Complemento 2 Microbiologia 2024 2

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COMPLEMENTO 2 (para o período 2024.2)
Mª Isabel M. Liberto
Maulori C. Cabral
ATIVIDADE PRÁTICA 2
As bactérias por terem um tamanho médio de 1 µm, isoladamente, são invisíveis à nossa percepção visual, uma vez que o olho humano só consegue formar imagens de objetos ou coisas que tenham dimensão igual ou superior a 0,2 mm, mas, segundo alguns links da Internet, pode ser 0,1 ou mesmo 0,076 mm. No nosso dia a dia, estamos em íntimo contato com os micróbios, quer no ar circulante, que pode estar repleto deles, quer nas situações que favorecem nossa aproximação com outros elementos do ambiente, como por exemplo, na manipulação de objetos que fazem parte do nosso cotidiano. 
Isoladamente não os vemos, mas se tiverem disponibilidade de nutrientes e estiverem um ambiente propício, eles se duplicam e, com o passar do tempo, formam colônias visíveis, com diâmetro compatível com o tempo de geração de cada um.
Esse fenômeno se observa quando expomos uma placa de Petri, contendo meio nutritivo, ao contato com o ar em movimento, durante um período de três a cinco minutos. Nessa caçada às bactérias presentes no ar, é comum se observar o aparecimento de colônias, umas após 24h, outras mais tarde, até 72h. As colônias maiores são formadas pelas bactérias que têm tempo de geração menor. Já as colônias que aparecem posteriormente, são formadas por bactérias que demoram mais a se duplicar, ou seja, aquelas que têm tempo de geração mais demorado. Depois da incubação é possível fazer uma análise sobre a diversidade microbiana presente no ar de um ambiente, a partir das colônias de fungos ou bactérias que proliferaram na placa. 
 
Motivação da prática:
· Uma colher de chá de terra contém aproximadamente um trilhão de micróbios classificados em cerca de 10 mil espécies;
· Alguém tem ideia do número total de espécies existente no planeta? Imagine que há mais micróbios na boca de um ser humano do que pessoas vivendo na cidade de Nova York.
· Na pele humana há mais de 100 mil micróbios por centímetro quadrado.
· São mais de sete bilhões de micróbios que habitam o intestino humano, portanto, um número superior ao de seres humanos que povoavam o mundo. (8 bilhões, em 15 de novembro de 2022).
· Qual a proporção de células microbianas e células humanas em nosso corpo? Uma possível resposta a essa pergunta está bem ilustrada na capa do livro, a seguir (Figura 1): 
 
Figura 1: Mais detalhes em: https://ilhadoconhecimento.com.br/10-humanos-como-os-micro-organismos-sao-a-chave-para-a-saude-do-corpo-e-da-mente-livro/)
Quantitativamente, estima-se que um corpo humano adulto é constituído por 10 trilhões de células eucarióticas e mais 100 trilhões de células bactérianas. Essa informação pode ser representada, aritmeticamente, assim: 
10.000.000.000.000 euc + 100.000.000.000.000 bact = 110.000.000.000.000 total
 
