BIOLOGIA MOLECULAR: síntese proteica e regulação, LAC operon, técnicas de biologia molecular

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RESUMO BIOLOGIA MOLECULAR II
AULAS 1 E 2: TRADUÇÃO
- Ligações peptídicas; 
- Tradução (RNAm une os aminoácidos na cadeia polipeptídica). 
- Polissomo = grupo de ribossomos ligados ao mRNA/ mRNA associada a vários ribossomos. 
- Colinearidade entre a sequência de nucleotídeos presente no mRNA e a sequência de aminoácidos da proteína que seria produzida.
- 64 possíveis códons: 61 AA individuais e 3 são de terminação; Ele é lido em triplets (sequência de 3 nucleotídeos – códon). 
- Código genético é DEGENERADO – apresenta mais de um códon determinando o mesmo aminoácido. 
- Procarionte: Região promotora, RBS (sítio ligador do ribossomo), ATG (códon de iniciação), CDS ou ORF (sequência codificadora – open reading frame), Stop (códon de finalização) e região terminadora. 
- Eucarionte: Sinais (S) entre o promotor e o códon de iniciação – que controla o RNAm. ORF dividida em exons (regiões codificantes) e introns (não codificantes). Tem um segmento antes do códon de iniciação (AUG), que não será traduzido = 5’-UTR. A 5’-UTR contém o RBS (sítio ligador de ribossomo), sem ele nenhuma síntese de proteínas é possível. Após o códon de terminação da tradução, há um trecho de mRNA não traduzido, designado região 3'-UTR.
 
Enzimas importantes: 
- Aminoacil sintetases ---- ligação do aminoácido ao tRNA. (catalizado pela aminoacil-tRNA sintetase específica). Essa ligação é altamente energética. Das funções dessa ligação: pareamento códon-anticódon e ativação do AA para poder reagir na sequência e formar uma ligação peptídica. SÃO ESPECÍFICAS. Ela é importante também porque os AA sozinhos não reconhecem os códons do RNAm. 
RNAs:
- mRNA = tem a informação genética transcrita do DNA sob a forma de códons; cada um especificando um AA determinado. Os AAs por si só não podem reconhecer os códons no mRNA. 
- tRNA = chave para decifrar os códons do mRNA. Ligam-se ao AA e o transportam para a extremidade de crescimento da cadeia. Precisam interagir com ribossomos, RNAm e fatores de alongamento. O RNAt é transcrito por um gene do DNA e processado. A ponta 5’ fosforilada // alça do anticódon tem 7 bases nitrogenadas // ponta 3’ tem a sequência de bases CCA. Função da ligação do AA à ponta 3’ do tRNA: ativação do AA e permite com que cada AA seja inserido em uma cadeia crescente de proteína de acordo com o que está determinado pelo mRNA (funcionam como adaptadores). 
- rRNA = se associa a proteínas para formar os ribossomos.
Ribossomos:
- Aparato catalítico que guia a síntese correta de proteínas; ele é feto por cerca de 50 proteínas e moléculas de RNAr. 
- Unidade de medida dos ribossomos: Svedberg (S)
- Procariotos: ribossomos 70S (unidades 30S e 50S)
- Eucariotos: ribossomos 80S (unidades 40S e 60S)
- Mitocôndrias e cloroplastos tem ribossomos 70S
Montagem dos ribossomos: Direção 5’ 3’: proteínas progressivamente maiores. Ribossomos mais próximos da extremidade 3’ estão mais próximos do fim da síntese do polipeptídio. Ribossomos tem 4 sítios de ligação: A, P E e um para o mRNA. A última molécula a se juntar ao complexo de iniciação é a subunidade maior do ribossomo. Subunidade menor encontra o AUG e se liga na subunidade maior e deve se ligar na aminoacil-tRNA. tRNA inciador carrega sempre uma Metionina. 
