
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Acção das enzimas de restrição na formação do DNA 
recombinante
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Vectores
➢ Os vectores são essencialmente moléculas de DNA
transportadoras.
➢ Depois de se unir a um vector ou veículo de clonação, um
segmento de DNA pode entrar na célula hospedeira e
replicar-se (ou clonar-se).
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Características da molécula de DNA para servir de vector: 
 
 
1- Deve conseguir replicar-se independentemente, junto com o 
segmento de DNA que transporta; 
 
 
 
2- Deve ter alguns sítios de corte para as enzimas de restrição. 
 
▪ Estes sítios de restrição são cortados com uma enzima de 
restrição e utilizados para inserir o segmento de DNA 
desejado. 
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3- Deve ter algum marcador de selecção 
 
 
▪ Ex: genes de resistência aos antibióticos ou de enzimas que a célula 
hospedeira não tenha, 
▪ Para se conseguir diferenciar as células do hospedeiro das que 
transportam o vector. 
 
 
 
4- O vector na célula hospedeira deve ser fácil de recuperar. 
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Tipos de vectores
- Plásmidos - Os Bacteriófagos lambda 
- Bacteriófagos - Os Bacteriófagos M13
- Cósmidos - Cromossomas artificiais de levedura (YAC)
1- Os Plásmidos
➢ São moléculas extra-cromossómicas de DNA natural:
– Têm dupla cadeia
– têm uma origem de replicação (ori +) e
– Se replicam de maneira autónoma nas células bacterianas.
➢ Para poderem ser usados na tecnologia de DNA recombinante o desenho
dos plasmidos já sofreu várias alterações o que os permitiu:
- Ter um número limitado de sítios de restrição
- Ter genes de resistência a antibióticos específicos
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Figuras do plásmido pBR322 e do plásmido pCU18
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	Slide 6: Princípios básicos do DNA recombinante
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	Slide 13
	Slide 14: Acção das enzimas de restrição na formação do DNA recombinante
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