Eletroforese: Técnica Biomolecular

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Da PCR ao
sequenciamento
de 3° geração
ELETROFORESE:
C L U B E
DO DNA
OLÁ! SEJA BEM-VINDO AO CLUBE DO DNA
Olá! Eu sou o Eduardo Castan e o caderno de hoje é 
sobre eletroforese, uma das técnicas mais utilizadas 
da biologia molecular.
CORRAM!
AS HIENAS ESTÃO
CHEGANDO!!
Um belo dia, Simba, Timão e Pumba
estavam passeando por uma floresta
não muito distante do cemitério de
elefantes.
Logo acima deles, no céu, Zazu voava
em círculos, observando toda a região
em busca de possíveis perigos.
O passeio corria tranquilamente até que Zazu avistou um grupo de hienas que se
aproximava rapidamente do trio. Lá de cima, Zazu gritou:
Simba, Timão, Pumba, corram!
Os três obedeceram sem questionar e começaram a correr, todos na mesma
direção.
Tem um grupo de hienas logo atrás de vocês!
Como estavam em uma floresta com muitas árvores e arbustos, Timão, que era o
menor dos três, conseguia correr mais rapidamente, desviando agilmente dos
galhos, troncos e raízes.
Os três amigos continuaram correndo por alguns minutos. Timão avançava mais
rapidamente que Pumba, que, por sua vez, corria mais rápido do que Simba.
Em certo momento, Zazu gritou mais uma vez:
— Podem parar! Não precisam mais correr porque as hienas já foram
embora.
Mais uma vez, o trio obedeceu.
Lá de cima, Zazu conseguia ver seus amigos parados, recuperando o fôlego:
Timão na frente, Simba atrás e Pumba no meio do caminho.
Pumba, que era mais gordinho, apesar de também conseguir correr desviando
dos obstáculos, seguia mais lentamente que Timão. No entanto, Pumba
conseguia ser mais rápido do que Simba, um leão grande e forte.
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E L E T R O F O R E S E
O R E I L E Ã O E A E L E T R O F O R E S E
O F L U X O D E T R A B A L H O
O R E S U L T A D O
A S P E C T O S G E R A I S
A G A R O S E
P O L I A C R I L A M I D A
R E S O L U Ç Ã O 
S O L U Ç Ã O T A M P Ã O 
L A D D E R , P A D R Ã O O U M A R C A D O R D E P E S O
O Q U E C O N S I D E R A R
A M O S T R A
T A M P Ã O D E C A R R E G A M E N T O
C O R R I D A
V I S U A L I Z A Ç Ã O D A S A M O S T R A S
A P L I C A Ç Õ E S 
E L E T R O 4 E V E R
S O B R E O A U T O R
 ÍNDICE 
2 7 . S O B R E O C L U B E D O D N A
3 0 . L O C C U S 
ELETROFORESE
A eletroforese é uma técnica utilizada para
separar biomoléculas, como DNA, RNA e
proteínas, de acordo com seu tamanho,
carga e estrutura.
Seu princípio pode ser comparado à história
de Simba, Timão e Pumba fugindo das
hienas em uma floresta fechada. Assim
como os personagens precisam atravessar
obstáculos, as moléculas migram através
da malha de uma matriz, que pode ser um
gel ou outra substância viscosa.
Essa matriz oferece resistência ao
movimento das moléculas, de forma que as
menores conseguem se deslocar mais
rapidamente, enquanto as maiores
avançam mais lentamente.
Rei Leão: Três amigos caminhando juntos.
Eletroforese: Moléculas de DNA ou RNA (ex.: produto de PCR).
Rei Leão: Uma floresta fechada que dificulta a corrida.
Eletroforese: Uma matriz porosa.
Rei Leão: Hienas de um lado da floresta forçando o trio a correr na direção oposta.
Eletroforese: O polo negativo repele moléculas de carga negativa (DNA e RNA),
forçando-as a migrar em direção ao polo positivo.
Rei Leão: Zazu avisa a hora de correr.
Eletroforese: A corrente elétrica em solução tampão cria condições favoráveis para
a migração das moléculas.