- Procariontes: fMet
- Eucariontes: Met
- Procariontes: uma molécula de mRNA tem muitas sequências AUG, cada uma codificando uma metionina. Apenas uma será reconhecida pelo tRNA iniciador, servindo como códon de iniciação. Procariontes possuem a Ribosome Binding Site, ou Shine-Dalgarno: sinaliza o início da síntese proteica. Ali o ribossomo vai se ligar. Procariontes possuem RNAs Policistrônicos (codificam muitas proteínas a partir de uma molécula de mRNA). A tradução se inicia em uma sequência especial de bases (como a de shine-dalgarno). 
- Eucariontes: mRNA recém sintetizado é empacotado, sai do núcleo, vai pro citoplasma e é desempacotado. O códon AUG mais próximo da extremidade 5’ é selecionado para funcionar como sítio de iniciação. Eucariontes possuem RNAs monocistrônicos. O complexo de iniciação se forma na extremidade 5’ do mRNA até alcançar um códon AUG, onde vai começar a tradução. A tradução se inicia no códon AUG mais próximo da extremidade 5’ do mRNA. Os mRNA dos eucariontes tem a cauda Poli-A, que possui apenas Adeninas – proteção.
Alongamento da cadeia peptídica:
- Aminoacil-tRNA se liga ao ribossomo no sítio A (só ocorre se ele estiver associado ao fator de alongamento EF-Tu carregando uma molécula de GTP, que precisa para a ligação do aminoacil-tRNA) desocupado e essa molécula é levada para o ponto A por uma proteína chamada fator de alongamento (EF). Os códons devem se parear com os anticódons (no centro decodificador). A extremidade do tRNA na cadeia polipeptídica se liga ao sítio P por ligação peptídica catalisada pela enzima peptil transferase. O novo peptidil-tRNA do sítio A é translocado para o sítio P com gasto de GTP. 
- Terminação: códons de terminação = UAA, UAG e UGA (obs: códon de iniciação é AUG). 
- Peptidil transferase – alteração = adição de uma molécula de água ao invés de um AA. 
- O ribossomo libera o RNAm e se dissocia nas 2 subunidades. 
Inibidores de síntese proteica:
- Estreptomicina = inibe a iniciação 
- Tetraciclina = bloqueia o sítio A 
- Clorafenicol = inibe a peptidil-transferase procariótica 
- Clindamicina e Eritromicina = inibe o deslocamento (em bactérias). 
- Proteínas Chaperonas, proteínas de estresse, proteínas de choque térmico... – ajudam a moldar a cadeia de AA que sai do ribossomo. 
Modificações pós traducionais: eventos que mudam as propriedades das proteínas: fosforilação, acetilação, alquilação, ...
AULAS 3 E 4: GENOMAS E CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA
- Genoma procariótico = cromossomo único circular (exemplo da E.Coli), mas há exceções lineares. 
- Unidades organizacionais de genomas procarióticos = Motivos (sequencias curtas de genes), Repetições (unidades um pouco menos curtas que os motivos) e domínios são regiões extensas. 
- Operon = unidade funcional do genoma procariótico. 
- Maior gene humano = Distrofina.
- Paradoxo valor C = impossibilidade de relacionar tamanho do genoma ≠ complexidade das características. 
- Número de proteínas > número de genes. Múltiplas cópias de RNA a partir de um único conjunto de genes.
- Pseudogenes = sequências que se assemelham muito a genes conhecidos mas que não produzem uma proteína funcional. (45%)
- DNA Satélite (sequências repetidas simples): sequências curtas repetidas milhões de vezes. 
VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats):
- Polimorfismos genéticos – variabilidade no número de cópias de cada unidade de repetição. 
- Minissatélites – identificação individual, testes de paternidade, mapeamento genético. 
- Elementos transponíveis/ elementos genéticos móveis = sequências de DNA capazes de se integrarem (transposição – alterações genéticas) no genoma. Formam os Transposons DNA e os Retrotransposons. 
- Transposons: codificam proteínas que movem o DNA diretamente para uma nova posição ou replicam o DNA e integram o DNA replicado em outro lugar (procariotos e eucariotos).
