AMPLIFICACAO IN VITRO

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<p>Amplificação in vitro de DNA</p><p>Técnicas de amplificação e detecção de ácidos nucleicos in vitro e introdução de suas aplicações em</p><p>rotina laboratorial.</p><p>Prof.ª Camila Freze Baez</p><p>1. Itens iniciais</p><p>Propósito</p><p>Compreender a teoria por trás da amplificação de ácidos nucleicos in vitro em suas diferentes formas e</p><p>entender quais são suas vantagens, desvantagens e aplicações em contextos diversos é importante para o</p><p>profissional de laboratório, pois lhe fornecerá poderosa ferramenta de trabalho.</p><p>Objetivos</p><p>Reconhecer elementos fundamentais à amplificação de ácidos nucleicos in vitro.</p><p>Diferenciar as variações entre cada técnica de PCR.</p><p>Identificar aplicações apropriadas ao uso de cada método.</p><p>Introdução</p><p>Os ácidos nucleicos são as estruturas fundamentais que carregam informações genéticas. Você já parou para</p><p>pensar como certas características físicas passam dos pais para os filhos? Traços físicos como formato do</p><p>rosto, altura, cor da pele e dos olhos são traduções de informações transmitidas às gerações futuras dos</p><p>ácidos nucleicos. No corpo humano e na maioria dos seres vivos, encontramos dois tipos de ácidos nucleicos:</p><p>o ácido desoxirribonucleico (ADN – também conhecido pela sigla em inglês, DNA), e o ácido ribonucleico</p><p>(ARN, ou RNA, em inglês).</p><p>Cada uma dessas moléculas – DNA e RNA – tem funções diferentes dentro da menor unidade viva conhecida</p><p>— a célula. O DNA possui fita dupla, sendo mais estável e resistente que o RNA. Por isso, a célula utiliza o DNA</p><p>para armazenar as informações genéticas em longo prazo. Já o RNA, normalmente, em fita simples e mais</p><p>instável, tem como principal função intermediar a informação entre o DNA e as unidades efetoras da maioria</p><p>das funções celulares, as proteínas.</p><p>Formato do rosto e altura, por exemplo, são decorrentes da estrutura óssea que, em grande parte, é feita de</p><p>proteínas. O papel das proteínas não se limita apenas em traços físicos, mas também em funcionais.</p><p>Mas o que isso tem a ver com a amplificação de ácidos nucleicos?</p><p>Em uma célula viva e saudável, as enzimas fazem toda a amplificação do DNA por conta própria em um</p><p>ambiente extremamente complexo e controlado – do pH e nível de oxigênio disponível, ao momento que a</p><p>célula está em seu ciclo de vida. São dezenas de enzimas envolvidas na síntese de novas moléculas de DNA,</p><p>tantas que os cientistas ainda não compreendem completamente todas as etapas envolvidas nesse processo.</p><p>Apesar de toda a complexidade da duplicação do DNA in vivo, já somos capazes de sintetizar pequenos</p><p>trechos do DNA em um tubo de ensaio.</p><p>Incrível, não? Vamos ver com detalhes como isso é possível neste material.</p><p>Dogma central da Biologia Molecular: DNA replica-se em DNA e é transcrito em</p><p>RNA, que é traduzido em proteína.</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>1. Elementos fundamentais à amplificação de ácidos nucleicos</p><p>Princípios da PCR concencional</p><p>Para entendermos como funciona a amplificação de DNA in vitro, devemos primeiro relembrar algumas</p><p>informações sobre o DNA e o RNA: suas funções, composições, similaridades e diferenças. Tanto o DNA</p><p>quanto o RNA são formados por nucleotídeos, que são como os tijolos dos ácidos nucleicos e,</p><p>consequentemente, do material genético. A partir da junção de tais tijolos, formamos as estruturas de DNA e</p><p>RNA. Mas como são esses tijolos?</p><p>Em primeiro lugar, os nucleotídeos contêm um açúcar chamado ribose. Essa ribose é uma das formas mais</p><p>simples dos carboidratos – a forma mais conhecida de um açúcar simples é a glicose. É na ribose que reside a</p><p>principal diferença entre DNA e RNA: o RNA possui uma molécula de oxigênio ligada ao segundo carbono da</p><p>ribose que o DNA não possui – por isso, o DNA é chamado de desoxirribonucleico.</p><p>O segundo componente são as bases nitrogenadas. Para o DNA, existem quatro tipos diferentes de bases</p><p>nitrogenadas:</p><p>Desoxirribonucleico</p><p>Prefixo “des” significa a ausência (como em desinteresse), portanto, “desoxi” representa o oxigênio que</p><p>está ausente.</p><p>Adenina (A) Citosina (C)</p><p>Guanina (G) Timina (T)</p><p>Para o RNA há uma diferença:</p><p>No RNA as bases nitrogenadas A, C e G são as mesmas, mas, em vez de T, existe uma Uracila (U).</p><p>Essas bases são as responsáveis pela informação genética.</p><p>Imagine escrever um texto codificado, tão complexo quanto um ser humano, usando apenas uma das letras do</p><p>teclado do computador. Como seria possível entender a informação que você quis codificar? Agora, se você</p><p>escrever um texto com pelo menos duas letras (ou números) do teclado, usará um código binário. Isso</p><p>também acontece com a informação genética: a célula utiliza essas cinco bases nitrogenadas para codificar,</p><p>em sequência, uma informação preciosa.</p><p>Finalmente, os nucleotídeos possuem grupamentos fosfatos no quinto carbono da (desoxir)ribose, que são</p><p>capazes de interagir com a hidroxila (álcool orgânico) presente no terceiro carbono da (desoxir)ribose,</p><p>fazendo a ligação entre um nucleotídeo com o próximo. Essa ligação é conhecida como fosfodiéster, sendo</p><p>considerada o “cimento” dos nossos “tijolos”: a partir dela, longas sequências de DNA ou RNA são formadas. É</p><p>importante manter em mente que o grupamento fosfato confere carga negativa à molécula de DNA – vamos</p><p>voltar a falar a respeito disso mais à frente.</p><p>Código binário</p><p>Formado por sequências de 0 e 1 que, em trechos longos, podem codificar informação, como</p><p>computadores.</p><p>Esquema da estrutura básica dos desoxirribonucleotideos, compostos por fosfato,</p><p>desoxirribose e base nitrogenada.</p><p>A interação entre a hidroxila no carbono 3 da (desoxir)ribose e o fosfato de outro nucleotídeo no carbono 5</p><p>deixam as bases nitrogenadas livres para interação com outras bases nitrogenadas, normalmente, do tipo</p><p>oposto. As principais bases nitrogenadas (A, T, C, G, U) são divididas em dois grupos químicos, de acordo</p><p>com o número de anéis aromáticos que possuem:</p><p>Pirimidinas</p><p>(C, T, U) - Possuem um anel.</p><p>Purinas</p><p>(A, G) - Possuem dois anéis.