RESUMO BIOMOL - Cultura de Células

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Cultura de Células  
® Diferentes tipos celulares podem crescer em cultura (in vitro). 
Ex.: fibroblastos; mioblastos; oligodendrócitos. 
 
® O isolamento das células é a primeira etapa da cultura 
Isolamento mecânico: tesouras, pinças, facas, bisturis. 
Isolamento enzimático: tripsina, quimiotripsina, colagenase para separar as células da MEC. 
Isolamento por quelantes de íons divalentes (Ca e Mg): EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) e EGTA (ácido etileno glicol tetra-acético) para separar as adesões célula-célula. 
 
® Uso de culturas de células: 
Vantagens: praticidade quando comparada ao uso de animais; reprodutibilidade; questões éticas ligadas ao não uso de animais em pesquisas; modelo especialmente bom para certos estudos: adesão célula-célula, célula-MEC, fatores secretados etc. 
Desvantagens: modelo afastado da situação “in vivo”. 
 
® Como separar um só tipo celular de um tecido que contém vários tipos celulares? 
Células de diferentes tamanhos e/ou densidades podem ser separadas através de centrifugações. 
Células com diferentes habilidades para aderir ao plástico da placa de cultura podem ser separadas com diferentes tempos de adesão. 
 
® Culturas primárias: são preparadas diretamente a partir do animal de origem; semelhantes ao in vivo; normalmente, apresentam mais de um tipo celular; só passam por até 40 ciclos de divisão celular e depois morrem. 
® Linhagens celulares: oriundas de tumores ou de células que foram transformadas com vírus indutores de tumores; são células imortalizadas que irão possuir alta taxa de proliferação. 
® O meio de cultura deve possuir, além de nutrientes para as células, uma solução tampão para evitar qualquer alteração no volume e um possível rompimento da membrana.
 ELETROFORESE 
® Objetivo: analisar as proteínas presentes em uma determinada amostra. 
® Procedimento: 
Músculo de cobaia → picotar ①→ proteínas carregadas negativamente (SDS) → eletroforese desnaturante de proteínas 
① Tampão de “lise” (quebra): desnaturar proteínas, separar as subunidades. Utilizando 
β-mercapto-etanol; ditio-etreitor (DTT); detergente: SDS (dodecil sulfato de sódio). 
 
  
  
® Duas placas de vidro separadas apenas por fitas de acrílico que impedem seu contato; é inserido o gel de poliacrilamida 4 – 20% (o mais usado é de 8 a 12%). 
®Quanto maior a porcentagem de poliacrilamida, mais denso é o gel, maior a dificuldade de passagem de proteínas pesadas.  
® Quatro amostras diferentes são colocadas nos “poços”; as proteínas das amostras estão carregadas negativamente; aplica-se uma carga no sentido indicado para que as amostras “corram” através do gel; padrões diferentes de bandas de proteínas são formados ao longo do gel pela diferença do peso molecular das proteínas presentes nas amostras; as bandas são visíveis com a utilização de um corante chamado azul de coomassie. 
 
 IMUNOFLUORESCÊNCIA 
® A imunofluorescência permite a detecção e localização de antígenos em células e tecidos utilizando anticorpos específicos, marcados com fluorocromos, o que torna esses antígenos visíveis ao microscópio de fluorescência. 
® Baseia-se na capacidade dos anticorpos se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno. 
® Fluorocromos são substâncias que possuem fluorescência, ou seja, que emitem luz quando expostas à radiação UV. 
® Imunofluorescência direta: o anticorpo específico é marcado com um fluorocromo e este conjunto é adicionado à amostra. Ele se liga ao antígeno, iluminando-o ao microscópio de fluorescência. 
® Imunofluorescência indireta: utilizam-se 2 anticorpos, o primeiro para o antígeno, o segundo pra o primeiro anticorpo; o fluorocromo estará ligado a este segundo anticorpo. 
® Vantagem da técnica indireta: aumento da luminosidade, pois mais anticorpos ligados a fluorocromos estarão atrelados, de alguma forma, ao antígeno. 
® Aplicações da técnica: identificar e localizar proteínas específicas, como por exemplo, os componentes do citoesqueleto estudados; tipagem de tumores. 
 TIPAGEM DE TUMORES 
A tipagem de tumores consiste em descobrir a origem do tumor. Para isto, costuma-se usar anticorpos contra proteínas dos filamentos intermediários, já que estes variam de acordo com o tipo celular. 
Exemplo, se for feito um teste com anti-queratina e der positivo, significa que o tumor tem origem em células epiteliais. 
® Não é válido fazer esta análise para identificar actina, tubulina e laminas, pois, lembrando, estas são proteínas ubiqüitárias, ou seja, que são encontradas em todas as células eucarióticas. 
® Outra ressalva: a VIMENTINA também não é uma opção neste caso, pois ela é encontrada em células com alta taxa de proliferação, como células mesenquimais (da medula), em cultura e também em células tumorais, qualquer que seja sua origem.