- Retrotransposons: codificam a transcriptase reversa e fazem cópias de DNA a partir dos RNAs transcritos.
- Causam evolução dos genomas – inserção em genes, inserção em sequências regulatórias (modificam a expressão genética), produção de mutações cromossômicas...
Fatores que determinam a quantidade de cada proteína: concentração de mRNA, eficiência da tradução do mRNA, estabilidade da proteína extraída. 
- Genes constitutivos (são constantemente expressos) X Genes induzíveis (expressão varia de acordo com as condições da célula)
CONTROLE
- Controle Transcricional: Controle negativo (uma proteína reguladora atua como Repressor se ligando ao DNA e inibindo a transcrição) X controle positivo (uma proteína reguladora atua como Ativador, estimulando a transcrição). 
- Ambos podem ser subdivididos com respeito à presença de um sinal (realizado por uma molécula sinalizadora), realizando indução ou repressão.
- Controle negativocom indução: A ligação de um repressor ao sítio operador é regulada por um sinalizador. Essa mudança faz com que um repressor unido ao DNA se desligue dele e desta forma inicie a transcrição. 
 - Óperon. Composição = RNA polimerase; sítio promotor (seção de DNA onde a RNA polimerase se liga); sítio operador onde um sítio repressor pode se ligar, bloqueando a RNA polimerase. São um conjunto de genes compostos por um promotor, um operador e os genes estruturais.
LAC Operon (VEM DA LACTOSE E É DA E.COLI) – controle negativo: 
- Sítio promotor; sítio operador (onde o opressor se liga para impedir a DNA polimerase); 3 genes que servem pra quebrar lactose. 
- Tem um gene chamado Lac I – da lactose - (que também tem uma região promotora) e vai produzir o sítio repressor (que vai se ligar ao sítio operador). Age quando a lactose não está presente.
- Quando tem lactose, ela vai se ligar aos sítios repressores, impedindo com que eles se liguem ao sitio operador, então a RNA polimerase funcionará normalmente e as enzimas que quebram a lactose. A LACTOSE SE LIGA AO REPRESSOR!!!
LAC Operon – controle positivo: 
- Caso E. coli seja cultivada em um meio contendo tanto glicose como lactose, o operon lac não é induzido e a glicose é preferencialmente usada. Portanto, a presença de glicose impede que o operon lac seja transcrito em níveis altos, mesmo na presença de lactose. E. coli não irá utilizar lactose (ou outro açúcar complexo) enquanto a glicose estiver presente no meio. Quando a glicose está disponível, genes que participam no metabolismo de outros açúcares são reprimidos, num fenômeno chamado REPRESSÃO CATABÓLICA. Assim, o operon Lac tem um nível adicional de controle (controle positivo) que faz com que o operon não seja eficientemente transcrito na presença de glicose, mesmo se a lactose também estiver presente. A indução do operon lac requer tanto a presença da lactose (o indutor) para inativar o repressor quanto a ausência de glicose para aumentar o controle positivo.
- Controle negativo com repressão: A molécula sinalizadora pode se unir ao repressor inativo e este complexo liga-se ao DNA bloqueando a ação da RNA polimerase. NÃO TEM TRANSCRIÇÃO. 
- Controle negativo por repressão – trp óperon: O óperon só é transcrito se o AA estiver ausente. A célula regula a quantidade do AA produzida evitando a transcrição do RNA do óperon trp quando há triptofano suficiente. Transcrição controlada por uma proteína repressora inativa chamada aporrepressor. O triptofano se liga a ela para formar um complexo repressor ativo que se liga ao operador trp e impede a ligação da RNA polIMERASE. A expressão do operon trp é inibida pela proteína repressora trpR. A trpR só inibe o operador em associação com o correpressor (triptofano).
- Controle positivo com repressão: A proteína ativadora se liga ao DNA e ativa a transcrição; ela somente dissocia-se do DNA quando se ligar a uma molécula sinal (co-repressor) (o co-repreor torna o Ativador inativo).