</p><p>As bases interagem entre si, mas entre grupos opostos: ou seja, pirimidinas pareiam com purinas, de acordo</p><p>com as cargas livres de cada base. Desse modo, A interage com T, pois ambas têm duas cargas livres para</p><p>interação, e C interage com G através de três cargas. Essas interações são chamadas de pontes de hidrogênio</p><p>e são consideradas fracas por serem facilmente quebradas por agentes físicos, como a temperatura, e</p><p>químicos, como o pH.</p><p>Veja o esquema mostrando a estrutura do DNA e o pareamento das bases por complementariedade. Note as</p><p>pontes de hidrogênio duplas (seta verde) entre adenina e timina, e as triplas (seta preta) entre citosina e</p><p>guanina.</p><p>Pareamento de bases nitrogenadas.</p><p>No entanto, essas pontes de hidrogênio são importantes para manter a sequência de DNA livre de erros e</p><p>garantem à molécula uma de suas características fundamentais: a complementariedade. É a partir dessa</p><p>complementariedade que as enzimas responsáveis pela síntese do DNA e do RNA, as polimerases, sabem qual</p><p>nucleotídeo adicionar para manter a mesma mensagem na hora de duplicar o DNA. Ao mesmo tempo, é a</p><p>característica que dá ao DNA seu formato em fita dupla. Chamamos essa característica de replicação</p><p>semiconservada.</p><p>Semiconservada</p><p>Uma fita original (fita parental) é mantida na duplicação, como molde para a síntese da fita nova (fita</p><p>filha).</p><p>Atenção</p><p>Se olharmos para essa fita dupla em um sentido único, da esquerda para a direita, por exemplo, veremos</p><p>que uma das fitas se encontra com o carbono 5 da desoxirribose livre na extremidade à esquerda,</p><p>enquanto a outra fita tem o carbono 3 da desoxirribose livre à esquerda. Isso acontece porque, para</p><p>interagirem, as duas fitas precisam estar em sentidos opostos – por isso, nós as chamamos de fitas</p><p>antiparalelas. Esse sentido de interação por complementariedade traz à tona outra característica do</p><p>DNA: sua replicação deve ser feita de forma semidescontínua (In vivo, apenas a fita no sentido</p><p>antiparalelo (3’→5’) é lida de forma contínua, e a fita de DNA molde no sentido paralelo (5’→3’) é lida de</p><p>forma descontínua. Isso acontece por causa do sentido de abertura da forquilha de replicação).</p><p>Reação em cadeia</p><p>Vimos que a amplificação de DNA in vitro é feita pela reação em cadeia da polimerase, em que a variação</p><p>cíclica de temperatura permite a desnaturação, o anelamento e a extensão de sequências-alvo específicas, de</p><p>acordo com aquelas que desejamos detectar. Como estudado, os oligonucleotídeos iniciadores se ligam à fita</p><p>simples de DNA que foi aberta por desnaturação por complementariedade entre as bases nitrogenadas. Essas</p><p>últimas são elementos fundamentais dos nucleotídeos por conterem a informação genética.</p><p>As variações da PCR são úteis de diferentes formas, e devemos conhecê-las para podermos escolher qual a</p><p>melhor técnica para cada caso: para aumentar a quantidade final de DNA-alvo amplificado; para síntese de</p><p>cDNA a partir de RNA polaridade positiva; para quantificação de DNA ou cDNA; e para diferenciação rápida</p><p>entre diferentes produtos de amplificação.</p><p>Além disso, aprendemos algumas das diversas aplicações que a PCR e as suas variações têm em áreas da</p><p>ciência, como na forense, na pesquisa e na clínica, participando do diagnóstico, acompanhamento e</p><p>prognóstico.</p><p>Agora você está pronto para continuar progredindo no conhecimento da Biologia Molecular, uma área</p><p>empolgante e que se torna, a cada dia, mais importante para diversas áreas das ciências biológicas.</p><p>Podcast</p><p>Para encerrar, ouça um resumo dos aspectos mais relevantes deste conteúdo.</p><p>Conteúdo interativo</p><p>Acesse a versão digital para ouvir o áudio.</p><p>Explore +</p><p>Confira as indicações que separamos especialmente para você!</p><p>Acesse o conteúdo de Biologia DNA como o material genético: Replicação do DNA no portal da Khan</p><p>Academy, para mais detalhes e vídeos sobre replicação do DNA.</p><p>Assista ao vídeo 4. Teste de Paternidade, de Carlos Simeão, no Youtube. Você aprenderá mais sobre a</p><p>variabilidade genética estudada em análises forenses e em testes de paternidade.</p><p>Assista ao vídeo Técnicas de Biologia Molecular – PCR- Animação 3D, de Carlos Simeão, no Youtube.</p><p>Você irá conhecer o passo a passo da técnica de PCR.</p><p>Para conhecer mais sobre a história do PCR, leia o texto O desenvolvimento da reação em cadeia pela</p><p>polimerase (PCR).</p><p>Para conhecer mais sobre as técnicas de PCR, leia Outras aplicações da PCR e as suas variações.</p><p>Referências</p><p>ASSOCIAÇÃO BRASIL HUNTINGTON. O que é a Doença de Huntington. ABH. Consultado na internet em: 18</p><p>out. 2020.</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>CABELLO, G. M. K. Genética Clínica: Métodos de diagnóstico. DBBM FIOCRUZ. Consultado na internet em: 18</p><p>out. 2020.</p><p>DOLINSKY, L. C.; PEREIRA, L. M. C. V. DNA forense: Artigo de revisão. Saúde & Ambiente em Revista, 2(2), p.</p><p>11-22, 2007.</p><p>NELSON, D. L. Princípios de bioquímica de Lehninger. Porto Alegre: Artmed, 2014.</p><p>NEW ENGLAND BIOLABS’ FEATURE ARTICLES. Polymerase Fidelity: What is it, and what does it mean for your</p><p>PCR? NEB. Consultado na internet em: 18 out. 2020.</p><p>REAL-TIME PCR BASICS. TaqMan vs. SYBR Chemistry for Real-Time PCR. ThermoFisher Scientific website.</p><p>Consultado na internet em: 18 out. 2020.</p><p>VANDESOMPELE, J. Q. PCR Guide por Eurogentec – plataforma GenEx. Gene Quantification. Consultado na</p><p>internet em: 18 out. 2020.</p><p>ZHAO, M.; et al. Improved high sensitivity screen for Huntington disease using a one-step tripletprimed PCR</p><p>and melting curve assay. PLoS ONE. Consultado na internet em: 18 out. 2020.</p><p>Amplificação in vitro de DNA</p><p>1. Itens iniciais</p><p>Propósito</p><p>Objetivos</p><p>Introdução</p><p>1. Elementos fundamentais à amplificação de ácidos nucleicos</p><p>Princípios da PCR concencional</p><p>Adenina (A)</p><p>Citosina (C)</p><p>Guanina (G)</p><p>Timina (T)</p><p>Pirimidinas</p><p>Purinas</p><p>Atenção</p><p>Reação em cadeia pela polimerase: amplificando DNA in vitro</p><p>Complementariedade entre fitas antiparalelas</p><p>Síntese enzimática pela polimerase</p><p>Etapas da reação em cadeia da polimerase</p><p>Desnaturação</p><p>Anelamento</p><p>Atenção</p><p>PCR qualitativa</p><p>PCR quantitativa</p><p>Eletroforese em gel de agarose: separando e revelando o resultado</p><p>Dica</p><p>PCR e eletroforese</p><p>Conteúdo interativo</p><p>Vem que eu te explico!