Exercicios 10 Gabarito

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QBQ1354 – Biologia Molecular 16/05/24 
Exercícios 10 – Gabarito 
PCR e suas aplicações 
1. Justifique as afirmações: 
(a) Para aplicar a técnica da PCR é necessário ter conhecimento prévio da sequência 
nucleotídica do “alvo” que se deseja amplificar. 
É necessário o conhecimento prévio da sequência que se deseja amplificar para poder 
desenhar os dois primers que serão utilizados para amplificar a sequência alvo. 
(b) Para executar a PCR é necessário utilizar dois iniciadores (primers). 
São necessários dois iniciadores uma vez que cada iniciador deve parear com a 
extremidade 3’ de cada fita de DNA do “alvo”. Isso delimita a região do “alvo” a 
ser amplificado. 
(c) Nas reações de PCR utiliza-se a enzima Taq DNA polimerase. 
A Taq DNA polimerase é uma enzima termoestável, que resiste a altas temperaturas. 
Esta característica permite que a enzima não desnature nas etapas dos ciclos da 
PCR. 
 
2. Um pesquisador deseja amplificar o “alvo” mostrado no esquema A abaixo. Para isso, 
deve desenhar dois iniciadores. No esquema B indique a posição dos iniciadores 
“forward” e “reverse”. 
Escreva a sequência de 6 nucleotídeos dos iniciadores “forward” e “reverse” que o 
pesquisador deve mandar sintetizar. 
 
Forward: 5’ TACGGA 3’ 
Reverse: 5’ AGTCCA 3’ 
 
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3. Em toda a PCR deve ser incluído um controle negativo e um controle positivo. 
Justifique a necessidade de cada controle e especifique quais componentes devem 
estar presentes em cada amostra. 
CONTROLE NEGATIVO. 
Componentes: Dois iniciadores, Taq DNA polimerase, 4dNTPs, Tampão+Mg2+ 
A amostra NÃO contém DNA. 
Esse controle serve para garantir que a amplificação observada nas amostras 
problema seja real/verídica. 
A amplificação de DNA no controle negativo indica que os reagentes estão 
contaminados. 
 
CONTROLE POSITIVO. 
Componentes: Dois iniciadores, Taq DNA polimerase, 4dNTPs, Tampão+Mg2+, amostra 
com DNA “análogo” àquele que se está estudando (DNA “controle”, que pode ser 
comprado). 
Esse controle serve para garantir que a PCR está funcionando. 
 
4. A Transcriptase reversa (RT, do inglês, Reverse Transcriptase) é também conhecida 
como DNA polimerase RNA-dependente. A enzima está presente apenas em algumas 
classes de vírus de RNA fita simples. 
(a) Descreva ou esquematize a reação catalisada pela Transcriptase reversa viral; 
Dois tipos de respostas a serem aceitas 
RNA + dNTPs + iniciador de DNA  cDNA (fita simples) + PPi 
cDNA (fita simples) + dNTPs  cDNA (fita dupla) + PPi 
 OU 
RNA + dNTPs  cDNA (fita simples) + dNTPs  cDNA (fita dupla) 
 
(b) Justifique por que a descoberta do mecanismo de ação desta enzima modificou o 
Dogma da Biologia Molecular. 
No Dogma da Biologia Molecular o fluxo de informação gênica é unidirecional, indo do 
DNA para o RNA (transcrição). A elucidação do mecanismo de ação da Transcriptase 
reversa mostrou que é possível converter RNA em DNA complementar (dupla fita). 
 
5. Justifique por que no teste molecular para o diagnóstico da Covid 19 por RT-PCR é 
necessário incluir uma etapa em que se utiliza Transcriptase Reversa. 
O vírus SARS-CoV-2 é um vírus de RNA fita simples. A PCR é uma técnica que só 
amplifica DNA. Portanto, para realizar o teste molecular acima, deve-se primeiro 
converter o RNA viral em cDNA dupla fita, usando uma transcriptase reversa. Em 
seguida, o cDNA pode ser amplificado por PCR e quantificado. 
 
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6. Em geral, vírus de RNA apresentam altas taxas de mutação quando comparado 
com os vírus de DNA. Levante uma hipótese para justificar esta afirmação. 
A depender do tipo de vírus de RNA sua replicação é feita por DNA polimerases RNA-
dependentes (Transcriptase reversa) ou por RNA polimerases RNA-dependentes (RNA 
replicase). Estas enzimas apresentam altas taxas de erro (1 erro a cada 104 
nucleotídeos adicionados) e não têm capacidade de correção (proofreading) – disto 
resultam altas taxas de mutações. 
A taxa de erro das DNA polimerases DNA-dependentes é muito menor (1 erro a cada 
109 a 1010 nucleotídeos) e a capacidade de correção é elevada. Daí as taxas de 
mutação serem bem menores.