EUCARIONTES = ausência de óperons. 
Fenômeno epigenético: não envolve mudanças na sequência de DNA e que pode persistir por uma ou mais gerações. Herdam genes e informações que determinam quando os genes serão ativados e em qual tecido. As células podem ter características diferentes mas com o mesmo DNA. 
Mecanismos de regulação: metilação do DNA – interrompe a transcrição; modificação das histonas (metilação e acetilação); Regiões metiladas do DNA são inacessíveis à transcrição. 
- A remodelagem da cromatina é um importante mecanismo epigenético na regulação da transcrição gênica. Fosforilação melhora o desenvolvimento da memória. 
- Acetilação de histonas (transcrição de heterocromatina) e metilação das histonas (repressão trancricional). 
- Fosforilação = Modificação pós-tradução. Um grupo fosfato é ligado à proteína. O efeito da fosforilação varia de proteína para proteína: algumas são ativadas pela fosforilação, outras são desativadas e ainda, outras mudam totalmente de comportamento (interagindo com um parceiro diferente ou indo para uma parte diferente da célula).
- Ubiquitinação = As proteínas podem ser marcadas para degradação pela adição de um marcador químico chamado ubiquitina. Proteínas marcadas (com a ubiquitina) são levadas ao proteassoma, ou "centro de reciclagem" da célula e quebradas em componentes menores. A ubiquitinação é uma via importante de controle da permanência da proteína na célula.
***Não há colinearidade entre genes e proteínas. 
AULA 5: TÉCNICAS DE BIOMOL E SUAS APLICAÇÕES NA SAÚDE
- Extração de ácidos nucleicos (lise celular, desnaturação proteica, precipitação do DNA, purificação e ressuspensão do DNA). 
Principais enzimas: 
- Enzimas de restrição = Endonucleases de restrição. Proteínas que reconhecem uma sequência de bases específica na dupla hélice do DNA e clivam ambas as fitas pela hidrólise da ligação fosfodiéster. Usa-se no isolamento de genes, criação de novas moléculas de DNA, ...
- DNA ligase = catalisa a formação da ligação fosfodiéster entre duas moléculas fita simples de DNA. Uso: clonagem de segmento de DNA alvo.
- DNA polimerase = DNA-polimerase I: polimeriza e degrada DNA (atividade exonucleases); DNA-polimerases termoestáveis: uso em PCR (temperaturas acima de 90ºC); Transcriptase Reversa: é RNA dependente; envolvida na replicação de vários tipos de vírus RNA; fazem uma transcrição reversa ao utilizar RNA como molde para sintetizar uma fita de DNA complementar (cDNA). Uso – construção de bibliotecas de cDNA a partir de populações específicas de mRNA.
Clonagem molecular = construção de moléculas de DNA recombinante; 
- Objetivo: isolamento e propagação de moléculas idênticas ao DNA de interesse.
- Células hospedeiras (multiplicam formando colônias) ...Inserto de DNA + vetor...
- Possíveis vetores: plasmídeos, bacteriófagos, etc. eles precisam ter capacidade de replicação autônoma e serem pequenos.
- Plasmídeos: o que são? São moléculas de DNA circular dupla fita extracromossômicas. Estão presentes em bactérias e leveduras.
- Plasmídeos da série pUC: possuem gene que codifica resistência à ampicilina, uma origem de replicação de DNA plasmidial e o gene lacZ
Clonagem molecular = introdução de moléculas de DNA recombinante em células bacterianas. Usos: regulação gênica, fenótipo, superexpressão de um gene de interesse para obtenção de produto alvo. 
- Mecanismos mais conhecidos = transformação bacteriana (por choque térmico e eletroporação; transformar célula hospedeira apta para receber DNA recombinante) e transfecção com DNA de fagos. 
Estratégias para clonagem de genes de interesse: 
- Um organismo transgênico contém DNA sintético ou de outro organismo além do seu próprio material genético.
