Microbiologia Clínica I

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Microbiologia Clínica I
Resumão
Características gerais de bactérias G+: Possuem peptideoglicano na parede celular! Visualizando as estruturas da bactéria G+ a partir do citoplasma é possível observar a membrana plasmática, o espaço periplasmático, e finalmente o peptideoglicano (possui ácido lipotecóico – chega até a membrana plasmática - e o ácido tecóico – presente apenas no peptideoglicano). 
Ex: Mycobacterium tuberculosis – possui ácidos micólicos, o que o caracteriza como BAAR (bacilo álcool ácido resistente). Bactérias G+ quando submetidas a coloração de Gram coram-se de azul pois estas bactérias “seguram” o cristal violeta em seu interior.
Colônias de G+ geralmente exalam odor semelhante a queijo.
Características gerais de bactérias G -: visualizando as estruturas da bactéria G- a partir do citoplasma é possível observar a membrana plasmática, o espaço periplasmático contendo delgado peptideoglicano (não tem ácido lipotecóico ou ácido tecóico), a membrana externa (delimita o espaço periplasmático), contém LPS na camada externa da membrana externa.
As colônias de G – são mais “gosmentas” e úmidas, pois o LPS é constituído por lipídeos e carboidratos, apresentando odor próximo a uréia, facilitando assim a identificação da bactéria.
Ao ser submetido ao Gram coram-se de rosa devido a delgada camada de peptideoglicano que permite a saída do cristal violeta, sendo corado posteriormente pela fucsina.
Exceções: 
Proteus, embora o nome seja masculino ele é G- (possui véu);
Listeria, embora o nome seja feminino ela é G+.
Dica: Coloração de Gram
Nome masculino coloração azul (sendo assim G+)
Nome feminino coloração rosa (sendo assim G-)
Comparação das paredes celulares de bactérias Gram positivas e Gram negativas. A, uma bactéria Gram positiva tem uma camada de peptideoglicano espessa que contém ácido tecóico e ácidos lipotecóicos. B, uma bactéria Gram negativa tem uma camada fina de peptideoglicano e uma membrana externa que contém lipopolissacarídeo, fosfolipídeos e proteínas. O espaço periplasmático entre as membranas citoplasmática e externa contém proteínas de transporte, degradativas e de síntese de parede celular. A membrana externa é acoplada à membrana citoplasmática em pontos de adesão e é presa ao peptideoglicano por lipoproteínas de ligação.
Parede de BAAR: visualizando as estruturas de bactérias BAAR a partir do citoplasma é possível observar a membrana plasmática, o peptideoglicano (não tem ácido lipotecóico ou ácido tecóico), camada de carboidratos: ácido arabinogalactano, ácidos micólicos (ácidos graxos de cadeia longa) contendo lipoarabinomanana (importante fator de virulência). 
Os BAARs não coram por Gram pois são hidrofóbicos. Na coloração de Ziehl Nelseen há o aquecimento da amostra afim de degradar os lipídeos permitindo assim a entrada do corante no interior da célula bacteriana. 
 As principais bactérias de importância clínica são:
Cocos G+, Bacilos G-, Bacilos G+ e Cocos G-
Geralmente são contaminantes de amostras.
São os principais causadores de doenças bacterianas.
 Embora Bacilos G+ e Cocos G- geralmente contaminem amostras, não podemos esquecer que algumas bactérias destas classes podem acarretar sérias doenças bacterianas em humanos por exemplo, a Listeria monocytogenes é um bacilo G+ que pode causar listeriose, e bactérias do gênero Neisseria spp são cocos G- que pode acarretar meningite entre outras doenças.
	Quero isolar a bactéria de uma amostra, como faço?
 I. isolar o material em meio (rico de cultura, o meio rico é utilizado a fim de promover o crescimento de colônias).
Se a amostra for URINA deve-se pingar a urina em um caldo e incubar, se o caldo ficar turvo há bactérias na amostra. Após isso é importante semear o caldo em um meio de cultura. (Caso o caldo turve, mas não cresça bactérias na placa pode haver interferência do O2, caso as bactérias cresçam na placa, mas não no caldo pode haver interferência do meio).
Meios de cultura:
	Ágar sangue de carneiro é o mais comum em laboratórios de microbiologia, permite o crescimento de G+ e G-, permite também a visualização da atividade hemolítica de algumas bactérias.Lembrar que o meio é rosa e a bactéria que cresce nele também (G- coram-se de rosa quando submetidas ao Gram). 
	Ágar McConkey utilizado para isolar G-. 
	Ao comparar o crescimento entre as placas com meios de Ágar sangue e o McConkey é necessário realizar a coloração da amostra a fim de confirmar se a bactéria da placa é realmente G- ou G+.
	Se há leucócitos e/ou nitrito (geralmente G- convertem nitrato em nitrito) na urina há grande possibilidade de haver bactérias na amostra (verificar exames bioquímicos Urina I).
Quanto a necessidade de O2: As bactérias podem ser aeróbias (necessitam de O2), anaeróbias (não necessitam de O2), anaeróbias facultativas (sobrevivem na presença ou ausência de O2) ou microaerófilo (suportam poucas concentrações de O2).
Quanto a temperatura ideal: Bactérias que têm como temperatura ideal medidas entre 0° e 18°C são consideradas PSICRÓFILAS, 25° e 40°C são consideradas MESÓFILAS, e entre 50° e 80°C são consideradas TERMÓFILAS.
	O Ph deve ser neutro ou em torno de 7,0, porém há bactérias ACIDÓFILAS e BASÓFILAS.
COCOS GRAM POSITIVOS I
	Quem são os cocos G+?As diferenças entre estes gêneros estão no tamanho das células e no arranjo.
Staphylococcus sp. Cachinhos de uva = Staphylo
Enterococcus sp. Geralmente se organizam em diplo cocos 
Streptococcus sp. Fileirinha de cocos = Strepto
IMPORTANTE: cocos G+ estão presentes em nossa microbiota! Portanto, o isolamento deve ser correlacionado com o quadro clínico do paciente! A quantidade de bactérias detectada é de extrema importância para o diagnóstico.
	Staphylococcus sp, Enterococcus sp e Streptococcus sp podem ser diferenciados através da enzima catalase (é um fator de virulência que decompõe o H2O2 em H2O e O2, pois o peróxido de hidrogênio é altamente tóxico para a célula bacteriana).
	A catalase é uma forma da bactéria se proteger dos macrófagos e neutrófilos (estas células liberam H2O2 na bactéria e ela libera a catalase para degradar o H2O2).
	Bactérias do gênero Staphylococcus sp possuem a enzima catalase, ou seja, ao adicionarmos água oxigenada na colônia há o borbulhamento da mesma, portanto, o teste da catalase é útil para identificar o GÊNERO do coco G+.
 	Na identificação da bactéria é de extrema importância a observação da colônia: Staphylococcus sp apresentam colônia seca, o S. aureus tem colônia amarelada, podendo se apresentar com coloração acinzentada com “bolinhas” bem definidas. Colônias de Enterococcus sp apresentam colônias finas e transparentes. Streptococcus sp costumam apresentar colônias mais gosmentas e com sombras (por serem hemolíticas).
Bactérias hemolíticas: Provocam lise nas hemácias do Ágar sangue, deixando sombras na placa. Staphylococcus sp (FAZ HEMÓLISE OU NÃO), Streptococcus sp (SEMPRE FAZ HEMÓLISE). A hemolisina (exotoxina do grupo 2) é o fator de virulência responsável pela hemólise de eritrócitos, sendo presente SEMPRE nos Streptococcus sp.
Em caso de 2 placas com bactérias hemolíticas o teste da catalase determina que é Staphylococcus sp e quem é Streptococcus sp (para Staphylococcus sp a catalase é +).
STAPHYLOCOCCUS
16 espécies encontradas em humanos,
19 espécies encontradas em outros animais.
	Podem causar infecções locais (multiplicação pontual) ou sistêmicas, a multiplicação pode ocorrer em uma área localizada e exercer seus efeitos patogênicos pela produção de exotoxinas ou enzimas que atuam em locais distantes.
	É o gênero das bactérias patogênicas mais importantes, pois possuem todos os fatores de virulência, entre estes a coagulase/fator clumping, proteína A (se liga a região Fc do anticorpo impedindo a opsonização, pois os macrófagos têm receptores para a região Fc do anticorpo e não a região FAB) etc.
	A infecção pode se disseminar:Via hematogênica
Foco de infecçãooutros órgãos e tecidos.
 Endocardite bacteriana aguda (destruição rápida das válvulas cardíacas)Complicações
Pericardite
Os cocos G+ possuem em média um micrômetro de diâmetro, são fortemente corados pelo cristal violeta (coram-se fortemente de azul), possuem arranjo em forma de cachinhos de uva (staphylo), são aeróbios ou anaeróbios facultativos, e possuem a enzima catalase (fazem borbuuulhaas de amor à luz da luaaaaa).A confirmação com Gram é importante para o futuro tratamento com antibióticos,
	Staphylococcus aureus
	É anaeróbio facultativo, é imóvel (não possui flagelo), não forma endósporo (SÓ BACILO G+ FORMA ENDÓSPORO), possui a enzima catalase (fazem borbuuulhaas de amor à luz da luaaaaa).