Rei Leão: Timão, por ser pequeno, corre mais rapidamente pela floresta do que
Pumba, que, por sua vez, corre mais rápido do que Simba, que é grande.
Eletroforese: Fragmentos de DNA ou RNA com menor quantidade de pares de bases
migram mais rapidamente pelo gel do que fragmentos com maior quantidade de
pares de bases.
Rei Leão: No final, Timão estará mais longe das hienas.
Eletroforese: No final, os fragmentos de menor peso molecular (com menos pares
de bases) estarão mais distantes do polo negativo e, portanto, mais próximos do
polo positivo.
O REI LEÃO E A ELETROFORESE
Polos positivo e negativo: Eletrodos acoplados à cuba, onde serão
inseridos o gel, as amostras e a solução tampão.
Corrente elétrica: Gerada pelos eletrodos e mantida pela solução
tampão, que possui força iônica e capacidade de manter o pH ao longo
da corrida.
Todo o processo explicado anteriormente é altamente padronizado,
contando com diversos equipamentos e reagentes disponíveis para
sua realização de forma rápida e prática.
Matriz porosa: Gel de agarose ou gel de poliacrilamida, que podem ser
preparados em formatos e dimensões adequadas.
E m p r i m e i r o l u g a r , é n e c e s s á r i o t e r u m a a m o s t r a d e á c i d o
n u c l e i c o q u e , a o s e r p r o c e s s a d a p o r e l e t r o f o r e s e , p o d e r á
f o r n e c e r a l g u m t i p o d e i n f o r m a ç ã o . I s s o p o d e i n c l u i r , p o r
e x e m p l o , a a n á l i s e d e u m p r o d u t o d e P C R o u a v e r i f i c a ç ã o
d a i n t e g r i d a d e d e u m a a m o s t r a d e R N A .
E m s e g u i d a , s e r á p r e c i s o p r e p a r a r o g e l . N a m a i o r i a d o s
c a s o s , s u a p r o d u ç ã o n ã o é m u i t o d i f e r e n t e d a r e c e i t a d e
u m a g e l a t i n a c a s e i r a . N e s s e p r o c e s s o , a a g a r o s e , u m a
s u b s t â n c i a e m p ó , é m i s t u r a d a c o m u m a s o l u ç ã o t a m p ã o
q u e n t e . E s s a m i s t u r a é d e s p e j a d a e m u m a f o r m a e , a o
e s f r i a r , s e s o l i d i f i c a ( p o l i m e r i z a ) , f o r m a n d o o g e l .
O g e l é e n t ã o r e t i r a d o d a f o r m a e c o l o c a d o n o a p a r a t o d e
e l e t r o f o r e s e . L á , e l e f i c a r á s u b m e r s o e m s o l u ç ã o t a m p ã o ,
c o m o s p o c i n h o s q u e r e c e b e r ã o a s a m o s t r a s p o s i c i o n a d o s
p r ó x i m o s a o p o l o n e g a t i v o .
D e p o i s , a l g u n s m i c r o l i t r o s d a a m o s t r a s e r ã o
h o m o g e n e i z a d o s c o m u m s e g u n d o t a m p ã o , c h a m a d o
t a m p ã o d e c a r r e g a m e n t o . F a l a r e m o s m a i s s o b r e e l e
a d i a n t e .
A a m o s t r a m i s t u r a d a c o m o t a m p ã o s e r á p i p e t a d a d e n t r o
d e u m d o s p o c i n h o s d o g e l .
P o r f i m , o a p a r a t o s e r á f e c h a d o , e a c o r r e n t e e l é t r i c a s e r á
g e r a d a p o r u m a f o n t e e s p e c í f i c a , 
c a p a z d e c o n t r o l a r a v o l t a g e m .
P r o n t o ! A g o r a , b a s t a a g u a r d a r 
a l g u n s m i n u t o s p a r a q u e 
o s f r a g m e n t o s d a a m o s t r a 
m i g r e m a t r a v é s d o s 
p o r o s d o g e l .
O FLUXO DE TRABALHO
O RESULTADO
No final da eletroforese, os diferentes
fragmentos de DNA ou RNA estarão
agrupados em diferentes porções do gel,
formando as bandas.