- Um fragmento de DNA contendo o gene a ser clonado é inserido em um elemento genético auto-replicante (geralmente vírus ou plasmídeo) chamado vetor, de modo a produzir uma "molécula de DNA recombinante”.
1. O vetor funciona como um veículo que transporta o gene para o interior da célula hospedeira. 
2. Dentro da célula hospedeira o vetor multiplica-se, produzindo numerosas cópias idênticas não só de si próprio, mas também do gene que transporta.
3. Quando a célula hospedeira se divide, a sua descendência recebe cópias das moléculas de DNA recombinante, continuando depois a replicação dos vetores.
4. Após múltiplas divisões celulares, é produzida uma colônia (clone) de células hospedeiras idênticas. Cada célula contém uma ou mais cópias da molécula de DNA recombinante. O gene transportado pela molécula recombinante é agora conhecido como sendo clonado.
AULA 6: TÉCNICAS DE BIOMOL E SUAS APLICAÇÕES NA SAÚDE
- Expressão de sequências clonadas: produzir proteínas alvo em grande quantidade. 
Reação em cadeia da Polimerase: protocolo de PCR. 
- Multiplex PCR: uso de mais de um par de primers em um mesmo tubo de reação, amplificando vários segmentos de DNA de uma única vez. Investigação de paternidade. 
- Nested PCR: uso de 2 pares de primers para amplificar um mesmo fragmento. 2 etapas/rounds - usado para reduzir contaminações. Nofinal das 2 etapas, obtém-se um produto menor que o da primeira amplificação. Ganho em especificidade e eficiência. 
- RT-PCR: primeiro é necessário fazer a transcrição reversa do RNA em cDNA (DNA complementar) (RT: Reverse Transcriptase), para então prosseguir-se normalmente com o PCR. A RT é o passo mais complicado na RT-PCR. 
- RAPD: (Random Amplified Polymorphic DNA) - Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso. Possibilita a utilização da técnica em organismos onde nenhum conhecimento de sequência de DNA. Utilização de apenas um primer na reação de PCR. Esta variação possibilita que ocorra amplificação ao acaso de segmentos de DNA no genoma.
- RFLPs: (Restriction Fragment Length Polymorphisms) (polimorfismos de tamanho de fragmentos de restrição). Digestão de DNA com endonucleases de restrição, e posterior separação dos fragmentos obtidos (eletroforese gel de agarose), originando padrões de restrição (PR). É um método de tipagem de DNA, para avaliar a relação entre estirpes (troncos familiares). 
- Syber Green: aumenta a fluorescência quando ligado ao DNA dupla fita. Durante fase de extensão, SYBR se liga ao produto da PCR. A cada ciclo, mais sinal fluorescente é detectado
-Desvantagem: ligação não-específica
-Vantagem: baixo custo
- Curva de normalização: Para se evitar variação entre as amostras, amplifica-se simultaneamente ao gene de interesse um gene normalizador/ constitutivo. O gene normalizador ou constitutivo é um gene expresso em níveis constantes entre os diferentes tecidos de um organismo, em todos os estágios do desenvolvimento não sofrendo alteração pelos tratamentos experimentais.
AULA 7:
Southern Blot (método) = verificar se uma determinada sequência de DNA está ou não presente em uma amostra de DNA a ser analisada. Requer que o DNA do organismo em estudo seja fragmentado em pedaços (ex: enzimas de restrição) que possam migrar na eletroforese.
- Procedimentos da Southern Blot:
Desnaturação: desnaturação da dupla fita do DNA, gerando simples fitas. A desnaturação é necessária porque o DNA nas etapas seguintes irá aderir à membrana e parear com a sonda. 
Transferência DNA para membrana: Uma membrana de nitrocellulose (ou nylon) é posta sobre o gel. É aplicada uma pressão uniforme sobre a membrana, fazendo com que o DNA passe do gel para a membrana, onde ele se adere. A membrana é então aquecida (nitrocelulose) ou exposta a radiação UV (nylon) para permanentemente ligar o DNA à membrana. 