</p><p>Reagentes necessários a uma reação em cadeia da polimerase (PCR)</p><p>Conteúdo interativo</p><p>Como ocorre a amplificação exponencial do DNA-alvo</p><p>Conteúdo interativo</p><p>Diferenças entre PCR qualitativa e quantitativa</p><p>Conteúdo interativo</p><p>Verificando o aprendizado</p><p>2. Variações entre cada técnica de PCR</p><p>Variações da técnica de PCR</p><p>Dica</p><p>Reação de transcrição reversa</p><p>Primeiro caso</p><p>Segundo caso</p><p>Terceiro caso</p><p>Nested-PCR</p><p>Saiba mais</p><p>PCR quantitativo em tempo real – qPCR</p><p>Exemplo</p><p>SYBR Green</p><p>Quantificação absoluta por SYBR</p><p>Conteúdo interativo</p><p>TaqMan</p><p>Quantificação</p><p>Configuração do aparelho</p><p>Detecção de ruído</p><p>Definição do limiar</p><p>Pela curva padrão</p><p>Linearidade da curva</p><p>Eficiência de amplificação</p><p>Por quantificação relativa, ou método de delta-delta-CT (ou ΔΔCt)</p><p>Atenção</p><p>PCR em multiplex</p><p>Vem que eu te explico!</p><p>Conhecendo nested-PCR</p><p>Conteúdo interativo</p><p>O que é e qual função de uma sonda TaqMan?</p><p>Conteúdo interativo</p><p>O que é valor de Ct (cycle threshold)?</p><p>Conteúdo interativo</p><p>Verificando o aprendizado</p><p>3. Aplicações apropriadas ao uso de cada método</p><p>Aplicações da PCR</p><p>A PCR e as suas variantes em ciências forenses</p><p>A PCR e as variações usadas no diagnóstico de doenças genéticas</p><p>Atenção</p><p>A PCR e as variações usadas no diagnóstico de doenças infecciosas</p><p>Exemplo</p><p>A PCR e as suas variantes em pesquisa científica</p><p>Quantificação relativa de genes por RT-qPCR e seu uso em pesquisa</p><p>Conteúdo interativo</p><p>Vem que eu te explico!</p><p>Diagnóstico molecular de covid-19 por PCR</p><p>Conteúdo interativo</p><p>A PCR e as variações usadas no diagnóstico de doenças genéticas</p><p>Conteúdo interativo</p><p>A PCR e as suas variantes em pesquisa científica (plasmídeos)</p><p>Conteúdo interativo</p><p>Verificando o aprendizado</p><p>4. Conclusão</p><p>Considerações finais</p><p>Podcast</p><p>Conteúdo interativo</p><p>Explore +</p><p>Referências</p><p>pela polimerase: amplificando DNA in vitro</p><p>Em uma célula viva, as enzimas polimerases têm ao seu dispor todos os itens necessários para duplicar o</p><p>DNA, de nucleotídeos a todas as enzimas.</p><p>Representação do complexo de replicação do DNA em uma célula.</p><p>Imagine quão complexo seria reproduzir o ambiente celular em um tubo de ensaio! Precisamos utilizar os</p><p>conhecimentos da físico-química do DNA e os princípios básicos de sua replicação para simplificação e</p><p>adaptação da técnica in vitro. Veja:</p><p>Complementariedade entre fitas antiparalelas</p><p>Primeira característica do DNA importante na sua replicação in vitro: as</p><p>bases nitrogenadas de uma fita interagem especificamente com as bases</p><p>correspondentes da outra fita (A-T, C-G) por meio de interações frágeis</p><p>que podem ser desfeitas pelo calor. Ao aquecermos a solução acima de</p><p>90ºC, podemos desfazer essas interações e abrir a fita dupla em duas</p><p>fitas simples. Isso deixa as bases nitrogenadas expostas para interagirem</p><p>e, ao abaixarmos a temperatura, conseguimos fazer com que a fita dupla</p><p>se refaça e a informação seja mantida. Vamos ver como esse processo</p><p>funciona passo a passo mais à frente.</p><p>Síntese enzimática pela polimerase</p><p>Segunda característica importante para a replicação do DNA in vitro.</p><p>Essa enzima lê cada base nitrogenada da fita simples como se fosse um</p><p>molde, e adiciona a base nitrogenada complementar na fita que está</p><p>sendo sintetizada através da ligação fosfodiéster. In vivo, a polimerase</p><p>não inicia a duplicação do DNA sozinha, pois ela não consegue abrir a fita</p><p>dupla em fitas simples, identificar o local certo de início de replicação ou</p><p>adicionar os primeiros nucleotídeos. A célula utiliza enzimas para abrir a</p><p>fita dupla, as helicases, e adição dos primeiros nucleotídeos é feita por</p><p>outra enzima, chamada primase.</p><p>Na amplificação do DNA in vitro, denominada reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction –</p><p>PCR), a abertura do DNA em fitas simples é feita através de calor. Para isso, utilizamos uma enzima</p><p>termorresistente chamada de Taq polimerase. Além disso, usamos pequenas sequências de nucleotídeos em</p><p>fitas simples e complementares à sequência-alvo do DNA a ser amplificado. Essas sequências sintéticas são</p><p>chamadas de iniciadores ou oligonucleotídeos (oligo = poucos), algo em torno de 20 nucleotídeos, conhecidos</p><p>como primers, em inglês.</p><p>Normalmente, são usados dois oligonucleotídeos por reação: um chamado senso, que se liga ao DNA molde</p><p>fita simples no sentido 3’→5’; e um antissenso, que se liga à fita no sentido 5’→3’.</p><p>Lembre-se de que o sentido de duplicação contínua do DNA ocorre apenas no sentido 5’→3’, pois o</p><p>trifosfato (na posição 5) do nucleotídeo livre dará a energia necessária à ligação fosfodiéster com o</p><p>carbono 3 da ribose do nucleotídeo que já estará na fita. Isso acontece em ambas as fitas (paralela</p><p>5’→3’ e antiparalela 3’→5’), e ambos os oligonucleotídeos são sintetizados em laboratório no sentido</p><p>5’→3’. Os oligonucleotídeos iniciadores irão demarcar a região do genoma a ser amplificada. Essa</p><p>informação é importante para dar especificidade à PCR!</p><p>Etapas da reação em cadeia da polimerase</p><p>Já compreendemos que a fita dupla de DNA se abre em duas fitas simples quando aquecida próximo a 100ºC,</p><p>e sabemos que a reação de síntese de novas fitas de DNA é feita por meio de uma enzima termorresistente</p><p>chamada de Taq polimerase. Também descobrimos que a enzima precisa de oligonucleotídeos iniciadores que</p><p>se ligam por complementariedade ao DNA-alvo desnaturado em uma fita simples. Agora, podemos entender</p><p>como essa última se desenvolve. Assim como em qualquer receita de bolo, uma PCR precisa de seus</p><p>ingredientes básicos – ou reagentes mínimos – para a síntese de DNA acontecer. Desse modo, adicionamos</p><p>esses ingredientes a um microtubo. Os reagentes mínimos necessários para a amplificação são:</p><p>O DNA molde, dupla fita, extraído a partir de amostras biológicas.•</p><p>Os oligonucleotídeos sintéticos que são complementares à região do DNA molde a ser amplificado.</p><p>A Taq polimerase, termorresistente.</p><p>Cátions de magnésio (Mg2+), cofator necessário ao funcionamento eficaz da polimerase.</p><p>Os desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs – dATP, dGTP, dCTP, dTTP) – lembre-se de que os</p><p>três fosfatos são usados como fonte de energia para que a reação fosfodiéster catalisada pela Taq</p><p>polimerase aconteça.</p><p>A água ultrapura, livre de contaminantes de DNA, RNA e de nucleases.</p><p>Esquema dos reagentes necessários a uma reação em cadeia da polimerase (PCR).</p><p>O microtubo com esses poucos reagentes é, então, submetido a diversos ciclos de elevação e redução da</p><p>temperatura do qual a PCR consiste. Vejamos:</p><p>A primeira etapa de qualquer PCR consiste na abertura da fita dupla de DNA em suas fitas simples pelo</p><p>aquecimento da reação a, pelo menos, 95ºC, por um tempo prolongado – algo em torno de 5 a 10</p><p>minutos. Esse tempo é necessário para abrir por completo as fitas de DNA que podem estar muito</p><p>concentradas, superenoveladas e ser muito longas.</p><p>Em seguida, começam os ciclos. Cada ciclo contém, pelo menos, 3 etapas: desnaturação, anelamento</p><p>e extensão.</p><p>Note na ilustração a desnaturação das fitas duplas de DNA em fitas simples, o anelamento dos iniciadores à</p><p>sequência-alvo por complementariedade e a extensão pela Taq polimerase.</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>1.</p><p>2.</p><p>Ilustração das etapas da PCR.</p><p>Entenda melhor como acontecem estas etapas:</p><p>Desnaturação</p><p>É a primeira etapa de cada ciclo em que a temperatura é aquecida a 95ºC por cerca de 1 minuto. O</p><p>tempo de desnaturação pode variar de acordo com cada reação e genoma. Por exemplo, genomas</p><p>ricos em CG precisam de tempo e temperatura maiores para desnaturar, pois C faz pontes triplas com</p><p>G, enquanto genomas ricos em AT precisam de tempos menores por possuírem ligações duplas.</p><p>Anelamento</p><p>Segunda etapa de cada ciclo. A temperatura será reduzida para cerca de 50 a 65ºC por,</p><p>aproximadamente, 30 segundos. Essa redução da temperatura deve ser feita com exatidão para que</p><p>os iniciadores se liguem especificamente à fita simples de DNA. Se a temperatura for baixa demais, a</p><p>fita se renatura e a PCR não acontece, ou ainda outros fragmentos do DNA extraído podem se ligar</p><p>inespecificamente e sua reação não funcionará apropriadamente. Se for alta demais, os</p><p>oligonucleotídeos se ligarão apenas parcialmente, ou até mesmo não se ligarão, e a eficiência da sua</p><p>reação será gravemente comprometida. Você pode estar se perguntando como saber exatamente a</p><p>temperatura a ser usada. A resposta certa dependerá de vários fatores, como o tamanho do seu</p><p>oligonucleotídeo, seu conteúdo de CG, e a concentração de sais no tampão de PCR. De modo geral,</p><p>quanto maior o tamanho e o conteúdo de CG, maior será a temperatura de anelamento.</p><p>Uma vez que os oligonucleotídeos tenham se anelado à fita de DNA molde, a Taq polimerase reconhecerá</p><p>esse local e fará a extensão da fita dupla. Como a Taq polimerase é termorresistente, a elevação da</p><p>temperatura a 95ºC não a destrói – na realidade, ela funciona melhor em temperaturas mais elevadas.</p><p>No caso da maioria das polimerases disponíveis comercialmente, a melhor temperatura de adição de</p><p>nucleotídeos em uma PCR é, em torno de 70ºC a 72ºC.</p><p>Atenção</p><p>O tempo de extensão depende da velocidade da polimerase usada e do tamanho da sequência entre os</p><p>oligonucleotídeos. Uma reação para amplificar menos de 500 pares de bases que utilize uma polimerase</p><p>com uma velocidade de incorporação de nucleotídeos mediana deve ter um tempo de extensão de 30 a</p><p>40 segundos.</p><p>Após o término da extensão, a reação é aquecida novamente a > 95ºC, para que as fitas duplas recém-</p><p>sintetizadas sejam separadas, e o ciclo desnaturação-anelamento-extensão se repita de 30 a 40 vezes. No</p><p>final, é recomendável ter um ciclo final de extensão maior para garantir que a síntese de todas as fitas seja</p><p>concluída. Após o término, a reação deve ser mantida refrigerada para preservar o material amplificado.</p><p>A PCR acontece em equipamentos que, como um ferro de passar, aquecem e resfriam rapidamente: os</p><p>termocicladores. Esses aparelhos foram um grande</p><p>avanço para as ciências biológicas e permitiram a grande</p><p>difusão da PCR em diversas áreas. Graças a eles, uma PCR convencional média dura de 1 hora e meia a 2h.</p><p>A cada ciclo, a quantidade de sequência-alvo – aquela contida entre os iniciadores senso e antissenso,</p><p>conhecida como amplicon (produto amplificado) – dobra. Dessa forma, se, no primeiro ciclo, tínhamos apenas</p><p>uma cópia de tal sequência (limite teórico da PCR), ao final do primeiro ciclo, teremos 2 cópias; no final do</p><p>terceiro ciclo, 4; depois, 8, e então 16, e assim sucessivamente.</p><p>A cada ciclo, vemos um aumento exponencial do número de cópias da sequência-alvo. Assim, no final de 30</p><p>ciclos, teremos algo na ordem de 1 bilhão de cópias da mesma sequência! Um número tão grande de uma</p><p>mesma sequência vai ser muito mais facilmente identificado posteriormente.</p><p>Esquema da amplificação exponencial do DNA-alvo por ciclo a partir de uma cópia,</p><p>em aparelho termociclador.</p><p>Via de regra, podemos subdividir a PCR em duas categorias:</p><p>PCR qualitativa</p><p>Todos os ciclos ocorrem em um termociclador</p><p>comum, precisa de etapas posteriores para</p><p>revelar o resultado. Nesse tipo, o resultado se</p><p>dá pela constatação da presença ou ausência</p><p>do produto alvo da amplificação. Abordaremos</p><p>alguns outros tipos de PCR que se encaixam</p><p>nessa categoria.</p><p>PCR quantitativa</p><p>Também conhecida como em tempo real. Os</p><p>ciclos se dão em um aparelho capaz de ler</p><p>automaticamente a amplificação e, assim, é</p><p>capaz de quantificar em tempo real. Existem</p><p>dois métodos que são mais comuns para a</p><p>quantificação. Nesse caso, não há necessidade</p><p>de revelação posterior à reação, o que a torna</p><p>mais rápida.