 	O Staphylococcus aureus pode provocar infecções superficiais (abcessos cutâneos, infecções de feridas etc.), infecções profundas ou sistêmicas (osteomielite, miosite, pneumonia bacteriana e septicemia) e quadros tóxicos (síndrome do choque tóxico, síndrome da pele escaldada ou doença de Ritter, impetigo bolhoso e intoxicação alimentar). Infecções por Staphylococcus aureus geralmente são piogênicas (com presença de pus).
Toxinas: Substância de origem microbiana capaz de causar danos ao organismo animal.
	Toxigenicidade capacidade de produzir toxinas;
	Toxemia presença de toxinas no sangue.
 Toxina esfoliativa (ET) ou epidermolisina, possui ação localizada (provocando bolhas na pele) ou ação generalizada (quando a toxina é produzida no sítio de infecção e levada pela corrente circulatória, provocando o descolamento de extensas áreas da epiderme, acarretando a SÍNDROME DA PELE ESCALDADA).
	A síndrome da pele escaldada geralmente acomete recém-nascidos uma vez que o Staphylococcus aureus pode estar presente no canal vaginal da mãe, entretanto a síndrome pode acometer crianças maiores, sendo então provocada pelo Streptococcus pyogenes.
Enzimas extracelulares do S. aureus: Catalase, fibrinolisina, DNAse (produzida pelo S. aureus a fim de degradar o DNA livre resultante da morte dos neutrófilos, este DNA serviria de “rede” para prender as bactérias. Se uma bactéria possui a DNAse provavelmente ela possui a coagulase), colagenase e hialuronidase (S. pyogenes e S. aureus produzem a fim de degradar o colágeno e o ácido hialurônico promovendo a disseminação bacteriana no tecido subcutâneo), lipase, coagulase e estafiloquinase (o S. aureus produz a 37°C a enzima coagulase por 4 horas, após este período a bactéria passa a produzir estafiloquinase a fim de quebrar os coágulos).
O Staphylococcus aureus pode ser diferenciado de outras bactérias do gênero Staphylococcus sp através da enzima coagulase, pois esta enzima está presente apenas no S. aureus! Coagulase (enzima secretada), fator clumping (enzima acoplada a parede celular).Portanto, o teste da catalase diferencia o gênero (positivo para Staphylococcus sp, e o teste da coagulase diferencia a espécie (positivo para S. aureus).
O teste da coagulase é feito ao pingar uma gota de sangue de coelho em uma colônia posta em uma lâmina, se houver coagulação o teste é positivo. O fator clumping é testado em lâmina e é “presuntiva”, já a coagulase é “confirmatória”.
O teste da DNAse consiste em semear a bactéria no meio de cultura DNAse, após a incubação aplica-se HCL 1N na colônia para que o meio se torne opaco, se houver formação de halo ao redor da colônia o teste deu positivo.
O Ágar Manitol salgado 6,5% é um meio seletivo para G+, ou seja, apenas bactérias G+ crescem neste meio. O S. aureus quando semeado no Ágar Manitol salgado 6,5% fermenta o manitol apresentando colônia AMARELA, fechando assim o diagnóstico de S. aureus. Outras espécies de Staphylococcus (catalase negativas) que não o S. aureus crescem, porém não fermentam o manitol.O proteus, apesar de ser G-, cresce, mas não fermenta o manitol.
Ou seja, após receber a amostra, semear em Ágar sangue e Ágar McConkey, fazer a lâmina para a coloração de Gram, deve-se incubar as placas por 24h, pelo fato de ser uma bactéria G+ haverá crescimento apenas no Ágar sangue, é necessário fazer o teste da catalase para identificar o gênero de G+ (pode ser Staphylococcus sp, Enterococcus sp ou Streptococcus sp, a positividade do teste revela que é Staphylococcus sp), o próximo teste a ser aplicado deve ser o teste da DNAse, seguido do teste da coagulase (com este teste O Staphylococcus aureus pode ser diferenciado de outras bactérias do gênero Staphylococcus sp) e finalmente o manitol (O Staphylococcus aureus fermenta o manitol e a colônia se apresenta AMARELA, confirmando assim o diagnóstico de S. aureus, bactérias coagulase negativa – outras espécies de Staphylococcus – não fermentam o manitol). 
Staphylococcus pseudointermedius
É o “aureus” do cão e do gato, porém com a domesticação destes animais esta bactéria vem infectando cada vez mais humanos. Bactéria relacionada a, é altamente oportunista! É coagulase positiva, DNAse positiva e Manitol negativo!
Staphylococcus epidermidis
Bactéria associada a INFECÇÃO HOSPITALAR, é coagulase negativa, DNAse negativa e Manitol negativo!
Staphylococcus saprophyticus
Bactéria oportunista, presente na região genital de homens e mulheres, causando infecções do trato urinário em mulheres jovens de idade fértil (bactéria da lua de mel) podendo acarretar cistites e pielonefrites. É coagulase negativa, DNAse negativa e Manitol negativo!
O teste da NOVOBIOCINA permite diferenciar Staphylococcus epidermidis de Staphylococcus saprophyticus, o S. epidermidis é sensível a novobiocina (há formação de halo) e o S. saprophyticus é resistente a novobiocina (não há formação de halo).
(O teste é feito ao semear a bactéria como antibiograma em ágar Müeller-Hinton; colocar um disco de novobiocina 5 µg/mL e incubar a 35±2ºC por 18 - 24 h).
Ou seja, após receber a amostra, semear em Ágar sangue e Ágar McConkey, fazer a lâmina para a coloração de Gram, deve-se incubar as placas por 24h, pelo fato de ser uma bactéria G+ haverá crescimento apenas no Ágar sangue, é necessário fazer o teste da catalase para identificar o gênero de G+ (pode ser Staphylococcus sp, Enterococcus sp ou Streptococcus sp, a positividade do teste revela que é Staphylococcus sp), o próximo teste a ser aplicado deve ser o teste da DNAse, seguido do teste da coagulase (com este teste O Staphylococcus aureus pode ser diferenciado de outras bactérias do gênero Staphylococcus sp – que no caso de infecção por S. epidermidis ou S. saprophyticus dará NEGATIVO) e finalmente o manitol (O Staphylococcus aureus fermenta o manitol e a colônia se apresenta AMARELA, confirmando assim o diagnóstico de S. aureus, bactérias coagulase negativa – outras espécies de Staphylococcus – não fermentam o manitol, OU SEJA, no caso de infecção por S. epidermidis ou S. saprophyticus dará NEGATIVO). A partir destes resultados (Coagulase, DNAse e Manitol negativos) aplica-se o teste da novo Novobiocina, o S. epidermidis é sensível a novobiocina (há formação de halo) e o S. saprophyticus é resistente a novobiocina (não há formação de halo). Fechando assim o diagnóstico de S. epidermidis ou S. saprophyticus de acordo com a relação da colônia com a Novobiocina.
FAMÍLIA STREPTOCOCCACEAE
Após receber a amostra, semear em Ágar sangue e Ágar McConkey, fazer a lâmina para a coloração de Gram, deve-se incubar as placas por 24h, pelo fato de ser uma bactéria G+ haverá crescimento apenas no Ágar sangue, é necessário fazer o teste da catalase para identificar o gênero de G+ (pode ser Staphylococcus sp, Enterococcus sp ou Streptococcus sp, a negatividade do teste revela que é Streptococcus sp ou Enterococcus sp). Uma vez sabendo que se trata de uma bactéria do gênero Streptococcus sp ou Enterococcus sp deve-se identificar qual o gênero do microorganismo e qual a espécie.
	As espécies de Streptococcaceae são: S. agalactiae, S. pyogenes, S. peneumoniae, bactérias do grupo C, F e G, e do grupo viridans. LEMBRAR: CATALASE NEGATIVOS E HEMOLÍTICOS!
	Na parede celular do Streptococcaceaeexiste o carboidrato C um carboidrato que muda de espécie para espécie. É por esse carboidrato que diferenciamos as diferentes espécies de Streptococcaceae que são β-hemóliticos. 
Existem três tipos de hemólise:
α-hemolíticos zona verde ao redor das colônias (lise incompleta, precipitação de Hb);
β-hemolíticos zona clara ao redor das colônias (lise completa das hemácias);
γ-hemólise não hemolíticos, não tem hemolisina.
 A partir da diferença entre os carboidratos C é feita a classificação de Lancefield (que divide as bactérias do gênero Streptococcaceae beta hemolíticas em grupos distintos). 	
	Uma das principais bactérias do grupo A é a Streptococcus pyogenes,
	Uma das principais bactérias do grupo B é a Streptococcus agalactiae.
No geral os Streptococcus possuem necessidades nutricionais complexas (bactéria fastidiosa) exigindo Ágar acrescido de 5% de sangue, sendo necessário semear esta bactéria em meios ricos tais como Ágar sangue ou Ágar chocolate. Todos são anaeróbios facultativos, embora cresçam melhor em situações de anaerobiose. A presença de CO2 favorece o crescimento de colônias se não houver câmaras de anaerobiose existe a possibilidade de colocar as placas “na vela”.
Os Streptococcus são imóveis (não possuem flagelos) e são constituintes da microbiota.
Grupo A Classificação de Lencefield
A princípal bactéria do grupo A é a S. pyogenes, sendo este um β-hemolítico. Geralmente infecções por S. pyogenes de apresentam de maneira piogênica (com presença de pus. 
Ex: erisipela lesões bem definidas, avermelhadas e de bordas elevadas, não apresentam pus, mas são causadas por S. pyogenes! O impetigo pode ser causado por S. pyogenes também!
Quando a bactéria atinge tecidos mais profundos a infecção recebe o nome de celulite, neste estado a bactéria (S. pyogenes) produz toxinas (SPE, fosfolipases etc) que degradam os músculos! Por esta característica o S. pyogenes é conhecido como a bactéria que “come carne”.
O S. pyogenes pode causar doenças autoimunes por conter a proteína M que é muito parecida com antígenos próprios do hospedeiro, fazendo com que anticorpos produzidos contra a proteína M reconheçam estruturas próprias.
Este reconhecimento cruzado pode gerar febre reumática, glomerulonefrite, síndrome de Turret (panda).
Fatores de virulência: Cápsula, exotoxina (algumas são superantígenos – SPA, SPB que é pirogênica), hialunoridase, calagenase, DNAse, streptolisina, proteína F (contribui na adesão a mucosa da faringe), proteína M (adesão, antifagocítica, inativa a proteína C3 do complemento), ácido lipotecóico, bacteriolisina (contra outras bactérias G+).
Então, para o diagnóstico, é necessário fazer o teste da catalase (que dará negativo) indicando ser um Streptococcus ou Enterococcus, para diferenciar entre os dois gêneros é necessário observar a hemólise no Ágar sangue, pois os Enterococcus não são hemolíticos! Portanto, tem-se que a presença de hemólise determina o gênero e a relação com a Bacitracina e com o Cotrimoxazol determina o grupo à qual a bactéria pertence.
Havendo hemólise entende-se que se trata de uma bactéria do gênero Streptococcus sp (trata-se de uma bactéria β-hemolítica). Uma vez sabendo que é um Streptococcus o próximo passo é identificar o grupo ao qual esta bactéria pertence (A ou B), para isso aplica-se o teste da Bacitracina (atua na síntese da parede celular porém tem como local de ação a membrana plasmática) e Cotrimoxazol, que consiste em aplicar discos de Bacitracina e Cotrimoxazol na placa e incubar por 24h, como se fosse um antibiograma. 
Bactéria sensível aos dois medicamentos Grupo A
Bactéria resistente aos dois medicamentos Grupo B
Uma vez sabendo a qual grupo a bactéria pertence é necessário identificar a espécie da mesma, para tanto é aplicado a prova da bile esculina prova que avalia a capacidade da bactéria em hidrolisar a esculina em presença de bile; se ela for capaz de fazer isso ela vai produzir esculetina que reagirá com o nitrato de ferro presente no meio, escurecendo assim o meio de caramelo para preto.		
O teste da bile esculina para o S. pyogenes é NEGATIVO, ou seja, ao final da prova o meio continuará com a cor caramelo. (Bactérias do gênero Staphylococcus também não crescem neste meio). 
O teste da tolerância ao NaCl 6,5% é feito com caldo contendo glicose + NaCl + susbtência indicadora de Ph (púpura de bromocresol). Com o crescimento bactériano o caldo passa de púrpura para amarelo(ou turvo) devido ao metabolismo bacteriano responsável por modificar o ph.
Streptococcus β-hemolíticos não são tolerantes ao NaCl 6,5%, mantendo então o caldo na cor original (púrpura). Já Staphylococcus crescem neste meio.
Ou seja, o S. pyogenes matém o caldo púrpura, ou não turva o caldo.
Caso clínico paciente de 15 anos com quadros recorrentes de dor de garganta e suspeita de febre reumática. (suspeita que hava infecção por S. pyogenes).
Feita a lâmina para a colaração de Gram observou-se que se tratava de estreptococos G+ (cocos enfileirados corados de azul). A bactéria foi semeada em ágar sangue e McConkey, havendo crescimento apenas no ágar sangue. Uma vez observado a presença de β-hemólise e obtendo um teste negativo na catalase sabe-se que se trata realmente de uma bactéria do gênero Streptococcus. Após a obtenção desta informação é necessário realizar o teste da Bacitracina e do Cotrimoxazol a fim de identificar a qual grupo pertence a bactéria, no caso do S. pyogenes (pertencente ao grupo A) a bactéria se apresentará sensível a Bacitracina. Após identificar o grupo aplica-se o teste da bile esculina e de resistência ao NaCl 6,5%, que no caso do S. pyogenes será negativo em ambos os testes.
	Teste PYR Se a bactéria possuir a enzima pirrolidonilarilamidase (PYR) ela será capaz de clivar o L-PIRROLIDONIL-β-NAFTALINA liberando o β-NAFTALINA (livre) que é incolor; a adição de p-dimetil-aminocinamaldeído a 0,01% torna a colônia vermelha se for S. pyogenes indicando o resultado POSITIVO. O teste PYR é disponibilizado em forma de discos no qual esfrega-se a colônia.
	Teste CAMP Teste para diferenciar S. pyogenes de S. agalactiae.
A CAMP é uma proteína presente em alguns Staphylococcus, esta proteína reage snergisticamente (potencializando) com a hemolísina do S. aureus resultando numa intensa hemólise.
Então temos que a estria C é feita com colônias de S. aureus e que as estrias A e B são bactérias do gênero Streptococcus prestes a serem identificadas. Bactérias pertencentes ao grupo A (s. pyogenes) não possuem a proteína CAMP, ou seja, não haverá hemólise intensa pela potencialização das hemolísinas do S. aureus pela CAMP, ou seja, para S. pyogenes o CAMP é negativo (representado pela estria B na figura)! As bactérias pertencentes ao grupo B (S. agalactiae) possuem a enzima CAMP, ou seja, elas potencializam as hemolisinas do S. aureus promovendo uma hemólise intensa que forma uma “seta” na placa de ágar sangue, ou seja, para S. agalactiae o CAMP é positivo (representado pela estria A na figura)!
Resumo do Streptococcus pyogenes: É um β-hemolítico pertencente ao grupo A (classificção de Lancefield).
Bacitracina: Sensível, pois pertence ao grupo A.
Contrimoxazol: Sensível
Bile esculina: Negativo
Resistência ao NaCl 6,5%: Negativo
PYR: Positivo
CAMP: Negativo
 	β-hemolíticos do grupo B – Staphylococcus agalactiae
O S. agalactiae é o principal responsável pela febre puerperal, meningite e sepse em recém nascidos, por este motivo é de extrema importância que se faça o teste do cotonete em gestantes que estão próximas a 12º semana de gestação, em casos onde é encontrado o S. agalactiae como parte da microbiota da gestante é necessário a intevenção com antimicrobianos meses antes do parto ou então optar pela cessáriana a fim de não colocar o recém nascido em situação de risco.
Fatores de virulência: cápsula (adesão e fuga da fagocitose), enzima CAMP (se liga a imunoglobulina C e M via porção Fc assimcomo a proteína A, além de potencializar as hemolisinas do S. aureus no teste CAMP), DNAse, hialuronidase, estreptolisina etc.
Diagnóstico de S. agalactiae: Feita a lâmina para a colaração de Gram observou-se que se tratava de estreptococos G+ (cocos enfileirados corados de azul). A bactéria foi semeada em ágar sangue e McConkey, havendo crescimento apenas no ágar sangue. Uma vez observado a presença de β-hemólise e obtendo um teste negativo na catalase sabe-se que se trata realmente de uma bactéria do gênero Streptococcus. Após a obtenção desta informação é necessário realizar o teste da Bacitracina e do Cotrimoxazol a fim de identificar a qual grupo pertence a bactéria, no caso do S. agalactiae (pertencente ao grupo B) a bactéria se apresentará resistente a Bacitracina. Após identificar o grupo aplica-se o teste da bile esculina e de resistência ao NaCl 6,5%, que no caso do S. agalactiae será negativo em ambos os testes, segue-se então com o teste PYR que dará negativo e o teste CAMP que será positivo!
Resumo do Streptococcus agalactiae: É um β-hemolítico pertencente ao grupo B (classificção de Lancefield).
Bacitracina: Resistente, pois pertence ao grupo B.
Cotrimoxazol: Resistente
Bile esculina: Negativo
Resistência ao NaCl 6,5%: Negativo
PYR: Negativo
CAMP: Positivo
Em casos de: 
Bacitracina: Resistente
Contrimoxazol: Sensível
Bile esculina: NegativoTrata-se de um β-hemolítico do grupo C ou G (Classificação de Lancefield)
Resistência ao NaCl 6,5%: Negativo
PYR: Negativo
CAMP: Negativo
Caso Clínico: Pacientes com calafrios, febre, tosse e dor pleural. O catarro é de cor avermelhada ou marrom e “oxidado”. Bacteremia em 15 a 20% dos casos = PNEUMONIA ESTREPTOCÓCICA Cocos G+ organizados aos pares na lâmina (diplococos).
	Streptococcus pneumoniae G+ (coram-se de azul), são α-hemolíticos (hemólise incompleta, resultando num sombreado verde em torno da região de hemólise), se apresenta em diplococos, faz parte da microbiota do trato respiratório superior, conhecido como pneumococo, causa pneumonia, meningite etc. Possui forma de “chama de vela”, são anaeróbios facultativos e possuem necessidades nutricionais complexas exigindo meios ricos como ágar sangue, ágar chocolate etc. Um dos princípais fatores de virulência é a capsula de polissacarídeos, sendo esta bastante imunogênica (mais de 90 sorotipos).
Diagnóstico de S. pneumoniae: Feita a lâmina para a colaração de Gram observou-se que se tratava de estreptococos G+ (cocos enfileirados corados de azul). A bactéria foi semeada em ágar sangue e McConkey, havendo crescimento apenas no ágar sangue. Uma vez observado a presença de α-hemólise e obtendo um teste negativo na catalase sabe-se que se trata realmente de uma bactéria do gênero Streptococcus. Após a obtenção desta informação é necessário realizar o teste da Bacitracina e do Cotrimoxazol a fim de identificar a qual grupo pertence a bactéria, no caso do S. pneumonie a bactéria se apresentará resistente a Bacitracina e sensível ao Cotrimoxazol, o que indicará que provavelmente a bactéria pertence ao grupo C ou G. Após “identificar o grupo” aplica-se o teste da bile esculina e de resistência ao NaCl 6,5%, que no caso do S. pneumonie será negativo em ambos os testes, segue-se então com o teste PYR que dará negativo e o teste CAMP que será negativo também. Segue-se então com o teste da Optoquina que permite diferenciar S. pneumonie de outros α-hemoliticos. O S. pneumonie é SENSÍVEL a Optoquina (formando um halo de inibição de 14 – 18mm), os outros são resistentes.
Resumo do Streptococcus pneumoniae: É um α-hemolítico..
Bacitracina: Resistente
Cotrimoxazol: Sensível
Bile esculina: Negativo
Resistência ao NaCl 6,5%: Negativo
PYR: Negativo
CAMP: Negativo
Optoquina: Sensível
E se o microorganismo α-hemolítico se apresentar resistente a optoquina? 
Neste caso deve-se avaliar o crescimento em bile esculina, sendo negativo trata-se de Streptococcus do grupo viridans.
Bactérias pertencentes a esta grupo são α-hemolíticas, extremamente oportunistas, fazem parte da microbiota da boca, podem causar endocardite, bacteremia etc.
E se o microorganismo se apresentar resistente a optoquina e ser positivo no teste da bile esculina?
Neste caso trata-se de uma bactéria do grupo Enterococcus sp, bactérias deste gênero compõem a microbiota residente do intestino, sendo extremamente oportunistas! São α-hemolíticos também! Estas bactérias são SUPER RESISTENTES a antimicrobianos da classe dos β-lactâmicos (ex: penicilina) e da classe dos aminoglicosídeos (ex: estreptomicina, gentamicina).
Apresentam-se em diplococos, são anaeróbios facultativos, apresentam γ ou α hemólise (alguns possuem o gene da citolisina e por isso realizam a α-hemólise), são catalase negativos, toleram o NaCl 6,5% e sais biliares a 40% (crescem em meios hipertônicos), e crescem em condições variáveis de temperatura e ph apesar de gostarem de ph mais elevado (básico).
Gênero Enterococcus sp:Bactérias pertencentes ao GRUPO D da classificação de Lancefield.
Streptococcus bovis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Bactérias do Grupo D Não possuem o carboidrato C e sim ácidos lipotecóicos (ác. Tecóico + glicerol). O S. bovis apesar de não ser um Enterococcus é agrupado no grupo D por possuir características muito semelhantes as do Enterococcus!
Streptococcus do grupo não Enterococcus
Antígeno de Lancefield tipo DEnterococcus
 O gênero Enterococcus possui 29 espécies das quais as mais importantes e presente nas fezes são: E. faecium e E. faecalis.
E. faecalis resistente a diversos medicamentos, inclusive à VANCOMICINA (antimicrobiano utilizado em G+ resistentes a β-lactâmicos). A vancomicina possui uma molécula grande que reconhece D aminoácidos presentes na parede celular de G+. O antimicrobiano se liga a D-alanina em bactérias não resistentes, as bactérias resistentes trocam o D-alanina por D-lactato impedindo assim o reconhecimento pelo antimicrobiano, sendo assim uma VRE – Enterococcus resistente a vancomicina.
Como diferenciar Streptococcus de Enterococcus?
Ambos são G+ e catalase -
Ambos possuem forma de cocos
A principal diferença entre eles é a HEMÓLISE
Enterococcus sempre fazem a γ hemólise (ausência de lise celular), MAS as vezes pode fazer a α hemólise ao receber genes de citolisina através de plasmídeos. Cocos G+ não possuem pillis, então como ocorre a troca de plasmídeos?
A bactéria possui o plasmídeo que contém o gene que codifica a citolisina e também codifica subtância agregativa. Uma segunda bactéria possui genes que codificam feronômios, ao secretar esses feronômios (proteínas) eles entram na primeira bactéria e se ligam a uma região plasmídeo que o estimula a expressar a substância agregativa, desta forma as duas bactérias se unem e assim ocorre a transferência do plasmídeo pAD1.
Fatores de virulência: aderência (substância agregativa), proteína de superfície que os agrega na conjugação,mas também interage com células e tecidos de animais. Citolisinas (proteína composta por 2 subunidade, uma grande –L- e uma pequena –S-) com atividade lítica sobre eritrócitos e outras células humanas (hemolisina) e também expressa atividade lítica contra células bacterianas G+ (bacteriocina).
 Resistência a antimicrobiano adquirida através de conjugação, onde ocorre a trasferência do plasmídeo pAD1.
Enterococcus sp Bile esculina + e NaCl 6,5% +
Streptococcus do grupo D Bile esculina + e NaCl –
Streptococcus do grupo viridans podem fazer γ hemólise. Como diferenciá-los de S. do grupo D? 
	
	BILE
	CALDO NaCl 6,5%
	
	Bactéria X
	caramelo
	roxo
	Streptococcus sp
	Bactéria Y
	caramelo
	amarelo
	Staphylococcus sp
	Bactéria Z
	preto
	amarelo
	Enterococcus sp
Pelo teste da Bile esculina! Ele deve ser negativo para o grupo viridans e positivo para o grupo D.
FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEA	
	Dentro da família Enterobacteriacea encontram-se grande parte dos coliformes fecais, dentre eles o maiscomum é a bactéria E. coli. Também pertence à família Enterobacteriacea os Enterobacter, que são bacilos G-.
Identificação de bacilos G- fermentadores – BGNF
 Os bacilos G- possuem em sua parede celular delgada camada de peptideoglicano que permite a saída do cristal violeta, sendo corado posteriormente pela fucsina, corando-se assim de rosa quando submetido ao Gram. São bactérias altamente oportunistas, fazem parte da microbiota residente do intestino são aeróbios e/ou anaeróbios facultativos (ou seja, preferem o O2 como fonte de carbono, porém, na ausência dele são capazes de adquirir o carbono por outros meios, ex: fermentação de carboidratos – glicose, lactose... 
Caracterização antigênica
Os bacilos G- possuem em seu LPS o lipídio A, o antígeno O (parte polissacarídica do LPS que varia muito, dificultando assim o reconhecimento da bactéria pelo sistema imune, o antígeno K (kapsel – cápsula, que pode ser polissacarídica ou proteica) e o antígeno H (proteínas flagelares). 
A caracterização destes antígenos tem como objetivo conhecer a especificidade antigênica destas bactérias a fim de realizar teste de identificação a partir da aglutinação com anti-soros específicos.
Antígeno K – A cápsula contribui para a fixação bacteriana e para a fuga da fagocitose, bactérias que produzem muuuuita cápsula apresentam-se em colônias muuuuito gosmentas! Colônias de G- já são gosmentas normalmente, porém, bactérias que produzem cápsula apresentam colônias bem mais gosmentas, ex: Klebsiella sp. é cLemosa kkkkk.
Diferenciar E. coli de Klebsiella sp ao olhar a placa de ágar McConkey: a E. coli formará um precipitado róseo no ágar, a Klebsiella não. KPC: Klebsiella pneumonie carbaponemase cliva o carbapenêmico 
S
Antígeno H – pode ser desnaturado ou removido por calor, os anticorpos predominantes contra o antígeno H são da classe IgG; a grande maioria dos bacilos G- são peritríquios, ou seja, possuem vários flagelos em toda a sua superfície.
Bactérias desta família comumente acarretam quadros de diarreia, em quadros clínicos como este é importante fazer a pesquisa pelos antígenos KHO a fim de identificar o soro-tipo da bactéria. Ex: E. coli K157: O7 Soro-tipo da E. coli encontrada em hambúrgueres. 
BGNF não formam endósporos – só bacilos G+ formam endósporos! São organismos fermentadores de glicose em condições anaeróbias, todos fermentam a glicose, entretanto em relação a outros carboidratos a fermentação é específica de cada espécie. É importante ressaltar que ao realizarem a fermentação há a liberação de ácidos orgânicos, o que pode influenciar no pH do meio.
A fermentação acarreta também a produção de gás! É possível visualizar este fenômeno ao introduzir num tubo com caldo rico em carboidratos e em condições de anaerobiose um tudo de Durham, se a bactéria for fermentadora ela produzirá gás deslocando o tudo de Durham acima do caldo. Outro meio de visualização da fermentação é o ágar inclinado, onde é possível ver o deslocamento do ágar, a formação de bolhas ou o ágar quebrado mediante produção de gás.
Boa parte das bactérias pertencentes a família Enterobacteriacea reduzem nitritos a nitratos! (Verificar exames bioquímicos Urina I).
O diagnóstico
Ao receber uma amostra de fezes deve-se proceder com a cultura em meios seletivos e diferenciais (McConkey). Há meios de enriquecimento e seletivos para alguns gêneros (a fermentação da lactose direciona a identificação), após a semeadura e visualização ou não de fermentação é feita a identificação bioquímica da colônia isolada (identificação da espécie), subsequente é feita a sorologia para patógenos com grupos sorológicos bem definidos, ex: E. coli K157: O7. Se mesmo com todos estes métodos a identificação não for possível é realizada uma pesquisa de genes de virulência por sonda e PCR.
A identificação de espécie contaminante, fonte de contaminação e medidas de contenção são de extrema importância em casos de surtos.
Identificação fenotípica
Para identificar a família BGNF: Você viu que é G- e quer ver se é da família Enterobacteriacea.
Conferir a capacidade de fermentação de glicose, para isso utiliza-se de dois tubos de cor verde ricos em glicose, coloca-se a bactéria em ambos os tubos e em apenas um dos tubos coloca-se óleo mineral a fim de impedir a difusão do O2; se a bactéria crescer o meio se tornará amarelo pois os ácidos da respiração causarão uma queda no pH modificando assim a cor do meio. Se a bactéria em questão se tratar de uma BGNF os dois tubos ficarão amarelos ao final do teste.
Reação de oxidase, o teste é baseado na produção intracelular da enzima oxidase pela bactéria. A enzima citocromo oxidase oxida o substrato impregnado no disco resultando em uma coloração rósea. É importante não utilizar meios com açúcar, pois podem ocorrer resultados falsos negativos pois a fermentação inibe a atividade da oxidase, alças e agulhas que contenham resíduos de ferro não devem ser utilizadas pois oxidam a fita e resultam em falso positivo.
Bactérias aeróbias contêm a enzima oxidase;
Bactérias anaeróbias facultativas não contêm a enzima oxidase, não necessariamente.
	Ágar McConkey é um meio seletivo e diferencial, pois apenas G- crescem neste meio e este meio é capaz de diferenciar bactérias fermentadoras de lactose de bactérias não fermentadoras.
	Possui como fonte de carbono a lactose, se a bactéria cresce no McConkey ela é fermentadora de lactose. 
	Lac – (o meio de rosa se torna amarelo) – não há fermentação da lactose, o que resulta na sua oxidação, dando ao meio um aspecto translúcido.
	Lac+ (o meio permanece rosa) – há fermentação e a conservação da cor do ágar.
O teste do Citrato
	Teste aplicado com o intuito de diferenciar entre dois gêneros extremamente importantes: E. coli e Klebsiella pneumonie.
	O ágar inclinado utilizado para este teste tem como fonte de carbono o Citrato, se a bactéria for capaz de assimilar o citrato como fonte de carbono o meio passará de verde para azul, se a bactéria não for capaz de assimilar o citrato como fonte de carbono o meio permanecerá verde.
	Meio azul, indica a presença de Klebsiella pneumonie, meio verde, indica a presença de E. coli.
Teste da descarboxilação de Lisina e Ornitina
	O teste tem como objetivo observar a presença ou ausência de uma enzima da classe descarboxilase e deve ser feito em condições de anaerobiose.
A descarboxilase hidrolisa a os aminoácidos removendo assim o grupo carboxil (COOH) e liberando aminas alcalinas e CO2 (tornando assim o pH do meio mais básico).
Cada aminoácido tem uma descarboxilase específica: Lisina – cadaverina e Ornitina – putrescina (proporcionam cheiro de pobre ao liberar as aminas para o meio)
O tubo do teste (que deve ser feito em condições de anaerobiose) vem com ágar inclinado na cor roxa (púrpura de bromo cresol – indicador de pH), se a bactéria possuir a descarboxilase ela consequentemente hidrolisará aminoácidos, liberando assim aminas para o meio promovendo um aumento no pH, essa alcalinização do meio o tornará ainda mais roxo! Se a bactéria não possuir a descarboxilase os ácidos provenientes da respiração celular deixarão o meio ácido, a queda do pH dá ao meio a cor amarela.BLEE – beta lactamase de espectro estendido.
Tratável com β-lactâmico combinado com ácido clavulanico, sulbactam ou tazobactam.
Proteus Bactéria que modifica o pH do meio tornando alcalino (~8,0 ou 9,0), deixando assim o meio ainda mais roxo! Este teste deve ser feito em anaerobiose (utilização de óleo mineral). 
 Teste da Fenilalanina Desaminase (FAD)
	O teste tem como objetivo observar a presença ou ausência da enzima FAD nos microrganismos. A enzima FAD reduz a fenilalanina a ácido fenilpirúvico + cloreto férrico, a presença da enzima FAD e sua interação com a fenilalanina torna a reação positiva, dando ao tubo a cor “verde garrafa”.
	Bactérias FAD positivo: Proteus, Morganella e Providencia São muito parecidas, as vezes não é possível diferenciar, então basta dizer que é do grupo Proteus,Morganella e Providencia.
Proteus: É a bactéria boiola! É um G- (fica rosa ao fim da coloração) que cresce em véus.
	Colônias desta bactéria apresenta odor característico semelhante a odor de peixe no estágio de putrefação.
	Quando semeado em ágar McConkey o Proteus não apresenta fermentação de Lactose, deixando assim o ágar translúcido (ou caramelo) devido a oxidação da lactose, devido a esta característica ele é denominado como LAC-, entretanto, isso não quer dizer que ele não seja um BGNF, pois é sabido que todos os BGNF fermentam a glicose, porém outros carboidratos são específicos de algumas bactérias e a lactose não é a especialidade da bactéria em questão.
Como diferenciar a E.coli? É possível diferenciar a E.coli a partir da produção de Indol.
	Algumas bactérias possuem uma enzima chamada triptofanase, esta enzima degrada o triptofano presente no caldo liberando indol + ác pirúvico + amônia para o meio. A adição de reagente de Kovacs em um caldo com indol faz com que estes interajam acarretando a formação de um anel vermelho no fundo ou na superfície do caldo.
	Indol positivo (anel vermelho) = E. coli ou Edwardsiella spp.
Teste de motilidade
 	Para realizar o teste de motilidade em bactérias da família Enterobacteriaceae é necessário utilizar ágar 0,4% (semissólido), inocula-se a bactéria fazendo um furo (picada) no ágar, e adiciona-se 1% de cloreto de trifenil-tetrazolium 24h após a incubação (a bactéria incorpora o corante cloreto de trifenil-tetrazolium que inicialmente é incolor e reduz este corante tornando-o vermelho, facilitando assim a visualização e localização das bactérias no ágar semissólido). 
	Se a bactéria se espalhar por todo o ágar = motilidade positiva
	Se a bactéria se contém apenas no local da picada = motilidade negativa
Redução de NitratoA adição de α-naftilamina e ácido sulfanílico resulta num corante vermelho quando na presença de nitrito.
	 NO3- + 2e- +2H+ NO2- + H2ONitrito
Nitrato
Para a realização do teste de redução de nitrato é necessário adicionar a bactéria num meio com nitrato (caldo), incubar por 24h e adicionar os corantes no dia seguinte, se houver presença de nitrito o meio se tornará vermelho. Ex: E. coli reduz nitrato a nitrito!
As vezes algumas bactérias convertem o nitrato a nitrito e o nitrito a nitrogênio em alta velocidade (ex: ps. aeroginosa) fazendo com que a adição do corante não resulte na cor vermelha, por isso não é correto fechar o teste apenas com o uso do corante. Ao adicionar pó de zinco este reage com o NITRATO presente.
Se mesmo com a adição do pó de zinco o caldo permanecer “branco” é possível concluir que a bactéria é capaz de reduzir nitrato, uma vez que este já não é mais encontrado no meio; se com a adição do pó de zinco o meio se tornar vermelho significa que a bactéria não é capaz de reduzir o nitrato a nitrito e por este motivo o pó de zinco interage com o nitrato presente no meio.
Teste de Voges-Proskauer
Tem como objetivo avaliar a utilização da via acetoína para a fermentação da glicose, para isso são utilizados reagentes que interagem com produtos desta via.
E. coli = resultado negativo (amarelo)
E. aeroginosa = resultado positivo (vermelho)
Bactérias positivas a este teste: Enterobacter, Hafnia, Serratia e Klebsiella.
Duas destas bactérias fazem parte das CESP (Citobacter, Enterobacter, Serratia e Providencia), estas bactérias possuem a enzima AmpC que degrada cefalosporina (β lactâmico modificado com o intuito de obter anéis mais estáveis).
Meios impregnados para a identificação de BGNF
O instituto Adolfo Lutz desenvolveu o meio Rugai modificado, onde é possível realizar sete testes em um único tubo! A sequência de testes presentes no tubo são (da tampa para o fundo): indol, o ápice possui dois testes, a base com quatro testes, parafina para criar anaerobiose, o teste da descarboxilase (lisina) e finalmente o teste da motilidade.