Tratamento com a sonda: A membrana é tratada com uma sonda hibridizadora (molécula de DNA isolada cuja sequência é conhecida e complementar àquela sequência a qual se quer determinar a presença ou não na amostra). A sonda de DNA é marcada e irá parear com qualquer sequência de DNA complementar a ela. 
- Utilizações da Southern Blot:
Detectar deleções e rearranjos de genes, além de identificar genes estruturalmente relacionados na mesma espécie ou genes homólogos em outras. 
Northern Blot: 
- Verifica se um determinado gene de um genoma é ou não transcrito em RNA e quantifica este procedimento. Estuda o perfil de expressão de mRNA - onde, quando e quanto de determinado mRNA está presente numa dada amostra. É uma das formas mais simples de determinar em que altura certos genes estão a ser expressos em sistemas vivos.
- Utilizações da Northern Blot: determinar quantos de mRNA, um mRNA específico; checar se temos toda a sequência de um cDNA clonado, quando comparamos com o tamanho do mRNA; checar quais tecidos ou tipos de células expressam determinado gene.
- Procedimentos da Northern Blot: Uma amostra de RNA é desnaturada, assegurando que todas as moléculas de RNA tenham uma conformação linear. Neste processo, o RNA é separado por eletroforese, transferido para uma membrana carregada +, que é incubada com sonda de DNA radioativo (detectado de forma similar ao DNA no Southern blot).
Western Blot:
- Detecção de proteínas em um homogenato. Usados anticorpos específicos à proteína. Como resultado, pode-se examinar a quantidade de proteína em uma dada amostra e comparar os níveis entre diversos grupos.
- ELETROFORESE EM GEL: As proteínas da amostra são separadas de acordo com o MW.
- Transferência: A fim de fazer as proteínas acessíveis à detecção do anticorpo, elas são movidas do gel para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF.
- Bloqueio: Deve-se impedir interações não específicas entre a membrana e o anticorpo usado para a detecção da proteína alvo, colocando-se a membrana em uma solução diluída de uma proteína – leite seco desnatado (ou BSA), com uma pequena quantidade de detergente (ex: Tween 20).
- Detecção: Anticorpo primário - Uma parte da resposta imune é colhida e usada como ferramenta de detecção específica e sensível que se liga à proteína diretamente. Depois de bloqueada a membrana, uma solução diluída do anticorpo primário é incubada com a membrana. Anticorpo secundário - Depois de enxaguar a membrana para remover o anticorpo primário não ligado, ela é exposta ao anticorpo secundário. Ele geralmente é ligado a biotina ou a uma enzima reveladora (ex: fosfatase alcalina). Anticorpos secundários se ligarão a um anticorpo primário, providenciando um sinal intensificado. Uma peroxidase é usada em conjunção com um agente quimioluminescente, e a reação produz fluorescência proporcionalmente à quantidade de proteína.
- Quimioluminescência: Depende da incubação do Western blot com um substrato que fluoresce quando exposto à enzima reveladora no anticorpo secundário. A luz é então detectada por um filme fotográfico ou por câmeras que capturam uma imagem digital do Western blot. A imagem é analisada por densitometria, que avalia a quantidade de proteína colorida e quantifica os resultados em termos de intensidade óptica.
Análise proteômica:
- Permite que pesquisadores possam identificar as proteínas que foram afetadas em fenômenos biológicos envolvendo diferenças na expressão de proteínas, como o efeito de fármacos. 
Identificação das proteínas: 	
- As proteínas são recortadas do gel e fragmentadas por digestão tríptica e os fragmentos analisados no espectrômetro de massa. A identificação da proteína é muito facilitada se sua sequência completa for conhecida e já estiver depositada em bancos de dados de sequências (já existem + de um milhão de sequências depositadas), os quais podem ser acessados online.
Análise de transcriptomas em larga-escala: