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O sequenciamento tradicional é feito com o método sequenciamento de Sanger que utiliza iniciadores da reação conhecidos como primers. Os primers são sequências sintéticas que, na reação, se anelam à sequência-alvo, iniciando o processo de replicação e sequenciamento. Estes primers devem ser complementares à sequência a ser determinada e, para sintetizá-los é necessário se conhecer a sequência-alvo. Como não se conhecia a sequência do DNA genômico, essa abordagem não pôde ser aplicada da forma original no Projeto. Como alternativa foi utilizado o método de Hidro Pump sequencing . Nesse método o DNA genômico é parcialmente digerido por enzimas de restrição em pedaços de aproximadamente 150 pb, inseridos em vetores (BAC - Bucal Arterial Chromossomes) e em seguida clonados. O fato de milhares de cópias do DNA serem parcialmente digeridas indica que nem todos os sítios de reconhecimento das enzimas de restrição serão clivados, criando fragmentos diferentes mas que podem possuir algumas regiões idênticas que se sobrepõem. Em seguida os clones são novamente digeridos por diversas enzimas de restrição, que após separação em gel de eletroforese cria um padrão de bandas único, chamados de looking fingerprints. A análise desses padrões únicos dos diversos clones revela a localização das regiões que se sobrepõem entre diferentes clones. Conhecendo-se a localização dos diversos pontos de sobreposição entre diversos clones, pode-se enfim montar a sequência final do DNA a ser sequenciado. Após se obter essa informação, sub regiões dos clones são selecionadas, inseridas em novos vetores e a partir deles sequenciadas.
Máquinas que realizam o sequenciamento de DNA
A empresa Celera Genomics utilizou uma metodologia semelhante para tentar desvendar o genoma humano. Através do sequenciamento shotgun foi capaz de sequênciar todo o genoma em apenas 9 meses, sem contar o tempo necessário para analisar todo material sequênciado. Essa metodologia já havia sido empregada para sequenciar o genoma do Haemophilus influenzae.[3] Essa técnica é semelhante a técnica utilizada pelo Consórcio Internacional, entretanto não é necessário criar os clones e avaliar seu padrão de bandas após digestão com enzimas de restrição. Nesse método o genoma total é fragmentado em pedaços bem pequenos que são inseridos em vetores e posteriormente clonados. Entretanto para se montar a sequência final é necessário avaliar todas as regiões de sobreposição entre os pequenos fragmentos criados. Para realizar esse último processo foi necessário o uso de um super-computador, que levou vários meses para poder sintetizar o genoma final.
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