PCR lepto

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Acta Scientiae Veterinariae, 2013. 41: 1114.
 RESEARCH ARTICLE
 Pub. 1114
ISSN 1679-9216
1
Received: 18 May 2012 Accepted: 24 October 2012 Published: 30 January 2013
¹Discente, Curso de Medicina Veterinária da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), Ilhéus, Bahia, Brazil. ²Hospital Veterinário - UESC, Ilhéus, 
Bahia. ³Clinica de Pequenos Animais. 4Pleno de Genética e Melhoramento Animal do Departamento de Ciências Agrárias e Ambientais, UESC, Ilhéus, 
Bahia. CORRESPONDENCE: F.S. Carvalho [fabiouesc@gmail.com - Tel.: +55 (73) 3680-5406]. Universidade Estadual de Santa Cruz, Hospital Vet-
erinário, km 16, Salobrinho. CEP 45662-900 Ilhéus, Bahia, Brazil.
Investigação molecular de Leptospira spp. em rins de bovinos 
Molecular Research of Leptospira spp. in Kidneys of Cattle 
Janaína Maria Xavier Corrêa¹, Fábio Santos Carvalho², 
Renata Santiago Alberto Carlos³ & Amauri Arias Wenceslau4
ABSTRACT 
Background: Leptospirosis is a zoonotic bacterial disease caused by Leptospira spp. that affects wild and domestic animals 
and humans. It has a worldwide distribution and causes public health problems and economic losses in livestock. The genus 
Leptospira is divided basically into two species: the Leptospira interrogans that is pathogenic and Leptospira bifl exa that 
is considered saprobic. Cattle are an important source of infection, mainly to humans who work with these animals such 
as breeders, cowboys, slaughtermen, veterinarians and agricultural technicians. The temperature and rainfall indices of 
tropical and subtropical climate regions encourage the continuing disease outbreaks. In humans the symptoms are head-
ache, fever, myalgia, nausea and vomiting. The identifi cation of the disease is possible with some tests such as ELISA, 
immunofl uorescence, bacterial culture, and Polymerase Chain Reaction (PCR). The aim of this work was to perform the 
molecular research for the presence of Leptospira spp. in kidneys of cattle refuted at a slaughterhouse.
Materials, Methods & Results: Two hundred fragments of cattle kidney were collected at slaughterhouse located at Ilhéus, 
Bahia, Brazil. The macroscopic kidney refutation causes were nefritis, presence of cysts, congestion and presence of whit-
ening and hemorrhagic areas. The kidney samples were placed in plastic containers identifi ed and packed in an isother-
mal box until arrival at the laboratory, where they were kept at -20°C until the DNA extraction with phenol/chloroform/
isoamyl alcohol (25:24:1). The DNA was quantifi ed by spectrophotometer at 260 nm wavelength. The integrity of DNA 
was evaluated with 1% agarose gel stained with ethidium bromide and visualized at an ultraviolet light transilluminator. 
DNA amplifi cation was performed with primers G1- [forward] 5’-CTGAATCGCTGTATAAAAGT-3’ and G2- [reverse] 
5’-GGAAAACAAATGGTCGGAAG-3’ for pathogenic and non-pathogenic Leptospira. Aliquots of 50 ng/µL of extracted 
DNA were used for PCR reaction. Out of 200 tissue samples, 16 (8%) were positive and the amplifi ed fragments had 
molecular weight compatible with Leptospira spp. 
Discussion: The amplicons presented molecular weight compatible with pathogenic and non-pathogenic strains of Leptospira 
spp. wich may represent a health risk for the ones who may contact animals or consume uncoocked products. Leptospira 
molecular diagnose may allow the pathogen identifi cation in asymptomatic animals from small DNA amounts. Primers G1 
and G2 amplifi ed bacterial 16S rRNA gene area, allowing the identifi cation. The renal tissue alterations identifi ed during 
inspection, may be associated with Leptospira spp. presence showing the fundamental importance of correct identifi cation 
and discard of affected organs in order to reduce the bacterial transmission risk. Many articles have being showing the 
Leptospira cattle prevalence and human risks by contacting these animals. The results presented in this article emphasizes 
the importance of the cattle as possible transmitters of the pathogen for slaughterhouses workers and meat inspectors, vet-
erinarians as well as rural workers and their families, being critical to conduct orientation and conscientization programs 
about the problem and ways to combat and control it.
Keywords: leptospirosis, PCR, kydneys, slaughterhouse, zoonosis, Bos taurus. 
Descritores: leptospirose, PCR, rins, abatedouros, zoonoses, Bos taurus.
2
 J.M.X. Corrêa, F.S. Carvalho, R.S.A. Carlos & A.A. Wenceslau. 2013. Investigação molecular de Leptospira spp. em rins de bovinos. 