Curiosidades:
· O peso total de micróbios, em um corpo humano adulto, saudável, varia, aproximadamente, entre 1 e 2 kg;
· Os 10 trilhões de células eucarióticas do nosso corpo, oriundas de um único zigoto, isto é, uma célula oriunda da fusão de um espermatozoide com um óvulo, estão diferenciadas em, pelo menos, 220 tipos funcionais (Ex: neurônios, hepatócitos, pneumócitos). Já os 100 trilhões de micróbios estão distribuídos pela superfície de nossas mucosas e pele;
· Além disso, existe, em todas as nossas células, as mitocôndrias que são descendentes de bactérias que passaram para a condição de endossimbiontes, num passado remoto;
· É bom entender que, nós humanos, não somos seres únicos e sim seres mistos.
· O corpo humano adulto é formado por uma mistura de 110 trilhões de estruturas psicocorporais, procarióticas e eucarióticas, que exercem funções interrelacionadas; 
· No processo de renovação do nosso corpo, muitas células morrem e outras tantas duplicam todos os dias, assegurando assim o equilíbrio entrelaçado;
· Registro fósseis de estromatólitos, demonstram que a vida bacteriana neste Planeta se iniciou há 3,8 bilhões de anos, com as cianobactérias estromatolitogênicas, e que, os organismos unicelulares habitaram o planeta por cerca 80% de existência da vida na Terra;
· Os primeiros micróbios que surgiram na Terra foram seres procarióticos há, aproximadamente, segundo algumas pesquisas; .
· Não existe nada de rudimentar e nem de primitivo nesses seres vivos primevos;
· É bom lembrar que os micróbios estão habitando no planeta há 3,8 bilhões de anos e que não foram extintos; 
· O momento em que a raça humana notou, cientificamente, a existência de micróbios foi na segunda metade do século XVII, quando o primeiro microscópio foi construído. Entretanto, desde os primórdios da humanidade, os efeitos da presença dos micróbios são percebidos de forma empírica;
· No final do século XIX a raça humana começou a perceber que os micróbios estavam associados a doenças;
· Os micróbios são importantes para todas as outras formas de vida. Louis Pasteur disse um dia: “O papel do infinitamente pequeno é infinitamente grande”;
· A vida está no solo, no ar, na água, enfim em todos os habitats inclusive nos ambientes mais inóspitos para os seres humanos e outros seres vivos A biosfera é limitada por micróbios.
· As arqueias hipertermófilas utilizam ambiente de água fervendo, como habitat;
· Nesta aula prática, você vai visualizar, ao microscópio, as leveduras presentes no fermento biológico que é usado para fazer pão
Considerações sobre biofilme microbiano:
Os micróbios contribuem para a manutenção da sustentabilidade ecológica do Planeta, pois são responsáveis pela produção de nutrientes indispensáveis aos animais e também pela decomposição/reciclagem da matéria orgânica natural existente no planeta. No ambiente, as populações microbianas podem ser vistas sob a forma de biofilmes (camada de lodo), muitas vezes causando entupimento em tubulações de esgoto e também de combustíveis. 
Um biofilme é formado por uma comunidade de células. as células que estão aderidas à superfície de um suporte vivo ou inerte e estão embebidas na matriz de polímeros, por elas excretados no ambiente, são denominadas sésseis, enquanto, as que estão livres são denominadas planctônicas. Na estrutura do biofilme, podem coexistir tipos bacterianos de diferentes fenótipos, portadores de de potenciais metabólico e fisiológico bem distintos. O conteúdo celular de uma preparação de biofilme bacteriano que consta como figura 2 da Aula 2, do livro Microbiologia/Cederj- vol 1, está apresentada como figura 2 neste texto.
Figura 2: Biofilmes
Considerações sobre os LÍQUENS: 
Os líquens encontrados em todos os continentes (Figura 3) e representam um classico modelo de associação simbiótica, do tipo mutualismo, formado pelo convivio de células de fungos com microalgas ou cianobacterias. Estes dois tipos de seres vivos, convivem em dependência mútua. Os fungos são organismos heterotróficos, enquanto as algas e as cianobactérias são autotróficas, que que se associaram em prol da busca de nutrientes e de proteção. 
Figura 3: mostrando um galho de árvore, impregnado por liquens. Disponivel no link:https://pixabay.com/photos/lichen-lichens-lichen-on-branches-195289/?no-redirect=
Num liquem, os fungos recebem o nome de micobionte e as algas de fotobiontes (elemento fotossintetizante da associação). Geralmente, os liquens são organismos primeiro colonizam um local, pois sobrevivem em locais de grande estresse ecológico. Podem viver em locais como superfícies de rochas, folhas, solos, troncos de árvores. Há liquens que são substratos para outros liquens. Essas estruturas assumem grande importância devido à propriedade de produzirem ácidos que degradam rochas e, dessa forma, ajudam na formação de solos. Quando o fotobionte da associação é do tipo cianobactéria, os liquens são fixadores de nitrogênio,
LACTOBACILOS E LEVEDURAS:
Outros elementos trabalhados nesta atividade, estão associados a alimentos que fazem parte do nosso cotidiano (pães, pizzas, bolos, iogurtes, leite fermentado, queijos e cervejas). Os Lactobacilos nos proporcionam iogurtes e leites fermentados. 
AsLeveduras são conhecidas como fermento de padeiro ou de cerveja. Isso porque elas são utilizadas, há milênios, na produção de pão e bebidas alcoólicas, em razão de capacidade de produzir álcool e CO2, por meio do processo da fermentação, da glicose ou outros carboidratos. 
As Saccharomyces encontram nas massas de pão (principalmente de farinha de trigo) condições adequadas para se alimentar do amido da farinha. Em consequência da ação desses micróbios, o açúcar do amido é liberado e depois transformado em CO2 e etanol. As bolhas do gás carbónico não conseguem escapar através da superfície e fazem crescer a massa, tornando-a fofa. Durante o cozimento, o gás carbónico e o álcool conseguem escapar, mas o seu efeito fica, na porosidade, sabor e aroma do pão. (Figura 4). 
 