A Escola Paulista de Medicina criou o meio EPM e Mili onde é possível realizar os mesmos testes citados acima, porém separados em dois tubos. No tubo Mili observa-se a motilidade, indol e lisina, sendo este um tubo na cor púrpura no tubo EPM realiza-se os destes de produção de gás, produção de H2S (torna o composto enegrecido na base do Rugai ou EPM), hidrólise da ureia e presença de triptofano desaminase, sendo este um tubo verde.
É comum a utilização das sete provas do EPM e Mili + a utilização da lactose no ágar McConkey.
SOROLOGIA: IDENTIFICAÇÃO DE SOROTIPO
A sorologia é feita após a identificação da espécie e busca especificar os antígenos KHO: cápsula, flagelo e membrana plasmática.
As principais bactérias a serem submetidas a sorologia são: Salmonella spp, Shigella spp, E. coli, Yersina enterocolítica e a Vibrio cholerae que apesar de ser fermentador não é um componente da família Enterobacteriaceae.
Portanto o diagnóstico para a Família Enterobacteriaceae deve seguir os seguintes passos: Identificação de BGNF a partir da colônia, identificação do gênero e espécie, e finalmente a sorotipagem. 
Existem gêneros que DEVEMOS saber identificar, entre eles estão: Citobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigela, Yersina.
Bactérias dos gêneros citados acima são capazes de promover infecções extra intestinais como as infecções sistêmicas provocando bacteremia ou infecções localizadas, provocando abcessos, pneumonias, meningite, ITU (infecções do trato urinário) etc, e até mesmo infecções intestinais, que são mais frequentemente causadas pela Escherichia coli. 
Fatores de virulência 
As BGNF possuem diversos fatores de virulência, a expressão deles é mediada por sistemas complexos de regulação sensíveis a diferentes condições ambientais.
Algumas destas bactérias como por exemplo Serratia spp e Enterobacter spp sobrevivem muito bem em soluções com baixo poder desinfetante como álcool etílico e isopropílico, hipoclorito de sódio, fenólicos etc, sendo necessário então soluções desinfetantes mais fortes para realizar a limpeza de ambientes hospitalares por exemplo.
Membros da família Enterobacteriaceae podem ser incriminados em praticamente qualquer tipo de doença infecciosa isolada de qualquer amostra recebida em laboratório.
É importante lembrar que pacientes internados a muito tempo têm a microbiota da pele substituída por bactérias da família Enterobacteriaceae. 
Coliformes fecais ou termotolerantes E. coli 
Coliforme total Klebsiella, Enterobacter (pertencentes a família Enterobacteriaceae).
Klebsiella
As mais comuns em amostras são: K. pneumoniae (KPC) e K. oxytoca, estas bactérias colonizam o trato gastrointestinal e são diferenciadas a partir do Indol, a K. pneumoniae é indol NEGATIVO e a K. oxytoca é indol POSITIVO.
Ambas são extremamente oportunistas causando pneumonias, bacteremia e infecções e outros órgãos, muito comum em diabéticos, RN’s, idosos, portadores de neoplasias etc.
É importante lembrar que a Klebsiella é cremosa no McConkey (devido à alta produção de cápsula, um importantíssimo fator de virulência) e não cria precipitado róseo.
Outras espécies do gênero Klebsiella
	Klebsiella granulomatis Causa DST: Cancro mole/ donovanose
	Klebsiella rhinoscleromatis Causa rinoscleroma (alterações granulomatosas nas vias respiratórias).
	Klebsiella ozenae ozena ou rinite atrófica fétida crônica acompanhada de secreção nasal purulenta de cor de tijolo.
	É importante salientar que quanto maior for o tempo de internação maiores são as taxas de colonização por Klebsiella pneumoniae, a colonização passa de ser apenas intestinal a ser presente até na pele.
	Bactérias do gênero Klebsiella estão grandemente relacionadas a KPC e a BLEE por serem geralmente encontradas em pacientes internados e em intenso tratamento com antimicrobianos, o que seleciona bactérias cada vez mais resistentes.
Escherichia coli	
	Bactérias com diversidade patogênica fantástica, causando desde infecções intestinais até infecções extra intestinais.Sepas comensais de E. coli colonizam o intestino, porém não são capazes de causar doenças. Sepas entéricas de E. coli colonizam o intestino e são capazes de causar doenças. Sepas extra intestinais não colonizam o intestino e são capazes de causar infecções em outros sistemas. O que diferencia cada uma destas sepas são os fatores de virulência.
	O que esperar de uma amostra comensal? Membros da microbiota, não possuem marcadores específicos de virulência. Estes colonizam o trato gastrointestinal logo após o nascimento e raramente causam doenças no hospedeiro.
SEPAS QUE CAUSAM INFEÇÕES EXTRA INTESTINAIS – ExPEC
	As ExPEC são separadas em três sorotipos capazes de causar meningite, infecções do trato urinário e bacteremia. Infecções por ExPEC na comunidade estão associadas a subida da ExPEC pela uretra. 	Infecções por ExPEC em hospitais estão associadas a contaminação de sondas, cateteres ou até fraudas por ExPEC.
ExPEC que causa infecção urinária UPECA terminologia “sorogrupo” refere-se apenas aos antígenos “O”, enquanto que a terminologia “sorotipo” refere-se aos antígenos “O” e “H”.
	Sorogrupos: O1, O4, O6, O16, O18 e O25 sorogrupos presentes em 75% dos casos.	As UPEC têm origem intestinal, porém não pertencem a microbiota, possuem fimbrias do tipo 1 (adesina) que garantem fantástica adesão, estas adesinas têm receptores em células do trato urinário garantindo assim sua adesão, invasão, multiplicação e por fim a esfoliação celular.
ExPEC que causa meningite e septicemia MNEC
	Acometem geralmente RN’s devido a contaminação do canal do parto, sua disseminação ocorre por via hematogênica. Possuem cápsula, adesina e citotoxinas. Os sorogrupos mais comuns são: O2, O78, O18, O7 e O1.
SEPAS QUE CAUSAM INFEÇÕES INTESTINAIS DIARREIOGÊNICAS 
EPEC, EHEC, ETEC, EAEC, EIEC e DAEC
	EPEC E. coli Enteropatogênica, causa lesões em pedestal (lesões A/E) pois alteram o citoesqueleto celular dos enterócitos formando um pedestal nas microvilosidades, alterando assim a absorção resultando em diarreias. E. coli EPEC possui um plasmídeo que determina o padrão de adesão “aglomerado”.
	EHEC/STEC/VTEC E. coli Enterohemorrágica, promove a evacuação de fezes com sangue. Causam lesões em pedestal e possuem a toxina de Shiga (toxina AB do grupo 3 de exotoxinas, na qual a parte B se liga, internalizando assim a parte A que é a parte “ativa” da toxina). Sendo esta toxina responsável pela degradação celular, atingindo os vasos que irrigam o intestino causando a sangramento.
	ETEC E. coli Enterotoxigênica, esta sepa produz duas toxinas: ST (termoestável) e LT (termolábil).
	 EAEC E. coli Enteroagregativa, agrega-se a outras bactérias adesão localizada, formando uma “parede” de bactérias em cima do epitélio intestinal produzindo muco a fim de mantê-los unidos, resultando na evacuação de fezes com muco. Estas bactérias produzem toxinas que alteram a motilidade intestinal.
	EIEC E. coli Enteroinvasiva, invade os enterócitos e assim migra de célula em célula sem se expor a luz intestinal ou passar pela matriz extracelular.
	DAEC E. coli Difusamente Aderente, realiza diversos tipos de adesão, onde todos interferem no processo de absorção.
EPEC
Diarreia do Lactente (fezes pastosas, sem sangue), sintomas: febre (não muito alta), náuseas, êmese e diarreias. O reservatório da EPEC é o homem, pois esta bactéria compõe nossa microbiota.
	As EPEC’s possuem o sistema de secreção do tipo 3, onde a bactéria possui uma proteína (porina) que se liga a uma porina de enterócito, a partir desta ligação a bactéria lança no citoplasma humano uma proteína que se acoplará a membrana plasmática do enterócito (Tir). Uma vez que a Tir se encontra na membrana plasmática do enterócito ela se liga a uma outra proteína presente na superfície da célula bacteriana (intimina), promovendo a adesão da bactéria à célula humana, possibilitando assim a modificação do citoesqueleto celular.
EPEC típica e EPEC atípica
	A EPEC típica possui plasmídeo EAF que codifica fatores de virulência tais como o padrão de adesão localizada (feixe de pílus BFP). A EPEC atípica não possui o plasmídeo EAF, não tem adesão localizada e forma microcolônias frouxas no intestino.
	A E. coli atípica é MUITO comum no Brasil, a EPEC não atinge apenas crianças, atinge adultos também.
EHEC
	Seu diferencia é a produção da toxina de Shiga ou verotoxina (toxina solúvel) que destrói tecidos! Do sangue esta toxina pode facilmente chegar aos rins onde promove a Síndrome hemolítica (urina com sangue) ou ainda a púrpura trombocitopênica (desregulação gastrointestinal).
	A EHEC é uma zoonose presente no intestino de bovinos que pode ser contraída através do consumo de carne bovina (ex. hambúrgueres). Este quadro infeccioso é extremamente grave em crianças, e a bactéria possui dose infectante baixa (100), ou seja, basta 100 bactérias para que a infecção seja estabelecida. 