Essas bandas somente são possíveis de
serem vistas porque:
1 – Em algum momento ao longo do fluxo de
trabalho (eu não falei sobre isso ainda), o
ácido nucleico presente na amostra será
associado a uma molécula capaz de
produzir fluorescência.
2 – Essa fluorescência será excitada por luz
de comprimento específico. Geralmente, tal
fonte de luz está presente em um
equipamento chamado transiluminador
que, como o nome sugere, irá projetar luz
através do gel, permitindo a visualização
das bandas.
ASPECTOS
PRÁTICOS
AGORA QUE VOCÊ JÁ TEM
OS CONCEITOS INICIAIS
Sobre eletroforese, podemos falar de
aspectos mais práticos sobre essa técnica
– informações que você poderá aplicar
diretamente no laboratório.
Vamos começar falando sobre os tipos de
géis.
São basicamente 2 tipos:
Agarose
Poliacrilamida
AGAROSE
Polímero purificado a partir de ágar – um
polissacarídeo proveniente de algas
marinhas.
Curiosidade: aproximadamente 100toneladas de agarose são utilizadas
anualmente em laboratórios ao redor do
mundo.
A produção do gel é semelhante à
preparação de gelatina caseira.
Possui poros maiores que a
poliacrilamida.
Pode ser utilizada para analisar
fragmentos de 50 a 50 mil pares de
bases.
Capaz de separar fragmentos com até 5
pares de bases de diferença.
POLIACRILAMIDA
Substância sintética.
O gel é formado pela mistura de
acrilamida e bisacrilamida.
É uma neurotoxina, portanto, deve ser
manipulada com cuidado.
A polimerização é química, iniciada por
persulfato de amônio (APS) e catalisada
por TEMED
Possui poros menores que a agarose.
Pode ser utilizada para analisar
fragmentos de 5 a 3 mil pares de bases.
Capaz de separar fragmentos com até 3
pares de bases de diferença
RESOLUÇÃO
Acho que deu para entender que o
tamanho dos poros do gel está
relacionado com a faixa de tamanho
de fragmentos passíveis de serem
analisados.
Poros menores = fragmentos menores
= maior resolução Poros maiores =
fragmentos maiores = menor
resolução
Independentemente do tipo do gel, é
possível controlar o tamanho dos
poros e, portanto, a resolução da
eletroforese. Para isso, basta
aumentar a concentração do gel. Ou
seja, aumentar a quantidade de
agarose ou poliacrilamida em relação
ao volume do tampão.
Veja na imagem a seguir, por
exemplo, como as bandas referentes
aos dois fragmentos menores se
distanciam entre si (aumento de
resolução) conforme aumenta a
concentração do gel.
SOLUÇÃO TAMPÃO
1 – Solução utilizada na preparação do gel
2 – Solução com condutividade elétrica na
qual o gel permanecerá imerso ao longo
da corrida.
Este tampão tem como objetivo realizar a
manutenção do pH e favorecer a troca
iônica (corrente elétrica) no decorrer da
eletroforese.
Salvo algumas exceções, são utilizados 2
tipos de solução tampão:
TAE (Tris-acetato e EDTA)
TBE (Tris-borato e EDTA)
É altamente recomendado que o tampão
utilizado para a produção do gel seja o
mesmo tampão utilizado durante a
corrida.
Veja a seguir as recomendações sobre
quando utilizar TAE ou TBE.
LADDER, PADRÃO OU
MARCADOR DE PESO
MOLECULAR
Imagine que você acabou de realizar uma
eletroforese para confirmar o resultado de
uma PCR.
Tudo funcionou lindamente. No meio do gel
tem uma única banda perfeitinha, forte e
sem arraste. Aí eu te pergunto:
Quem garante que aquela banda é de fato
o alvo que você pretendia amplificar com a
PCR?
Na verdade, nada te garante. Para você ter
certeza absoluta de que a PCR funcionou
como esperado, só sequenciando o produto
da reação.
Porém, há mecanismos, como o ladder por
exemplo, que podem ser fortes indicativos
de sucesso ou indicativos da causa da
falha.
O ladder nada mais é do que uma amostra
de DNA ou RNA com fragmentos conhecidos
e de diversos tamanhos que serve como
referência, como padrão no momento da
análise do resultado.
Aquela sua banda perfeita, formada ao
longo da corrida, estará ao lado de um
padrão que possui várias bandas de
tamanhos conhecidos e que, portanto,
servem como referência.
O QUE CONSIDERAR AO
ESCOLHER O LADDER
O seu ponto de partida é: o ladder deve
representar a sua amostra. Ou seja, se ele
servir como referência no momento da
análise dos resultados, ele deve ter as
mesmas características de sua amostra.
Tipo: RNA ou DNA
Estrutura: fita dupla ou fita simples
Conformação: linear, circular ou
enovelado.
Você também deve levar em
consideração:
• Número de fragmentos e padrão de
separação.
• Compatibilidade com o gel
• Objetivo (alguns ladders podem ser
utilizados no processo de quantificação).
• Tampão de carregamento (pode ocultar
algumas bandas do ladder).
AMOSTRA
Nem muito, nem pouco.
Uma amostra em baixa quantidade pode
não gerar um sinal fluorescente forte o
suficiente para ser detectado. Calcula-se,
aproximadamente, de 1 a 100 ng de ácido
nucleico por banda. Essa quantidade pode
variar dependendo do agente fluorescente
utilizado. Por outro lado, o excesso de
amostra também pode ser prejudicial: As
bandas podem se sobrepor. O processo de
migração pode deixar de ocorrer de forma
linear, resultando em bandas deformadas.
E s t e é o t a m p ã o q u e v a i m i s t u r a d o c o m a a m o s t r a q u e
m e n c i o n e i a n t e r i o r m e n t e . E l e t e m a l g u m a s f u n ç õ e s m u i t o
i m p o r t a n t e s :
O t a m p ã o é v i s c o s o e d e n s o , o q u e f a z c o m q u e a a m o s t r a
s e j a c a r r e g a d a p a r a o f u n d o d o p o c i n h o d o g e l e n ã o s e
d i s p e r s e n o t a m p ã o d e c o r r i d a .
F a v o r e c e a d i s t r i b u i ç ã o h o m o g ê n e a d a a m o s t r a p e l o
p o c i n h o .
F a z a m a n u t e n ç ã o d o p H .
P o s s u i f o r ç a i ô n i c a p a r a g e r a ç ã o d e c o r r e n t e e l é t r i c a .
E v i t a a d e g r a d a ç ã o d o á c i d o n u c l e i c o p o r i n i b i r a t i v i d a d e
d e n u c l e a s e s .
S u a m i g r a ç ã o é v i s í v e l a o l o n g o d a c o r r i d a , o q u e p e r m i t e o
m o n i t o r a m e n t o d a e v o l u ç ã o d a e l e t r o f o r e s e . D e v e o c u p a r
c e r c a d e 3 0 % d o v o l u m e d o p o c
TAMPÃO DE CARREGAMENTO
C o n f i g u r a ç ã o : e x i s t e m a p a r a t o s d e e l e t r o f o r e s e q u e
p e r m i t e m q u e a c o r r i d a o c o r r a n a h o r i z o n t a l e a p a r a t o s d e
c o r r i d a v e r t i c a l .
V o l t a g e m : g e r a l m e n t e d e 5 a 1 0 V / c m .
D e p e n d e d o t a m a n h o d o s f r a g m e n t o s .
T a m p ã o d e c o r r i d a
S e m u i t o a l t a , p o d e d i s t o r c e r o p a d r ã o d e m i g r a ç ã o . 
S e m u i t o b a i x a , p o d e f a v o r e c e r a d i s p e r s ã o d a s b a n d a s .
CORRIDA
CORRIDA
Tempo:
Depende
Tamanho do gel
Voltagem
Tamanho do fragmento
Geralmente, a corrida pode ser
interrompida depois que o fragmento alvo
migrou de 40% a 60% do comprimento do
gel.
Ou depois que o tampão de carregamento
migrou de 60% a 80% do comprimento do
gel.