 
Figura 4: pão de minuto ( By M.I.M.Liberto)
Figura 5: Classificação científica de Saccaromyces cerevisiae
 O vinho, e a cerveja têm muito em comum, desde as formas de produção até à história, além da participação da Saccharomyces no processo fermentativo (Figura 5) 
Acredita-se que ambas as bebidas foram descobertas por acaso, com processos de fermentação se desenvolvendo acidentalmente, pela fermentação de um cacho de uvas abandonado. 
Estima-se que a descoberta das primeiras sementes de uva datem de 8.000 a.C, sendo esses os indícios iniciais de um plantio feito pelo homem. Acredita-se que os vinhos tenham surgido também nesse período. 
Para a cerveja, a forma como foi descoberta foi também acidental Há cerca de sete mil anos, na Mesopotâmia, cabia à mulher colher os grãos e colocá-los para cozinhar, a fim de criar algo similar ao pão. 
Um recipiente cheio de grãos de cevada acabou esquecido ao relento. A chuva foi responsável pela germinação dos grãos, iniciando o processo de malteação, pelas enzimas que decompõe o amido do grão e promoveram a liberação da glicose necessárias para a fabricação da cerveja. 
Visando não desperdiçar os grãos, a mulher os colocou para aquecer, obtendo um líquido açucarado que, logo após ser resfriado e mantido em repouso, apresentou as bolhas da fermentação espontânea. Essa foi, então, a cerveja primitiva. 
No antigo Egito, o vinho era tido como uma bebida sagrada, assim como a cerveja. 
Outra semelhança é que, ao longo dos séculos, o vinho foi tratado tanto como a bebida ideal para os grandes banquetes, festas e comemorações (Figura 5), mas também, com uma função sagrada, assim como a cerveja. Ambas as bebidas eram utilizadas em rituais sagrados 
Figura 6: Vinhos e Cervejas
Em relação aos Lactobacillus (Tabela 1), no ano de 1925, o Japão passava por um surto de infecções gastrintestinais. Buscando uma solução para este problema, o Dr. Minoru Shirota começou a estudar os lactobacilos intestinais, visando utilizar tais organismos para prevenir enfermidades. Cinco anos depois, o pesquisador encontrou um tipo de bacilo resistente aos ácidos produzidos no estômago. Esse tipo de lactobacilos inibia a propagação de bactérias indesejáveis ao intestino, ajudando as crianças japonesas que estavam com problemas intestinais. Na época, isso causou uma revolução na área da saúde, e os micróbios ganharam o nome de seu descobridor: Lactobacillus casei Shirota. 
Em 1935, no Japão, foi lançado o Leite Fermentado Yakult, que continha leite desnatado e fermentado pelos Lactobacillus vivos descobertos por Shirota. O produto precisava ser facilmente encontrado e estar próximo da família japonesa. Por isso, em 1963, foi adotado um processo de distribuição de casa em casa, as mulheres que comercializavam o produto, fazendo a entrega de bicicleta, eram chamadas de “Yakult Ladies” 
Tabela 1: Classificação científica dos lactobacilos:
	Classificação científica dos lactobacilos:
Domínio: Bactéria
Filo: Firmicutes
Classe: Bacilli
Ordem: Lactobacillales
Família: Lactobacillaceae
Gênero Lactobacillus Beijerinck 1901
Tabela 2: Equivalência de tamanhos, tendo o Metro (m) como padrão
Na tabela acima, você pode observar- a relação de equivalência entre as unidades métricas e, perceber a impossibilidade de, a olho nu, ver micróbios, que estejam individualizados, diferente do que acontece com os que estão agregados em biofilmes. Para permitir essa observação, voce fará uma coloração simples desses dois tipos de células microbianas e observará ao microscópio optico, em diferentes aumentos
PARTE 1 -MATERIAIS E MÉTODO PARA A ATIVIDADE DE MICROSCOPIA NO LABORATÓRIO:
· Duas lâminas, para micróscopio, limpas e secas;
· Um frasco de lactobacilos vivos
· Fermento biológico (seco ou fresco); 
· Dois recipientes limpos; 
· Água mineral,sem gás;
· Cotonetes para fazer esfregaços nas lâminas ;
· Gotejador;
Cristal violeta ou Azul de metileno; 
· Chama de uma Lamparina a álcool ou de uma vela ou de um isqueiro;
· Papel toalha 
· Lata para dispensar corantes 
· Microscópio óptico
· Óleo mineral
Preparo das lâminas para observação ao microscópio: ATENÇÃO=LEIA ANTES O ITEM 1B-8. 
1a) Coloração e observação de Lactobacilos vivos que são utilizados como probióticos 
Esta é uma atividade para você visualizar os lactobacilos que estão vivos, nos frascos de Yakult, Chamito, Batavito e demais marcas. Nesses produtos, as bactérias estão misturadas com agentes químicos espessantes, para mantê-las em suspensão. O espessante dificulta a visualização, deixando tudo borrado, após a coloração. Para evitar esse problema, siga o seguinte protocolo: 
1a 1- Com o auxílio de um gotejador limpo, retire uma pequena alíquota do frasco, para um recipiente limpo (tubo), junte um volume de água mineral, correspondente a duas alíquotas do produto, obtendo uma diluição final de 1:3; 
1a 2- Umedeça uma das pontas do contonete com o preparação diluida 1:3 e faça o esfregaço na lâmina ( Atente= A lâmina tem dois lados. Um deles tem uma parte esmerilhada (áspera). Serve para escrever, usando lápis grafite a outra parte é para colocar o esfregaço.
1a 3-Proceda à fixação do material, aqueça a lamina de vidro com o esfregasso, passando o lado inferior da lâmina, rapidamente, na chama (da lamparina, vela ou isqueiro) por 3 vezes 
1a 4-Cubra o esfregaço com o Cristal violeta (violeta de genciana) ou o Azul de metileno por 60 segundos 
1a 5-Lave com água, seque ao ar 
1a 6-Observe a lâmina, com o esfregaço fixado, ao microscópio
Obs: Ao final desta coloração, observe ao microscópio, começando a focalizar com a objetiva de menor aumento e, gradualmente, aumentando a intensidade da luz, até chegar na objetiva que necessita de óleo de imersão 
 
1b) Coloração e observação de leveduras 
1b.1 - Faça uma suspensão com um pouco de leveduras secas e água; 
1b.2 - Aguarde pelo menos meia hora, para que ocorra a hidratação, se usar as células secas. Se for usar o fermento fresco, pode dissolver e, imediatamente, preparar a lâmina, seguindo o seguinte protocolo: 
1b. 3 - Umedeça uma das pontas do contonete com a suspensão de leveduras e faça o esfregaço na lâmina;
1b. 4 - Proceda à fixação do material, passando o lado inferior da lâmina, rapidamente, na chama (da lamparina, vela ou isqueiro) por 3 vezes, 
1b.5 - Cubra o esfregaço com violeta de genciana ou azul de metileno, por 60 segundos 
1b.6 -Lave com água, seque ao ar 
1b.7 -Observe a lamina com leveduras ao microscópio 
1b.8 -Uma sugestão, é fazer os dois esfregaços numa mesma lâmina. Atente= A lâmina tem dois lados. Um deles tem uma parte esmerilhada (áspera). Serve para escrever, usando lápis grafite a outra parte é para colocar o esfregaço.
Obs: Ao final desta coloração, observe ao microscópio, começando a focalizar com a objetiva de menor aumento e, gradualmente, aumentando a intensidade da luz, até chegar na objetiva que necessita de óleo de imersão 
Anote os resultados, discuta-os com seu TP e seus colegas e coloque no relatório as suas conclusões.
PARTE 2 DA AULA PRÁTICA 2 - COMO PODEM SER DETECTADOS MICRÓBIOS PRESENTES NO AR E ASSOCIADOS AO NOSSO CORPO?
Objetivos - detectar a presença de micróbios no ar e associados ao corpo humano;
As bactérias por terem um tamanho médio de 1 µm, isoladamente, são invisíveis à nossapercepção visual, uma vez que o olho humano só consegue formar imagens de objetos com dimensões superiores a cerca de 0,2 mm. No nosso dia a dia, estamos em íntimo contato com os micróbios, quer no ar circulante, que pode estar repleto deles, quer nas situações que favorecem nossa aproximação com outros elementos do ambiente, como por exemplo, na manipulação de objetos que fazem parte do nosso cotidiano. 
Isoladamente não os vemos, mas se tiverem disponibilidade de nutrientes e estiverem um ambiente propício, eles se duplicam e, com o passar do tempo, formam colônias visíveis, com diâmetro compatível com o tempo de geração de cada um.
Material: duas placas de Petri com meio de cultura (Triptose-Soja Agar—TSA) para demonstração de micróbios no ambiente e associados às mãos;
PARTE 2 – ATIVIDADE 2. 1 = DETECTAR A PRESENÇA DE MICRÓBIOS NO AR
EXECUÇÃO = Veja o contudo da Aula 11, 1a Parte: Demonstração de micróbios no ambiente
 Esse fenômeno se observa quando expomos uma placa de Petri, contendo meio nutritivo, ao contato com o ar em movimento, durante um período de três a cinco minutos. Nessa caçada às bactérias presentes no ar, é comum se observar o aparecimento de colônias, umas após 24h, outras mais tarde, até 72h. As colônias maiores correspondem às bactérias que têm tempo de geração menor. Já as colônias que aparecem posteriormente, são formadas por bactérias que demoram mais a se duplicar, ou seja, tem tempo de geração maior. Depois da incubação é possível fazer uma análise sobre a diversidade microbiana presente no ar de um ambiente, a partir das colônias de fungos ou bactérias que proliferaram na placa. (Figura 7)
 
Figura 7: Representação de placa após caça aos micróbios no ar
PARTE 2 – ATIVIDADE 2. 2 = DETECTAR A PRESENÇA DE MICRÓBIOS ASOCIADOS À SUPERFICIE DA PONTA DE UM DOS DEDOS DAS MÃOS
EXECUÇÃO = Veja o contudo d a Aula 11, 2aa Parte: Demonstração de micróbios associados ao corpo humano
ATENÇÃO: COMO ECONOMIA DE MATERIAL. A PLACA A SER USADA NESTA ATIVIDADE DEVE SER CARIMBADA COM O DEDO DE DOIS DOS ESTUDANTES. PARA ISTO, MARQUE NO FUNDO DA PLACA, UMA DIVISÃO EM DUAS PARTES E DEPOIS CADA PARTE DEVE SER DIVIDIA EM QUATRO QUADRANTES, CONFORME MOSTRADO NA FIGURA 8:
Figura 8 : Placa para captura de micróbios nas mãos de dois usuários
 Dividindo uma placa contendo meio nutritivo em duas e depois em quatro partes, carimbe um dedo, em um dos quadrantes (1); Lave as mãos com água e detergente, enxágue bem, sacuda a mão gentilmente para escorrer o excesso de água e carimbe o mesmo dedo no quadrante (2); Repita esta etapa respectivamente para os quadrantes (3) e (4). Incube a placa e a examine, diariamente, por 72h.
Você pensou que os micróbios iriam desaparecer com as lavagens e isso não aconteceu. Porque será? Então, não adianta lavar as mãos? 
Lembre-se que a pele tem dobraduras, como o fole de um acordeon (Figura 9) e é por isso que consegue expandir (inchar) depois de um trauma ou na gravidez, por exemplo.
Figura 9: Fole de acordeon representativo das dobraduras da pele.
Na superfície do dedo seco, como na superfície do fole de um acordeom fechado, encontram-se os micróbios (bactérias ou fungos) que estão presentes no ambiente e ficam adsorvidos à mão depois de tocarmos nos mais diversos objetos (dinheiro, balaústre, telefones, maçanetas, entre outros) do nosso cotidiano (Figura 10). Esses micróbios são transitórios, na nossa microbiota e são facilmente retirados com as lavagens. Mas, à medida que as mãos são lavadas, as pregas ou dobraduras da pele vão se abrindo e assim expondo os micróbios das regiões mais internas da pele, ou seja, aqueles que constituem ou integram a nossa microbiota. Quando proliferam no meio de cultura da placa de Petri, dão origem às colônias que aparecem na superfície do meio. Observe que a diversidade dos tipos de colônias vai diminuído à medida que as mãos vão sendo lavadas. Portanto, ao lavarmos as mãos, nós nos livramos dos micróbios dos outros e expomos os da nossa microbiota, ou seja, os que fazem parte do nosso ser e com os quais estamos adaptados.
 