EAEC
	A E. coli Enteroagregativa tem como principal característica a adesão agregativa (AA) onde as bactérias se distribuem de forma a cobrir as microvilosidades dos enterócitos de maneira que apresentam aparência de tijolinhos.
	As EAECs aderem a mucosa intestinal, se multiplicam e começam a produzir muito biofilme o que acarreta em muito muco e consequentemente a eliminação de fezes com muco. EAECs lesam a mucosa intestinal o que somado a presença do biofilme e da cobertura das microvilosidades pelas bactérias interfere na absorção promovendo então quadros de diarreia.
	Produzem toxinas East1 (promove o aumento de H2O e de eletrólitos no lúmen), Pet (altera o citoesqueleto dos enterócitos) e Pic (in vitro destrói muco – mucinase- in vivo não tem a ação bem definida).
	EAECs também causam diarreia do lactente, principalmente em países subdesenvolvidos, apresentando diarreias persistentes (14 dias) e com muito muco.
ETEC
	A E. coli Enterotoxigênica é produtora de duas toxinas: Toxina termoestável (ST) pertencente ao grupo I das exotoxinas, sendo, portanto, um superantígeno; e a Toxina termolábil (LT) que pertence ao grupo III das exotoxinas, sendo assim uma toxina AB (a porção B adere a receptores específicos do hospedeiro e a porção A exerce a atividade tóxica).
	As ETECs aderem a muco intestinal, colonizam e passam a produzir toxinas, as toxinas (principalmente a ST) alteram a produção de GMPc que altera o equilíbrio hidrossalino do lúmen, resultando na secreção de eletrólitos o que acarreta baixa absorção de H2O, promovendo assim quadros de diarreia aquosa.
	ETECs podem causar: diarreia do viajante e diarreia do lactente em países subdesenvolvidos. Principais sintomas: diarreia aquosa, vômitos, cólicas, náuseas e febre baixa.
EIEC
	A E. coli Enteroinvasora é parecidíssima com a Shigella sendo diferenciada apenas pela dose infectante (EIEC – 106, Shigella – 10 bactérias, a Shigella é muito resistente a acidez gástrica). Causa doenças em países subdesenvolvidos muito parecidas com a shigelose; sendo mais frequente em crianças maiores de 2 anos e em adultos. Sintomas: cólicas, febre, diarreia aquosa podendo progredir para fezes sanguinolentas com muco e de pequeno volume, e até mesmo desinteria (inflamação do epitélio intestinal).
	A ETEC força a fagocitose utilizando a invasina, ao adentrar a célula ela escapa do endossomo e se multiplica no citoplasma. Quando há competição por espaço as bactérias migram para células vizinhas, a invasão lesa tecidos, e por isso pode haver presença de sangue nas fezes. Algumas ETECs podem ser produtoras de Shiga; PORÉM ISTO NÃO É COMUM! 
DAEC
	A E. coli difusamente aderente provoca diarreia em crianças de 1 a 5 anos, sua principal caraterística é o padrão de adesão difuso em células HeLa ou HEp-2.
	Entretanto, mesmo sem cobrir totalmente as microvilosidades sua presença interfere na absorção de H2O causando diarreias.
Tratamento: HIDRATAÇÃO (para recém-nascidos a hidratação é feita obviamente com leite materno) e recomposição da microbiota. Antimicrobianos somente devem ser utilizadosem casos de pacientes imunossuprimidos, em quadros de diarreia persistente ou em casos de bactérias produtoras de toxinas (principalmente a de shiga).	
Enterobactérias: Gêneros Salmonella e Shigella
	São gêneros de extrema importância em quadros de diarreia, sendo que uma das espécies de Salmonella é responsável pela febre tifoide. 
	Salmonella (é móvel) e Shigella (é imóvel) são bactérias intracelulares facultativas, entretanto, preferem o meio intracelular pois assim podem escapar do sistema imune e facilitar a translocação bacteriana. Após aderir ao epitélio intestinal estas bactérias ejetam invasinas induzindo a fagocitose por enterócitos.
Salmonella
A Salmonella tem uma proteína que protege o endossomo, impedindo a fusão do lisossomo com o endossomo (impede a digestão intracelular). Esta proteína é liberada pela bactéria após uma pequena queda do pH no interior do endossomo promovido pela fusão de poucos lisossomos; uma vez que o endossomo esteja “blindado” ela se multiplica em seu interior. 
São móveis, possui flagelos peritríquios, forma ácido e algumas vezes gás a partir da fermentação de açucares (ex. glicose), força a fagocitose (invasina) – fagocitose em ondas- não fermenta a Lactose, porém, existem algumas sepas que possuem o plasmídeo Lac+ (são raras, mas existem), produzem H2S o que faz com que a semeadura desta bactéria em ágar SS resulte em uma região enegrecida. 
Ágar SS Ágar seletivo para Salmonella e Shigella, além de ser seletivo é diferencial pois escurece na presença de H2S produzida pela Salmonella.
Existe 2500 sorotipos de Salmonella, é importante lembrar que na sorotipagem da Salmonella o antígeno K recebe o nome de Vi!
Enterobactérias do gênero Salmonella afetam apenas animais de sangue quente!
Ex: Salmonella Typhi adaptada e restrita ao ser humanoTrata-se de subespécies!
Salmonella Typhimurium pode afetar o homem, bovinos e camundongos.
Classificação e Nomenclatura da Salmonela
Classificação atual baseada em estudos moleculares
90% das infeções humanas são causadas por subespécies da espécie S. entérica. Dentro da espécie S. entérica então concentrados a maioria das espécies patogênicas para animais e homens (2.500 espécies).
Dizer S. entérica II é o mesmo que dizer: Salmonella Salamae é uma subespécie da Salmonella entérica.
A tabela de classificação de Kauffmann e White é utilizada apenas para a subespécie entérica e divide as Salmonellas em sorotipos baseando-se nos antígenos O, flagelar (H) e capsular (Vi)
	
	O antígeno O é representado em números arábicos, o Vi é um soro tipo presente em S. Typhi, S. Paratyphi C e S. Dubin; o antígeno flagelar pode ocorrer em duas fases, sendo que a fase 1 é representada por letras do alfabeto minúsculas e a fase 2 é representada por números arábicos. O Z é um expoente número utilizado quando “se acabam” as letras.
	Na rotina utuliza-se o esquema de Kauffmann e White que divide as Salmonellas em sorotipos tendo por base a composição antigênica das Salmonellas em relação aos seus antígenos somáticos O, flagelar (H) e capsular (Vi).
	Subespécies mais comumente encontradas: S. Typhi causando a febre tifoide, S. Typhimurium causando a febre paratifoide (uma forma mais branda da febre tifoide).
	As subespécies de S. entérica podem ser divididas em 3 grupos:
Causadoras de gastroenterite: S. Typhimurium e similares;
Causadoras de febre tifoide e paratifoide: S.Typhi, S. Paratyphi e S. Typhimurium, estas subespécies são capazes de se disseminar e se instalar em órgãos além do intestino;
Causadores de gastroenterites acompanhadas de bacteremia: S. Dublin, S. Chaloraesuis e outras, estas subespécies são capazes de se disseminar, porém não são capazes de se instalar em órgãos além do intestino.
Identificação laboratorial da Salmonella
	A partir das fezes existem 3 opções que podem ser postas em prática: a) por a amostra em caldo tetrationato (um meio de enriquecimento favorável para Salmonella e Shigella), seguido de Ágar SS, Rugai ou EPM Mili e soroaglutinação; b) semear a amostra diretamente em ágar McConkey e depois no Rugai ou EPM Mili seguido de sorotipagem ou ainda c) semear diretamente em Ágar SS seguido de Rugai ou EPM Mili e sorotipagem.
	O problema das opções B e C onde a amostra é semeada diretamente em SS ou McConkey é que pode crescer tanta E. coli e outras espécies intestinais que a Salmonella pode ficar “escondida” ali no meio. Em casos onde não se tem o caldo tetrationato a identificação visual de colônias facilita o andamento do exame.
Diagnóstico da Febre tifoide e paratifoide
 	Reação de Widal pesquisa de anticorpos circulantes anti-O, anti-H e anti-Vi da Salmonella no soro do paciente.
	Título de anti-O é SUGESTIVO de S. Typhi, sugestivo pois existem outras Salmonellas que possuem o antígeno O.
	Título de anti-H - podem existir reações cruzadas – difícil interpretação.
	Título de anti-Vi - eficaz quando contabilizado de 3 a 4 semanas do início da doença, sendo de pouca utilidade no diagnóstico precoce. Muito utilizado para a sugestão de S.Typhi, S. Paratyphi e S. Dublin.
	O isolamento do microrganismo é o diagnóstico definitivo, sendo que o quadro clínico + reação de Widal + isolamento fecham o diagnóstico.
	Quadros clínicos que a Salmonella pode causar: gastroenterite (neste caso a pesquisa por microrganismos deve ser feita a partir das fezes), febre entérica ou tifoide (apresenta hemocultura positiva apenas nas primeiras semanas da doença, a contagem se inicia a partir do primeiro dia de febre) e sepse (pesquisa por microrganismos feita a partir de amostra de sangue que deve ser colhido no pico da febre, antes da administração de antibióticos).