O mais importante é não deixar o alvo cair
do gel por excesso de migração.
VISUALIZAÇÃO DAS AMOSTRAS
Pode ser realizada de algumas maneiras, mas geralmente ocorre por
meio de agentes fluorescentes.
Estes agentes passam a emitir fluorescência em intensidade muito
maior quando estão associados a ácidos nucleicos.
Uma vez associados aos alvos, os fluoróforos podem ter sua
fluorescência excitada por comprimentos específicos de luz e,
posteriormente, detectada por câmeras específicas ou mesmo a olho
nu.
O brometo de etídio é um dos agentes fluorescentes mais conhecidos e
mais populares. No entanto, ele tem uma grande desvantagem, pois é
uma molécula altamente mutagênica.
O brometo de etídio ou EtBr demanda cerca de 1 ng de amostra para
gerar banda detectável. Sua fluorescência é excitada por luz
ultravioleta.
Há alternativas ao EtBr, como o SYBR Green e suas variações, por
exemplo.
São moléculas de funcionalidade semelhante ao brometo, mas com
atividade mutagênica muito menor. Demandam de 25 pg a 3 ng de
amostra (dependendo do tipo) e têm sua fluorescência excitada por luz
azul.
APLICAÇÕES
A eletroforese é uma técnica que permite a
detecção e análise de fragmentos de DNA e
RNA. Portanto, possui um grande leque de
aplicações, principalmente na pesquisa.
Veja alguns exemplos:
Análise de resultado de experimentos (PCR,
clonagem, digestão por enzima de
restrição).
Quantificação de ácidos nucleicos.
Análise de pureza (ex.: verificação de
contaminação por DNA genômico em
amostras de RNA).
Integridade (ex.: verificação da integridade
de amostras de RNA total por meio da
presença e proporção de RNAs
ribossomais).
Detecção e recuperação de fragmentos de
interesse. Em alguns casos, a banda
formada após a eletroforese pode ser
removida do gel e purificada para uso
posterior.
ELETRO 4EVER
Apesar de ter sido desenvolvida na década de 1960, a
eletroforese ainda é amplamenteutilizada na pesquisa,
em configurações semelhantes às que exploramos ao
longo deste caderno.
No entanto, suas variações e aprimoramentos permitiram
que essa técnica fosse aplicada em diversas áreas,
tornando-se essencial tanto para a pesquisa quanto para
mercados especializados. Alguns exemplos incluem:
Sequenciamento Sanger: nesse método, a separação dos
fragmentos a serem sequenciados ocorre de forma
semelhante ao que explicamos anteriormente. A principal
diferença está na matriz utilizada para a migração das
amostras, que é uma solução viscosa em vez de um gel - e
a estrutrura onde ocorre a corrida - que é um caninho
comprido e um pouco mais grosso que um fio de cabelo e
não um aparato convencional de eletroforese.
Análise de fragmentos: essa técnica utiliza a estrutura do
equipamento de sequenciamento Sanger para realizar
eletroforese de forma semelhante à tradicional. É
amplamente empregada na identificação humana na área
forense e em testes de paternidade.
Sequenciamento de terceira geração: representa o estado
da arte na tecnologia de sequenciamento de DNA e RNA.
Ainda assim, a eletroforese continua sendo a base desse
processo inovador.
TERMINAMOS
SEU CADERNO
DE HOJE
COM ISSO
ESPERO QUE TENHA GOSTADO
QUEM É 
EDUARDO CASTAN?
SOBRE O AUTOR
Geneticista com mais de 15 anos de experiência em técnicas de Biologia
Molecular com mestrado em Genética e Melhoramento Animal pela
Unesp/Melbourne University na Austrália e doutorado pela Unesp/Harvard
University nos EUA.
Possui MBA pela FGV, é fundador da Universo da Biologia Molecular,
empresa que hoje conta com um canal no Youtube com mais de 60 mil
inscritos e 2 milhões de visualizações no total, uma escola por assinatura
que capacita profissionais de todo o Brasil na área de biologia molecular.
Atualmente é diretor de marketing na Loccus e é responsável também pela
produção de conteúdo na Universo da Biologia Molecular.
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