</p><p>Eletroforese em gel de agarose: separando e revelando o resultado</p><p>Após a amplificação da sequência-alvo pela polimerase, temos um microtubo com nosso DNA amplificado em</p><p>um tampão de reação que é transparente como a água. Naturalmente, não podemos observar a olho nu o</p><p>resultado da reação: é necessário revelá-la. Para isso, precisamos manter em mente que, após uma PCR bem-</p><p>sucedida, temos uma sequência de DNA em um tamanho exato graças ao anelamento específico dos</p><p>oligonucleotídeos à sequência-alvo. Portanto, precisamos separar as sequências por tamanho para</p><p>verificarmos se o tamanho corresponde ao do nosso produto. Também vamos precisar de algo que revele a</p><p>localização do DNA, ou um agente revelador especial.</p><p>Dica</p><p>Para separar o DNA de acordo com seu tamanho, usamos uma espécie de malha gelatinosa chamada de</p><p>matriz ou gel de agarose.</p><p>Você deve estar familiarizado com a gelatina que fazemos na cozinha, certo? A agarose funciona de maneira</p><p>semelhante: é um polissacarídeo que se dissolve em líquido aquoso quando aquecido e, quando resfriado, se</p><p>solidifica, ou polimeriza. Ao polimerizar, a agarose forma uma malha com pequenos orifícios que permitirão a</p><p>passagem do DNA, de modo que moléculas menores de DNA passarão com maior facilidade e mais</p><p>rapidamente, enquanto moléculas maiores de DNA terão maior dificuldade de passar e, por isso, demorarão</p><p>mais tempo para viajarem pela malha. Assim, podemos separar as moléculas de DNA de acordo com tamanho.</p><p>Dependendo do tamanho do nosso DNA amplificado, poderemos usar uma malha mais fechada ou mais aberta</p><p>simplesmente variando a concentração da agarose que usamos para fazer o gel.</p><p>O DNA será inserido no gel de agarose através de pequenos orifícios chamados de poços, feitos com um</p><p>pente com pequenos dentes largos. Para podermos visualizar a passagem do tampão da PCR pelo gel de</p><p>agarose, usamos corantes como o azul de bromofenol, o qual é mais denso do que o tampão de corrida e faz</p><p>com que o DNA se assente no fundo do poço, o que é necessário para que a separação funcione</p><p>adequadamente.</p><p>Montagem de gel de agarose com uso de pentes para formação de poços e</p><p>aplicação do produto de PCR.</p><p>Uma vez que o gel de agarose esteja pronto e que o DNA tenha sido pipetado nos poços do gel com o corante</p><p>azul, podemos começar a eletroforese. Para a eletroforese, precisaremos ainda de uma cuba, ou recipiente</p><p>que contenha entradas para corrente elétrica, uma fonte elétrica e um tampão ionizável. A eletroforese parte</p><p>do princípio de que um tampão, quando submetido a uma corrente elétrica, tem suas moléculas ionizadas</p><p>migrando em direção a um dos polos: as moléculas negativas migram para o polo oposto, o cátodo, e as</p><p>moléculas positivas migram para o polo negativo, o ânodo.</p><p>No caso do DNA, seu grupamento fosfato lhe dá carga negativa, fazendo que o DNA migre para o polo</p><p>positivo (cátodo) quando em solução submetida à corrente elétrica. Como o DNA está no fundo do gel de</p><p>agarose graças ao corante mais pesado que o tampão eletroforético, ele passa por dentro da agarose e,</p><p>assim, será separado de acordo com seu tamanho pela trama do gel. Por sua vez, o corante azul, também de</p><p>carga negativa e de tamanho muito inferior à complexa molécula de DNA, migrará pelo gel mais rapidamente,</p><p>servindo apenas como marcador da velocidade de migração, e não da posição do DNA.</p><p>Representação esquemática de uma eletroforese em gel de agarose.</p><p>Para sabermos o tamanho e a posição do DNA, precisaremos de um marcador de tamanho molecular do DNA</p><p>que consiste em sequências de DNA de tamanhos conhecidos, como se fosse uma escada cujos degraus</p><p>representam os tamanhos. Ele é um parâmetro para estimarmos o tamanho das sequências de DNA que</p><p>amplificamos – coloquialmente, chamamos essas sequências em gel de agarose de bandas.</p><p>Também precisamos de um revelador da localização do nosso produto amplificado (ou amplicon) no gel de</p><p>agarose. Esse reagente, chamado de fluoróforo, é uma molécula capaz de fluorescer quando excitada no</p><p>comprimento de onda correto. Em gel de agarose, usamos fluoróforo que intercale especificamente com o</p><p>DNA. A molécula mais comumente utilizada é o brometo de etídio, capaz de se intercalar com qualquer fita</p><p>dupla de DNA. Sua capacidade de se ligar ao DNA o torna potencialmente tóxico, carcinogênico e</p><p>teratogênico, e precisamos manter nossa segurança e as boas práticas laboratoriais para evitar de nos</p><p>contaminarmos com ele.</p><p>Existem diversas formas de se utilizar brometo na revelação do gel, podendo ser adicionado antes</p><p>da solidificação do gel (antes da eletroforese) ou depois da eletroforese, com uma incubação extra.</p><p>Finalmente, o brometo de etídio é excitado no comprimento de onda ultravioleta em um</p><p>equipamento chamado transiluminador.</p><p>Ao ser excitado, o fluoróforo emite fluorescência e dá a localização das bandas de DNA amplificado de acordo</p><p>com o marcador de tamanho molecular.</p><p>Imagem de um gel de agarose e sua revelação por fluorescência do brometo de</p><p>etídio em luz ultravioleta.</p><p>Dependendo da técnica de PCR utilizada, assim como do objetivo da PCR, seu resultado pode ser uma única</p><p>banda de DNA no gel de agarose ou múltiplas bandas. Algumas vezes, resultados inesperados também podem</p><p>aparecer, como múltiplas bandas de DNA, onde apenas uma banda única era esperada.</p><p>Cada situação demandará a experiência e o conhecimento do profissional para interpretação e resolução de</p><p>possíveis problemas.</p><p>Existem alternativas ao uso do gel de agarose para separação de ácidos nucleicos. Um exemplo é o gel de</p><p>acrilamida/bisacrilamida, usado para separar sequências de DNA com alta resolução, de forma que bandas</p><p>com até um nucleotídeo de diferença em tamanho possam ser diferenciadas. O gel de acrilamida/bisacrilamida</p><p>também permite a separação de RNA e proteínas. No entanto, exige revelação por sistemas diferentes, mais</p><p>complexos, que nem todos os laboratórios possuem estrutura para execução.</p><p>Além de mais tóxica que a agarose, a montagem do gel e sua corrida eletroforética também são mais</p><p>trabalhosas. Desse modo, o gel de agarose corado por brometo de etídio é a técnica de revelação de PCR</p><p>mais utilizada.</p><p>PCR e eletroforese</p><p>Veja na prática a reação em cadeia pela polimerase.</p><p>Conteúdo interativo</p><p>Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.</p><p>Vem que eu te explico!</p><p>Os vídeos a seguir abordam os assuntos mais relevantes do conteúdo que você acabou de estudar.</p><p>Reagentes necessários a</p><p>uma reação em cadeia da polimerase (PCR)</p><p>Conteúdo interativo</p><p>Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.</p><p>Como ocorre a amplificação exponencial do DNA-alvo</p><p>Conteúdo interativo</p><p>Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.</p><p>Diferenças entre PCR qualitativa e quantitativa</p><p>Conteúdo interativo</p><p>Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.</p><p>Verificando o aprendizado</p><p>Questão 1</p><p>Vimos que a PCR é uma ferramenta molecular para amplificação do DNA in vitro. Sobre a PCR, é correto</p><p>afirmar que</p><p>A</p><p>a polimerase utilizada é capaz de adicionar todos os nucleotídeos necessários, de maneira inespecífica.</p><p>B</p><p>a especificidade da reação é por oligonucleotídeos iniciadores para demarcar a sequência e permitir que a</p><p>polimerase inicie a síntese.</p><p>C</p><p>a PCR ocorre de forma linear, ou seja, nenhuma etapa de variação de temperatura se repete.</p><p>D</p><p>a Taq polimerase é uma enzima sensível ao calor e deve ser adicionada a cada novo ciclo.</p><p>E</p><p>apenas nucleotídeos com hidroxilas no terceiro carbono da ribose são adicionados pela Taq polimerase.</p><p>A alternativa B está correta.</p><p>As DNA-polimerases são incapazes de reconhecer o local de início de replicação, sendo função das</p><p>primases a colocação dos primeiros nucleotídeos. Assim, precisamos usar iniciadores que se anelarão por</p><p>complementariedade específica à sequência-alvo desejada. O anelamento dos oligonucleotídeos permite o</p><p>reconhecimento pela polimerase, que sintetizará a fita dupla a partir do molde.</p><p>Questão 2</p><p>A PCR convencional contém diversas etapas, desde pipetagem da reação até sua leitura. Considerando as</p><p>etapas, leia as afirmativas a seguir e assinale a alternativa correta:</p><p>I - A temperatura de desnaturação deve ser alta o suficiente para separar as fitas duplas de DNA em fitas</p><p>simples.</p><p>II - A Taq polimerase é termorresistente e sua temperatura ótima de síntese de DNA é próxima a 70ºC.</p><p>III - Logo após a amplificação, podemos facilmente visualizar o resultado, pois se trata de reação</p><p>colorimétrica.</p><p>IV - Para identificarmos se nossa sequência-alvo foi amplificada, devemos separar as moléculas de acordo</p><p>com o tamanho, através de eletroforese em gel de agarose, e depois revelar, usando intercalantes de DNA</p><p>fluorescentes em ultravioleta.</p><p>V - A eletroforese usa a carga negativa do DNA para fazê-lo migrar através do gel em direção ao cátodo,</p><p>quando submetido à corrente elétrica.</p><p>A</p><p>Somente a afirmativa II está correta.</p><p>B</p><p>Somente as afirmativas I, II e III estão corretas.</p><p>C</p><p>Somente as afirmativas II, III, IV e V estão corretas.</p><p>D</p><p>Somente as afirmativas I, IV e V estão corretas.</p><p>E</p><p>Somente as afirmativas I, II, IV e V estão corretas.</p><p>A alternativa E está correta.</p><p>Na PCR, ocorre o aumento exponencial do número de fitas duplas de DNA correspondentes à sequência-</p><p>alvo. No entanto, esse aumento é invisível a olho nu e precisa ser revelado.</p><p>2. Variações entre cada técnica de PCR</p><p>Variações da técnica de PCR</p><p>Existem situações em que a PCR qualitativa e convencional pode não ser a técnica ideal para o nosso objetivo.</p><p>Podemos nos deparar com casos em que a concentração do DNA total da amostra é muito baixa, o que pode</p><p>limitar o uso do produto amplificado em outras aplicações, como o sequenciamento. Em determinadas</p><p>ocasiões, queremos saber o quanto de determinada sequência temos em nossas amostras. Em outras</p><p>situações, podemos estar interessados no produto da expressão de um determinado gene, e precisamos olhar</p><p>para o RNA mensageiro ao invés do DNA, já que os níveis de DNA de uma célula são mantidos constantes,</p><p>salvo raras exceções.</p><p>Dica</p><p>Como você pode ver, existem diversos outros interesses, e uma PCR convencional dará apenas a base</p><p>para que variações mais complexas, específicas e úteis sejam desenvolvidas, validadas e usadas.</p><p>Reação de transcrição reversa</p><p>Como já sabemos, a DNA polimerase é capaz de sintetizar uma nova fita de DNA a partir de uma fita de DNA</p><p>molde. Afinal, ela é uma DNA polimerase DNA-dependente. Mas, em muitas ocasiões, é necessário investigar</p><p>a expressão de um gene, ou até mesmo diagnosticar doenças causadas por vírus que não têm material</p><p>genético feito por DNA. Nesses casos, a molécula a ser detectada e quantificada indiretamente é o RNA. A</p><p>Taq polimerase, no entanto, não é capaz de reconhecer ou de adicionar nucleotídeos a riboses; ela só trabalha</p><p>com desoxirriboses.</p><p>Como conseguimos resolver esse problema?</p><p>Pelos organismos que conseguem sintetizar DNA a partir de RNA!</p><p>Assim como o SARS-CoV2, coronavírus causador da covid-19, existem outros vírus de genoma RNA. Os</p><p>primeiros vírus a serem estudados pela humanidade foram os de genoma RNA chamados de retrovírus. Esses</p><p>vírus têm algo de especial: a capacidade de inverter a ordem DNA → RNA → proteína do dogma central da</p><p>Biologia Molecular, usando uma enzima para sintetizar um DNA complementar (cDNA) ao seu genoma RNA.</p><p>Isso mesmo, os retrovírus usam o RNA de seu genoma como molde para síntese de DNA.</p><p>Os retrovírus possuem uma enzima capaz de sintetizar DNA a partir de RNA, cujo nome oficial é DNA</p><p>polimerase RNA-dependente. Corriqueiramente, ela é chamada de transcriptase reversa, ou TR, pois faz o</p><p>reverso da transcrição: sintetiza DNA a partir do RNA. Uma vez que os pesquisadores conseguiram isolar a TR,</p><p>ela passou a ser usada para reações in vitro. Na maioria dos casos, é usada uma TR purificada a partir de vírus</p><p>aviários, de forma que as TR não representam nenhum risco de infecção ao manipulador e são seguras para</p><p>diagnóstico e pesquisa.