	Gastroenterite quadro acarretado por bactérias não tifoides, ocorre devido a contaminação por via oral, as bactérias não tifoides atravessam a barreira ácida do estômago, aderindo-se e colonizando o intestino. Contaminação frequente for frango, maionese, salsicha... 
	Um quadro frequente em situações de gastroenterite são as diarreias com destruição das camadas superficiais da mucosa intestinal, sendo, portanto, diarreias inflamatórias geralmente auto delimitadas. Quadros como este podem resultar em bacteremia em indivíduos imunossuprimidos. 
	Recém-nascidos e idosos são mais susceptíveis, altas taxas de mortalidade em RN são associadas a esta bactéria. Indivíduos contaminados por Salmonella secretam bactérias nas fezes durante 4 – 5 semanas, gerando um enorme problema de saúde pública.
	A Salmonella possui um ciclo onde inicialmente se encontra no intestino, passa para o sangue e outros tecidos e volta para o intestino. A bactéria pode persistir na vesícula biliar por anos e o portador libera bactérias nas fezes. PROBLEMA DE SAÚDE PÚBLICA.		
	 Shigella -TOXINA DE SHIGAAAAAAA
	Infecta principalmente o homem e alguns primatas causando shigelose ou desinteria bacilar. Raramente ocorre em animais. Existe 4 espécies patogênicas S. dysenteriae, S. flexneri, S. baydii e S. sonnei. Alguns autores não diferenciam a, S. baydii e S. sonnei da E. coli enteroinvasora. 	
	Bactérias do gênero Shigella são imóveis, não possuem flagelos! Podem aparecer como cocobacilos em lâminas, causam intensa destruição do epitélio intestinal devido a toxina de shiga! Fezes com sanguinolentas (melena) e intensa inflamação intestinal são os sintomas clássicos desta condição. 
	É comum visualizar na lâmina de fezes de indivíduo infectado com Shigella MUITOS neutrófilos devido ao pus da inflamação. Um dos grandes problemas do Gênero Shigella é sua baixíssima dose infectante, sendo que apenas 10 bactérias são suficientes para estabelecer a infecção.
	 A shigelose é caracterizada por quadros de diarreia. A desinteria bacilar clássica é caracterizada pela destruição do epitélio intestinal devido à alta produção de toxina de shiga, o que em crianças pode acarretar quadros de convulsões pois trata-se de uma toxina hidrossolúvel que uma vez nosangue pode promover o aumento da temperatura corpórea, síndrome hemolítica e diversos outros estados patológicos.
	A amostra com suspeita de infecção por Shigella deve ser processada rapidamente pois o baixo Ph das fezes pode matar as bactérias.
Identificação laboratorial da Shigella
	A partir das fezes existem 3 opções que podem ser postas em prática: a) por a amostra em caldo tetrationato (um meio de enriquecimento favorável para Salmonella e Shigella), seguido de Ágar SS, Rugai ou EPM Mili e soroaglutinação; b) semear a amostra diretamente em ágar McConkey e depois no Rugai ou EPM Mili seguido de sorotipagem ou ainda c) semear diretamente em Ágar SS seguido de Rugai ou EPM Mili e sorotipagem.
	O problema das opções B e C onde a amostra é semeada diretamente em SS ou McConkey é que pode crescer tanta E. coli e outras espécies intestinais que a Shigella pode ficar “escondida” ali no meio. Em casos onde não se tem o caldo tetrationato a identificação visual de colônias facilita o andamento do exame. A sorotipagem da Shigella é feita apenas pelo antígeno O pois a Shigella não possui flagelo!
	É importante lembrar que a Shigella é fermentadora de glicose, porém, não produz gás nem H2S.
S. sonnei é a causa mais comum de shigelose, não costuma produzir shiga.
S. dysenteriae é mais virulenta, produz shiga, sendo mais comum em países subdesenvolvidos, provoca a desinteria bacilar clássica.
A transmissão de espécies de Shigella é por via oral/fecal, sendo comum a transmissão por homossexuais. Surtos endêmicos podem ocorrer em creches, berçários e instituições de custódia.
A patogênese pode ser:
Invasão celular: fagocitose em zíper/ disparo (induzida por invasina);
Multiplicação: escapa do endossomo e se multiplica no citoplasma;
Disseminação intra e intercelular;
Morte celular.
Assim como a Salmonella, a Shigella “adora” uma célula M (armadilha do sistema imunológico), pois através da célula M a bactéria é fagocitada por macrófagos e levada para vários locais do corpo onde podem se instalar.
Desinteria bacilar clássica condição toxêmica, com diarreia aquosa, febre, fezes com muco, sangue etc. Antibióticoterapia é indicada não apenas para o paciente, mas sim para toda a família imediata.
A bacteremia não é provocada pela Shigella (que raramente se dissemina de forma sistêmica) e sim por outros bacilos G-, em função da ruptura da barreira intestinal pela toxina de shiga. Complicações: megacólon tóxico e perfuração intestinal.
AS FAMÍLIAS ENTEROBACTERIACEAE E VIBRIONACEAE
Gêneros yersinia e vibrio
Yersinia
	É um patógeno primário, conhecido por causar peste bubônica (Y. pestis), outra espécie bastante frequente é a Yersinia enterocolítica, muito comum em bolsas de concentrado de hemácias uma vez que estas são armazenadas a 4ºC temperatura ótima para o crescimento de Yersinia enterocolítica.
	É uma zoonose, portanto, o homem é hospedeiro acidental, a Yersinia é transmitida ao homem por meio da picada de pulgas de ratos infectados. É uma das poucas bactérias transmitidas por vetor.
Y. pestis possui duas formas de infecção, a peste urbana (reservatórios naturais e ratos) e a peste silvestre (onde os reservatórios são esquilos, coelhos, gado, ratos selvagens, javalis etc). Esta espécie pode causar peste bubônica e a peste pneumônica.
Y. enterocolítica reservatórios são porcos, roedores, animais domésticos etc. Esta espécie pode causar enterocolite, pseudo-apendicite, bacteremia e choque tóxico (por ser G- possui LPS).
Y. pseudotuberculosis reservatórios são roedores e animais silvestres. Esta espécie pode causar enterocolite.
	É comum observar ferida e até mesmo necrose no local da picada.
	Se a bactéria atingir a circulação sistêmica pode causar peste septicêmica, hemorragias e necrose disseminadas e até mesmo meningite!
	Diagnóstico para peste bubônica ou peste negra
Gram: revela a aparência típica de um alfinete de frauda;
McConkey: olho de boi, é lac – mas o centro é rosado;
Ágar sangue
Ágar CIN: seletivo para Yersinia.
A Yersinia é mais lenta no crescimento do que outras bactérias.
Enterocolite - Infecção através de água contaminada, dura de 1 a 10 dias, diarreia, febre, dor abdominal tão intensa que se confunde com apendicite (pseudo-apendicite). A forma crônica pode resultar de infecções por meses. É possível observar infecção no íleo + aumento de linfonodo (difícil distinguir de apendicite). Provoca choque endotóxico.
O diagnóstico é feito por Ágar McConkey e CIN assim como ocorre o diagnóstico para peste bubônica.
Para isolar a Yersinia enterocolítica a amostra de fezes deve ser colocada em salina e incubada a 4ºC por 2 semanas e posteriormente semeada em diferentes meios de cultura.
Vibrio
Causa cólera – diarreia MUITO aquosa!
As espécies da família Vibrionaceae crescem no McConkey, são oxidase +, o teste da OF de glicose é + (dois tubos amarelos, fermentam e oxidam a glc), são bacilos G- curvos na lâmina, parecem uma vírgula. São anaeróbios facultativos.O NaCl é o que diferencia os 3! Sendo de extrema importância, pois os três gêneros possuem as mesmas características, causam as mesmas doenças, porém o Vibrio é halófilo, ou seja, ele é o único que cresce em meios ricos em sal.
Vibrio
Aeromonas	
Plasiomonas
Infecções de feridas quando em contato com água salgada (praias) = infecção por Vibrio!
	O Ágar seletivo para Vibrio é o TCBS, um ágar hipertônico, seletivo e diferencial! Quando na presença de Vibrio cholerae, uma espécie que fermenta a sacarose (espécie que causa cólera), o ágar se torna amarelo, quando na presença de Vibrio parahaemoluticus, uma espécie que não fermenta a sacarose (espécie que infecta feridas) o ágar se torna verde. Após a determinação da espécie a sorotipagem deve ser feita dando atenção maior aos sorogrupos O1 e O139 pois estes produzem a toxina colérica.
	É comum em quadros de cólera com presença da toxina colérica a observação de fezes água de arroz devido a desidratação intensa. 
	Vibrios poduzem quitinase (quebra quitina) o que possibilita a adesão em peixes, crustáceos e moluscos, é comum a infecção por Vibrio vulnificus após o consumo de ostras cruas (esta espécie pode infectar feridas também). O Vibrio vulnificus possui cápsula o que possibilita a infecção disseminada por dificultar a fagocitose.
Vibrio parahaemoluticus gastroenterite, infecções de feridas em contato com água do mar.
Vibrio vulnificus e V. cholearae não O1 produzem cápsula
Vibrio cholearae e Vibrio parahaemoluticus tem 2 cromossomos – diploides
Plasmídeos de resistência são frequentemente encontrados.