 Acta Scientiae Veterinariae. 41: 1114.
INTRODUÇÃO
Leptospiras são bactérias espiroquetas móveis 
pertencentes ao gênero Leptospira que é composto por 
duas espécies: L. interrogans que é patogênica com 
mais de 200 sorotipos e L. bifl exa que é sapróbica [7]. A 
leptospirose tem ocorrência mundial, porém as regiões 
com climas tropical e subtropical favorecem a ocor-
rência da doença, sendo endêmica no Brasil [1,4,24]. 
A leptospirose é uma doença com caráter 
ocupacional que acomete agricultores, criadores de 
gado, veterinários e funcionários de matadouros, nesses 
indivíduos a doença parece estar associada à infecção 
em bovinos [3,7,16,21,22]. 
Os principais sinais clínicos da leptospirose em 
bovinos são febre, anorexia, hemoglobinúria, icterícia 
e dispnéia. As manifestações clínicas crônicas são 
abortos, infertilidade, repetições de cio, nascimentos de 
bezerros fracos, agalactia e mastite [5,20,24]. Os sinais 
clínicos em humanos são cefaléia, febre, mialgia, ic-
terícia, incapacidade renal leve, insufi ciência hepática, 
vômitos e hemorragia pulmonar [2,21].
Essa zoonose além de propiciar problemas na 
saúde pública acarreta perdas econômicas devido aos 
entraves do processo de reprodução dos bovinos [22,24]. 
Exames como o ELISA, imunofl uorescência 
e a cultura bacteriana podem ser utilizados para o di-
agnóstico, sendo a Reação em Cadeia da Polimerase 
(PCR) sensível, específi ca e rápida para identifi car 
o DNA do agente em tecidos e fluidos corporais 
[8,16,19,27], como o sêmen [13,28], rim, fígado, 
conteúdo estomacal de fetos, placenta, cotilédone [14], 
urina [12] e sangue [25]. 
O trabalho investigou, através de método 
molecular, a presença de Leptospira spp. em rins de 
bovinos refutados no abate. 
MATERIAIS E MÉTODOS
A cidade de Ilhéus localiza-se no litoral sul do 
Estado da Bahia (14º 47’ 20” de latitude sul, 39º 02’ 
56” de longitude oeste). Encontra-se no nível do mar 
e possui área territorial de 1.760,004 Km2 e 184.236 
habitantes segundo senso IBGE 2010 [11]. O clima 
é tropical e o índice pluviométrico médio anual está 
entre 2000-2400 mm. Foram coletadas 200 amostras 
de rins de bovinos refutados durante abate no frigorí-
fi co localizado em Ilhéus, Bahia, nos meses de agosto, 
setembro, outubro e novembro de 2010. 
As amostras de rins foram escolhidas após 
a inspeção das vísceras pelo médico veterinário re-
sponsável, colocados individualmente em recipientes 
plásticos, devidamente vedados, identifi cados e acondi-
cionadas em isopor com gelo, sendo encaminhadas 
para o Laboratório de Genética Animal do Hospital 
Veterinário da Universidade Estadual de Santa Cruz, 
onde as amostras foram mantidas a - 20°C até o mo-
mento do processamento. 
Extração do DNA genômico
Para a extração de DNA genômico dos rins 
dos bovinos utilizou-se 100 mg do tecido que foram 
mergulhados em nitrogênio líquido e macerados. Em 
seguida foi adicionado 500 µL de tampão de extração 
(10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 200 mM EDTA 200, pH 8,0 
e 10 mg/mL RNAseA¹) e homogeneizado em vórtex. A 
mistura foi incubada a 37ºC por 45 min. Adicionou-se 
25 µL de proteinase K² (120 µg/µL), e 350 µL dode-
cilsulfato de sódio (SDS) 0,5%, homogeneizou-se no 
vórtex, e incubou-se a 50ºC por mais 30 min. O DNA 
foi purifi cado com adição de fenol/clorofórmio/álcool 
isoamílico (25:24:1) nas amostras seguido de centrifu-
gação por 10 min a 16.000 x g. O DNA foi recuperado 
com adição de acetato de amônio 5 M e etanol 100%, 
seguido de centrifugação por 10 min a 12.000 x g e o 
sobrenadante foi descartado. O precipitado foi lavado 
com etanol 85%, e centrifugado por 10 min a 16.000 
x g. A eluição do DNA foi realizada com T.E. (10 mM 
Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA, pH 8,0) e as amostras 
foram estocadas em freezer a -20ºC para posterior 
reação de PCR.