</p><p>Assim como uma reação pela polimerase, a reação de transcrição reversa (RT - usada daqui em diante para</p><p>designar a reação em si) precisa de alguns fatores elementares. O primeiro fator necessário é o RNA de</p><p>polaridade positiva (RNA+) de qualidade, o que requer muito cuidado na manipulação e extração do material.</p><p>Esse RNA é assim chamado por possuir o mesmo sentido de transcrição e tradução que um RNA mensageiro</p><p>(mRNA), mas expande o entendimento para vírus que nem sempre tem seu RNA+ diretamente traduzido na</p><p>célula, como os próprios retrovírus. Além do RNA+, a RT também precisará da enzima transcriptase reversa</p><p>para fazer a síntese de cDNA a partir do RNA+.</p><p>Assim como as primeiras DNA-polimerases usadas na PCR mais rudimentar, a TR não é resistente à</p><p>temperatura. Dessa forma, a reação de transcrição reversa deve preceder a PCR, pois a TR é inativada pelas</p><p>temperaturas de desnaturação. Da junção de reação de transcrição reversa (RT) seguida por PCR, vem o</p><p>termo RT-PCR. A TR precisará de pequenos oligonucleotídeos, menores ainda que os usados em uma PCR</p><p>convencional, para iniciar a transcrição.</p><p>Esses oligonucleotídeos têm, em média, apenas 6 bases e, por isso, são chamados de hexâmeros. Eles podem</p><p>ser específicos para determinada sequência de RNA, ou podem ser uma sequência curta rica em timinas (poli-</p><p>T), que se anelará à cauda poli-A do mRNA, ou podem ser aleatorizados, sendo este último o mais usado por</p><p>permitir a síntese e o armazenamento do cDNA derivado de diversas sequências diferentes.</p><p>Primeiro caso</p><p>Sintetizamos apenas cDNAs correspondentes ao RNA (mensageiros ou não) ao qual os hexâmeros se</p><p>anelam.</p><p>Segundo caso</p><p>Podemos criar cDNA complementares a todos os mRNA da célula, o que constitui uma biblioteca de</p><p>expressão gênica.</p><p>Terceiro caso</p><p>Com uso de iniciadores aleatorizados, criamos uma biblioteca de cDNA correspondente a todos os</p><p>RNAs da célula, mensageiros ou não. Similar à PCR, uma vez que os oligonucleotídeos se ligam à fita</p><p>de RNA+, a TR começa a sintetizar uma fita de cDNA complementar usando o quarto reagente, os</p><p>desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs).</p><p>Ao contrário da PCR, que contém ciclos que se repetem várias vezes para a amplificação de determinada</p><p>sequência, a RT é linear: cada etapa acontece apenas uma vez, o que não permite amplificação de sinal.</p><p>Primeiro, a reação começa com o anelamento dos hexâmeros ao RNA+ por poucos minutos. Na maioria dos</p><p>casos, não há necessidade de temperaturas altas de desnaturação, pois o RNA+ já é uma fita simples.</p><p>Contudo, podem ocorrer estruturas secundárias no RNA que</p><p>precisam de temperaturas moderadas para</p><p>desnaturação.</p><p>Veja na imagem a desnaturação de eventuais estruturas secundárias do RNA, seguido por anelamento dos</p><p>hexâmeros iniciadores à sequência-alvo por complementariedade, e síntese de cDNA pela transcriptase</p><p>reversa.</p><p>Ilustração das etapas da reação de transcrição reversa (RT).</p><p>Em seguida, o tubo será aquecido ou resfriado até a temperatura de extensão pela TR. Diferentemente da PCR</p><p>convencional, a RT possui diversas TR de origens diferentes que podem ser usadas. Assim, os protocolos</p><p>variam entre diferentes marcas de enzimas. Em alguns casos, a RT pode ter apenas essas duas temperaturas,</p><p>de anelamento e extensão, de 25 e 37ºC, respectivamente. O cDNA produzido pode ser armazenado por</p><p>meses a anos em geladeira (4ºC) ou freezer (-20ºC), ou usado imediatamente como molde em uma PCR – a</p><p>chamada RT-PCR.</p><p>Resumo esquemático dos reagentes necessários, das etapas e da amplificação do</p><p>cDNA em uma RT-PCR.</p><p>Nested-PCR</p><p>A PCR convencional é muito útil, mas, às vezes, não consegue amplificar determinada sequência que esteja</p><p>presente em pouquíssima quantidade. Quando há dificuldade em se amplificar o DNA alvo na PCR</p><p>convencional, o gel de agarose pode não ter capacidade suficiente para evidenciar o amplicon. Nós</p><p>chamamos essa capacidade de o resultado representar a realidade de sensibilidade.</p><p>A sensibilidade da PCR reflete a capacidade de detecção do sinal do DNA-alvo, em amostras que possuem o</p><p>DNA-alvo na realidade. Normalmente, a PCR tem ótima sensibilidade por aumentar exponencialmente a</p><p>sequência-alvo. No entanto, em alguns casos, a sensibilidade da PCR convencional pode não ser suficiente,</p><p>pois existe uma saturação da reação por volta do 35º ciclo: atingimos um platô em que não há aumento do</p><p>número de fitas devido ao esgotamento dos reagentes. Então, ter mais de 40 ciclos em uma PCR não</p><p>oferecerá nenhum benefício, porém, pode aumentar as chances de produtos inespecíficos que atrapalharão a</p><p>interpretação.</p><p>Observe no gráfico que a quantidade de DNA, detectada por fluorescência, aumenta exponencialmente até</p><p>chegar a um platô, em que não há mais aumento significativo de DNA a cada ciclo.</p><p>Gráfico representativo das qPCR.</p><p>A solução para PCR com baixa sensibilidade é relativamente simples: usar uma fração da primeira reação</p><p>como molde para uma segunda PCR, em uma técnica conhecida como nested-PCR (ou PCR aninhada). Para</p><p>isso, utilizamos dois pares de iniciadores, sendo o par de primers para a primeira reação, chamado de</p><p>iniciadores externos, e os primers usados na segunda PCR, conhecidos como internos.</p><p>Dessa maneira, a segunda PCR sempre gera um produto menor que a primeira reação, e conseguimos</p><p>aumentar o número de ciclos de amplificação de, no máximo, 40 (na PCR convencional) para entre 60 e 80</p><p>ciclos no total de ciclos combinados nas duas reações subsequentes. Consequentemente, aumentamos a</p><p>quantidade de DNA amplificado obtido ao final da segunda PCR. Caso seja utilizada corretamente, a adição de</p><p>etapa nested pode melhorar muito a sensibilidade e a especificidade da PCR.</p><p>Para isso, são necessários alguns cuidados especiais. O primeiro deles está no desenho da reação, que deve</p><p>ser pensada como um conjunto. A primeira PCR deve possuir oligonucleotídeos que, ao se anelarem a</p><p>determinada região, permitam que a polimerase produza um amplicon longo e específico o suficiente para ser</p><p>usado como DNA-molde na segunda reação.