Figura 10: Instrumentos de troca de micróbios entre as pessoas
 Se não houver aparecimento de colônias na superfície do meio de cultura, carimbada após as lavagens, significa que o meio de cultura não tem a composição nutricional para suprir as necessidades das bactérias da microbiota daquele indivíduo, uma vez que, sem dúvida alguma, estão sempre presentes em todas as pessoas.
Da mesma forma que os seres humanos têm sua indelével cobertura microbiana, todos os seres vivos têm a deles. Não existe nada sem uma finalidade. Os micróbios que colonizam o corpo humano exercem funções muito importantes. De fato, tem sido demonstrado que eles são fundamentais para a saúde. E assim, essa relação harmônica é essencial para a vida no planeta.
PARTE 3 Atividade prática 2 - Técnica de Coloração de Gram
A técnica de Gram, também conhecida como coloração de Gram, é um método de coloração de bactérias, desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853 – 1938), em 1884, o qual permite diferenciar bactérias com diferentes estruturas de parede celular, a partir das colorações adquiridas, após tratamento com agentes químicos específicos. O método consiste em tratar sucessivamente um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol e fucsina básica. As bactérias que apresentam a coloração arroxeada são chamadas de Gram-positivas e aquelas que adquirem a coloração vermelha são chamadas de Gram negativas. O fundamento do método baseia-se no coeficiente de partição (afinidade) do composto iodopararosanilina (IPRA) que é formado pela reação do cristal violeta (hidrofílico) com o lugol (também hidrofílico) na primeira fase da coloração. O IPRA é um composto quimico hidrofóbico, e na busca pela estabilidade “foge” da fase aquosa, do ambiente protoplasmático, para a fase lipídica das membranas, porém quando essas membranas são exposta ao etanol, verifica-se que o IPRA tem maior afinidade pelo álcool etílico. Essa afinidade é demonstrada pela maior facilidade ou rapidez em dissolver no álcool. Esse grau de dissociabilidade é chamado de coeficiente de partição.
Em todas as células ocorre a formação do IPRA, de cor arroxeada que, por ser hidrofóbico, se adsorve na membrana lipídica das bactérias. A presença de uma parede de mureína (peptidioglicana) espessa, nas bactérias Gram positivas, impede que o álcool, no pouco tempo de exposição, alcance a membrana plasmática e arraste o IPRA, já que este produto tem mais afinidade com o álcool que com o lipídio. Ao receber a coloração de contraste, com fucsina, esta é superada pela coloração mais escura que permaneceu na membrana.
 Já nas Gram negativas, que têm uma parede de mureína pouco espessa, esta permite que a IPRA além da membrana plasmática também alcance a membrana lipídica externa à parede, que faz parte de sua estrutura de superfície. Assim, o álcool consegue atravessar a parede, alcança a membrana plasmática e o IPRA aí dissolvido, que tem maior afinidade com o álcool do que com o lipídio, é arrastado de ambas as membranas, deixando a célula descorada. Dessa forma, as células adquirem a cor avermelhada do corante fucsina.
 Desenvolvimento:
Usar lâmina desengordurada, seca;
1. Coletar o material do sulco gengival, com a ponta de algodão de uma haste flexível ;
1. Fazer esfregaço, rolando o algodão em um local da lâmina;
1. Passar rapidamente a lâmina 3 vezes na chama, no lado contrário ao esfregaço, para fixá-lo;
1. Colocar a lâmina num suporte, com o esfregaço para cima;
1. Cobrir o esfregaço com cristal violeta (CV) (hidrofílico à protoplasma) durante 1 minuto:
1. Lavar com água;
1. Cobrir o esfregaço com Lugol (hidrofílico àprotoplasma) , durante 1 minuto. Cristal	Violeta + Lugol à Iodopararosanilina (IPRA)	(hidrofóbico membranas lipídicas);
1. Lavar com água;
1. Lavar com álcool por 05 segundos; IPRA tem mais afinidade pelo álcool que pelos lipídios das membranas (coeficiente de partição maior no álcool que nagordura). Como as G- têm a parede pouco espessa e também uma membrana externa, o álcool tem acesso às membranas e o IPRA passa para o álcool , sendo retirado da célula, que fica descorada. Nas G+, cuja parede é espessa, o tempo de contato com o álcool não é suficiente para atravessar essa parede e o IPRA permanece na membrana mantendo a coloração roxa. (Figuras 11 e 13)
1. Lavar com água
1. Cobrir o esfregaço com fucsina durante 30 segundos.
1. Lavar com água. Esperar secar
1. Colocar uma gota de óleo de imersão
1. Observar ao microscópio com aumento de 1000 vezes.
 Como as G- ficaram descoradas, ao fazer a coloração com fucsina (hidrofílica), esta cora o protoplasma e a célula é observada em cor rosa. Nas G+, que permaneceram com a membrana plasmática corada em cor mais escura que a da fucsina, sobressai apenas a cor roxa.
 
	
	
	
 Figura 11: Representação de estruturas bacterianas 
 O Gram no tubo, representado na figura 12, ilustra a formação do IPRA e sua afinidade pelos lipídios. Esta pode ser comprovada com a adição de álcool, que arrastará o IPRA, deixando a camada lipídica clara, comprovando que este solvente não desfaz a membrana lipídica. Atentar que a cor da camada de óleo ficou diferente, mas permanece.
 (1) (2) (3) (4)
 	
	
	
	
 Legenda: Água + óleo (1) // (1) + CV (2) // (2) + lugol (3) // (3) + Álcool (4)
Figura 12: Verificação, em tubo, do que ocorre até à lavagem com álcool, para entender o princípio físico-químico do método de Gram
Princípio físico-químico do método: Duas substâncias hidrofílicas (CV e Lugol), ao reagirem formam uma terceira de caráter hidrofóbico (IPRA). O Gram no tubo mostra que o coeficiente de partição (ou a afinidade do IPRA), é maior no álcool do que no óleo. Então, pode-se concluir que não há destruição das estruturas de parede ou membrana celulares , mas sim constatação de diferentes afinidades (coeficientes de partição) do IPRA , demonstrada pela maior dissolução do IPRA no álcool.
	 
	
	
 
Figura 13: Lâminas de bactérias, coradas pelo método de coloração de Gram 
Capriche no relatório, usando sua compreensão do que executou, utilizando suas próprias palavras.
 FONTES DE CONSULTA:
· • LIBERTO, M.I.M.; CABRAL, M.C.; LINS, U.G.C. Microbiologia. Vol. 1, 2ª Edição. 
Ed. CECIERJ RJ. 2010. 
· • FUQUA, C.; WINANS,C; GREENBERG, E.P. Census and consensus in bacterial 
ecosystems: the LuxR-LuxI Family of quórum-sensing transcripsional regulators. 
Annu Ver. Microbiol, 50: 727-751. 1996 
· • https://pt.wikipedia.org/wiki/Lactobacillus 
· • https://www.infoescola.com/alimentos/yakult/ 
· • https://winepedia.com.br/curiosidades/historias-do-vinho-e-da-cerveja/ 
· • https://pt.wikipedia.org/wiki/P%C3%A3o 
· • http://www.rc.unesp.br/ib/ceis/mundoleveduras/Classificacaodasleveduras.pdf 
· • https://www.sobiologia.com.br/conteudos/Reinos/biofungos4.php 
· • https://pt.wikipedia.org/wiki/P%C3%A3o 
· • https://www.ufrgs.br/labdim/wordpress/biofilmes-diversidade/ 
· • https://ecomicro.edublogs.org/tag/liquen 
 http://www1.uefs.br/disciplinas/bio221/analise_discussao_resultados_isolament 
o_microfungos.rtf 
http://www.prof2000.pt/users/biologia/tcolgram.htm 
https://anaemaurobioifes.wordpress.com/2011/04/04/metodo-de-coloracao-de- gram/
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