Quantifi cação e PCR
O material foi quantifi cado através de espe-
ctrofotômetro no comprimento de onda de 260 nm e 
padronizado para 50 ng/µL de DNA. A integridade do 
DNA foi avaliada em gel de agarose 1%, com coloração 
de brometo de etídeo (0,5 µg/mL) e visualização em 
transluminador com luz ultravioleta.
Os primers utilizados foram o G1 [direto] 5’-
CTG AAT CGC TGT ATA AAA GT-3’ e G2 [reverso] 
5’-GGA AAA CAA ATG GTC GGA AG-3’ [9]. Estes 
primers amplifi cam várias espécies de Leptospira, 
gerando fragmentos de, aproximadamente, 285 pb 
para Leptospiras patogênicas e não patogênicas exceto 
L. kirschneri. O gene detectado por estes primers é o 
gene 16S rRNA. 
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 Acta Scientiae Veterinariae. 41: 1114.
Para a reação de PCR utilizou-se DNA 
genômico 50 ng/µL; 0,2 µM dos primers G1 e G2; 
1,6 x tampão da Taq; 3,5 mM de MgCl2; 200 µM de 
desoxiribonucleotídeo trifosfatado (dNTP´s) e 2,5 U 
de Taq DNA Polimerase (Gotaq®)³. As condições 
termocíclicas foram: desnaturação a 94°C por 1 min; 
anelamento a 55°C por 2 min e extensão a 72°C por 1 
min, num total de 37 ciclos. Foi utilizado como con-
trole positivo tecido renal de camundongo infectado 
com Leptospira spp.
RESULTADOS
Foram verifi cados 16 (8%) bovinos positivos 
para Leptospira spp. abatidos no matadouro em Ilhéus, 
Bahia (Figura 1). Não foi possível determinar as espé-
cies existentes porque o material não foi sequenciado. 
Notou-se, ainda, a presença de bandas inespecífi cas, o 
que pode ser resultado da amplifi cação de diferentes 
espécies de Leptospiras presente na amostra. 
Durante período de coleta foram condenados 
36% dos rins inspecionados, sendo as principais cau-
sas de rejeição: nefrite, presença de cistos, congestão 
e presença de áreas esbranquiçadas e hemorrágicas.
Figura 1. Gel de agarose a 3% com os produtos da PCR para Leptospira 
spp. M: marcador molecular X174 RF DNA; 1: controle negativo; 2, 3, 4 e 
5: animais negativos; 6: controle positivo; 7: animal positivo para diferentes 
espécies de Leptospira spp.
 DISCUSSÃO
Os rins são um dos órgãos mais condenados 
durante a inspeção do gado abatido, sendo a nefrite 
responsável por 30 a 40% dos casos de rejeição 
[23]. Neste trabalho, as alterações macroscopicas 
identifi cadas nos rins podem estar relacionadas com 
a presença de Leptospira spp. no tecido, sendo o 
correto reconhecimento das lesões e o descarte dos 
órgãos afetados fundamentais para evitar o consumo 
e reduzir, consequentimente, o risco de contaminação 
para o consumidor.
Após as análises moleculares dos fragmentos 
de tecido renal, os amplicons gerados apresentaram 
tamanhos compatíveis com as cepas patogênicas e não-
patogênicas de Leptospira spp. Este achado conduz a 
refl exões sobre os riscos à saúde dos funcionários do 
matadouro, veterinários, bem como aos vaqueiros e 
todos aqueles que podem ter contato com animais posi-
tivos ou que consumirem seus produtos mal preparados.
O diagnóstico da Leptospira através de método 
molecular, tem vantagens em relação às técnicas de 
cultura e sorologicas por ser rápida e permitir a identifi -
cação dos patógenos nos diferentes fases da doença, em 
animais assintomáticos ou mesmo a partir de pequenas 
quantidade de DNA do parasito em sangue, urina e 
fragmento de órgãos. O alvo dos primers utilizados 
neste estudo é uma região do gene 16S rRNA que 
permite a detecção da bactéria na amosta. No entanto, 
apesar deste ser um gene conservado, polimorfi smos 
podem existir entre as diferentes espécies de Leptospira 
[9]. Um trabalho publicado anteriormente revelou 
fragmentos de DNA variando entre 100-1400 pares de 
bases em isolados de L. interrogans, L. borgpetersenii, 
L. weilli e L. mayeri, usando os primers G1 e G2 nas 
reações de PCR [20]. 
O gene 16S rRNA, também, é muito conser-
vado em diversas outras espécies de microorganismos 
[9,18], e o uso deste alvo molecular pode levar a ampli-
fi cação de DNA de bactérias indesejadas que possam 
estar presente no material analisado. Este fator é mais 
frequente em amostras obtidas diretamente dos animais 
a campo ou infectados naturalmente. 
Apesar destas observações os primers G1 e 
G2 têm sido utilizados com sucesso na identifi cação 
de Leptospira spp. em amostras de sangue de suínos e 
de cães naturalmente infectados [17,25,27]. Existem, 
ainda, outros primers com base no gene 16S rRNA 
que também têm sido utilizados com sucesso na 
identifi cação de agentes patogénicos Leptospiras em 
animais [26].
A identifi cação de animais positivos neste 
estudo ressaltam a importância dos bovinos como 
possível fonte de transmissão da doença, principal-
mente para os magarefes e inspetores de carne, bem 
como trabalhadores rurais e suas famílias. Em 2001, 
a prevalência sorológica da leptospirose em bovinos 
no Brasil foi de 35%, com mais de 80% das fazendas 
apresentando casos da doença [6]. Estima-se que 5% a 
10% dos funcionários dos matadouros têm anticorpos 
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 J.M.X. Corrêa, F.S. Carvalho, R.S.A. Carlos & A.A. Wenceslau. 2013. Investigação molecular de Leptospira spp. em rins de bovinos. 
 Acta Scientiae Veterinariae. 41: 1114.
contra sorovares de Leptospiras, indicando os possíveis 
risco de contágio durante sua rotina de trabalho.
Em Pirassununga, São Paulo, os animais foram 
positivos para os sorovares Hardjo, Wolffi e Patoc, e 
os seres humanos positivos para Patoc em um estudo 
da epidemiologia da leptospirose bovina, canina e 
humana. Apesar de ter ocorrido casos de correspondên-
cia entre sorovar isolado em bovinos e em humanos, 
não houve correlação entre a doença nos animais e 
no homem [15]. Na mesma região, no ano de 2001, 
um estudo relatou a possibilidade de transmissão de 
bactérias dos bovinos para os humanos, destacando os 
sorovares Hardjo e Bratislava [10]. 
Em pesquisa realizada com gado de corte e de 
leite e com trabalhadores de matadouros do Estado de 
São Paulo e Minas Gerais verifi cou-se predominância 
dos sorovares Hardjo, Wolff e Canicola em bovinos. Já 
nas amostras de humanos foi identifi cado uma baixa 
prevalência que pode ser justifi cado pela adoção de 
técnicas higienico-sanitárias e de boas práticas de 
manipulação [22].
A presença de bactérias em bovinos também 
já foi confi rmado por análise da urina, sendo isolado 
os sorovares Canicola e Copenhageni em animais do 
Paraná em 2008 [29]. Estes sorovares são altamente 
patogênicos para os seres humanos e representa um 
importante problema de saúde pública [8]. Um outro 
estudo nos Estados Unidos, utilizandoa PCR em 
amostras de urina, revelou que 35% das vacas exami-
nadas eram positivas para Leptospira spp. [2].
Assim, objetivando a prevenção da leptospirose 
em seres humanos é necessário esclarecer e conscien-
tizar sobre o controle de roedores, os cuidados com a 
higienização dos ambientes, o descarte correto do lixo 
gerado, o uso correto de equipamentos de proteção co-
letivo e individual para os trabalhadores de matadouros 
e fazendas além do uso de vacinas para animais. Tam-
bém é importante que os médicos veterinários estejam 
prontos para monitorar e acompanhar as criações e 
estabelecimentos de manipulação e processamento de 
carnes bovina e derivados identifi cando e eliminando 
os casos da doença. O controle da leptospirose é fun-
damental a fi m de evitar problemas de saúde pública, 
doença clínica em bovinos e perdas económicas.
CONCLUSÃO
Foi possível diagnósticar Leptospira nos rins 
de bovinos refutados em matadouro no município de 
Ilhéus, BA, utilizando os primers G1 e G2. A Reação 
em Cadeia da Polimerase é um teste efi caz e rápido 
para diagnóstico específi co das bactérias presente no 
tecido renal de bovinos e pode ser adotado como fer-
ramenta para monitoramento e deteção precoce desses 
patógenos.
SOURCES AND MANUFACTURERS
¹RNAse A 10 mg/mL, Ludwig Biotecnologia LTDA, Alvorada, RS, 
Brazil.
²Proteinase K 100 mg, Ludwig Biotecnologia LTDA, Alvorada, RS, 
Brazil.
³Promega Corporation. Madison, WI, USA.
Acknowledgements. À FAPESB pela concessão da bolsa de 
iniciação científi ca; à UESC pelo suporte técnico; ao Sr. Crisos-
tomo Meira Souto proprietário do abatedouro; e ao responsável 
técnico MV Valdir Cleber Santos Rego.
Declaration of interest. The authors report no confl icts of 
interest. The authors alone are responsible for the content and 
writing of the paper.
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