</p><p>Saiba mais</p><p>Caso desejemos amplificar sequências altamente repetitivas, precisaremos levar em consideração uma</p><p>primeira PCR cujo amplicon contenha regiões específicas ao redor das repetições, para que haja uma</p><p>boa reação secundária. Isso porque, essa última precisa de iniciadores que se anelem especificamente à</p><p>região que foi amplificada anteriormente.</p><p>Contudo, devemos evitar o uso dos mesmos oligonucleotídeos da primeira reação, já que podem reduzir a</p><p>eficácia da segunda reação, além de gerar produtos inespecíficos. Outro cuidado recomendável para a</p><p>segunda reação é a purificação do produto da primeira reação antes de utilizá-lo na segunda, o que evita</p><p>contaminações entre amostras, reduz o risco de inespecificidade e aumenta a eficácia da segunda PCR. Note</p><p>o uso de iniciadores externos na primeira reação, amplificando um produto que será usado como molde de</p><p>amplificação na segunda reação, que usa iniciadores internos.</p><p>Representação esquemática de uma nested-PCR.</p><p>PCR quantitativo em tempo real – qPCR</p><p>Até agora, todas as técnicas que discutimos precisam da eletroforese em gel de agarose para separação dos</p><p>produtos da PCR e posterior revelação das bandas através de agentes intercalantes do DNA que emitem</p><p>fluorescência; por exemplo, o brometo de etídio, quando submetido à luz ultravioleta. Esses tipos de PCR são</p><p>categorizados como qualitativos e podem ser muito úteis, especialmente, quando o DNA amplificado for</p><p>utilizado em outra técnica subsequente. Entretanto, existem situações em que a PCR qualitativa se torna</p><p>pouco informativa.</p><p>Exemplo</p><p>Quando queremos determinar se um tratamento está surtindo efeito na redução de um marcador</p><p>genético específico. Nesse caso, a PCR convencional e suas variações vistas até agora não informam o</p><p>suficiente para tomada de decisões. Precisamos, assim, de técnicas que revelem a quantidade de certa</p><p>sequência específica de DNA com o máximo de precisão possível. Entra em cena a PCR quantitativa -</p><p>também conhecida como PCR em tempo real - (qPCR).</p><p>A qPCR tem a capacidade de quantificação da sequência-alvo e de leitura em tempo real dos resultados, sem</p><p>necessidade de revelação posterior. Isso porque, ela possui dois fatores adicionais a uma PCR qualitativa: a</p><p>adição de fluoróforos à própria reação e o uso de um termociclador capaz de detectar o sinal fluorescente.</p><p>Dessa forma, a cada novo ciclo de desnaturação-anelamento-amplificação, ocorre aumento da quantidade de</p><p>DNA-alvo e da emissão de fluorescência proporcional à quantidade de DNA sendo sintetizada naquele ciclo.</p><p>Para que a fluorescência seja detectada, a qPCR exige a utilização de termocicladores que contenham lasers</p><p>para excitação do fluoróforo e detectores da fluorescência. Esse aparelho é mais sofisticado, mais caro e mais</p><p>complexo do que um termociclador convencional, porém seus resultados podem ser igualmente mais</p><p>informativos e precisos. Outra diferença da qPCR é que, em alguns casos, podemos ter uma temperatura</p><p>única para anelamento e extensão: todas as duas acontecem a 60 oC.</p><p>Exemplo dos ciclos de temperatura usados em SYBR qPCR contendo a fase de</p><p>amplificação e a fase de curva de dissociação.</p><p>Existem duas técnicas de qPCR largamente usadas: SYBR Green e TaqMan. Elas diferem especialmente na</p><p>forma como a fluorescência é emitida e na especificidade do sinal fluorescente. As formas de quantificação</p><p>são, por outro lado, semelhantes. Vamos explorar as duas em mais detalhes? Vejamos!</p><p>SYBR Green</p><p>O SYBR é fluoróforo que, como o brometo de etídio, é capaz de intercalar em fitas duplas de DNA. Quando</p><p>está associado ao DNA, o SYBR pode ser excitado em comprimento de onda azul, e então emite fluorescência</p><p>verde. Quando não está ligado ao DNA fita dupla, o SYBR tem sua fluorescência drasticamente reduzida. Por</p><p>sua capacidade de fluorescer quando ligado ao DNA fita dupla, ele também é usado como um sistema</p><p>alternativo na revelação da PCR convencional em gel de agarose, já que é menos tóxico que o brometo de</p><p>etídio.</p><p>Quando adicionado à qPCR, o SYBR emitirá o máximo de fluorescência na fase de extensão, pois esse é o</p><p>momento em que há maior número de bases pareadas em fitas duplas. O aparelho termociclador irá incidir um</p><p>laser, excitando o SYBR a emitir fluorescência verde. Essa fluorescência será detectada pelo aparelho, que</p><p>mostrará a quantidade de fluorescência por ciclo. A cada novo ciclo, maior será a fluorescência emitida, pois</p><p>maior será a quantidade de DNA fita dupla sendo sintetizada.</p><p>Desse modo, a progressão de fluorescência será proporcional à quantidade de DNA amplificado a cada ciclo,</p><p>até que a reação atinja sua saturação, e um platô</p><p>após a curva de crescimento exponencial será observado.</p><p>Repare que, quando não está ligado ao DNA dupla fita, devido à sua desnaturação, o SYBR não emite</p><p>fluorescência. Ao ligar-se à fita dupla de DNA, durante a sua extensão, a fluorescência é emitida.</p><p>Esquema ilustrando a teoria por trás da fluorescência do SYBR.</p><p>É importante considerarmos que essa interação entre o SYBR e a fita dupla de DNA não é controlada:</p><p>O SYBR irá se intercalar com qualquer fita dupla de DNA. Isso faz com que a emissão de</p><p>fluorescência seja menos específica: como em uma reação convencional, apenas os</p><p>oligonucleotídeos iniciadores são responsáveis pela especificidade. Assim, outras formas de</p><p>controle da reação foram criadas para garantirmos que o sinal fluorescente usado na quantificação</p><p>corresponda apenas ao produto desejado.</p><p>Portanto, adicionamos um passo a mais a qPCR: a curva de dissociação (melting curve). Nessa etapa, o</p><p>termociclador aquecerá a PCR lentamente, para medir em qual temperatura 50% das fitas duplas de DNA</p><p>sintetizadas se dissociam. Essa dissociação será medida, mais uma vez, através da fluorescência pelo SYBR.</p><p>Essa temperatura dependerá de dois fatores principais: o conteúdo CG e o tamanho da sequência.</p><p>Por isso, reações de SYBR tem amplicons com tamanho limitado em cerca de 100 nucleotídeos em média. Em</p><p>uma curva de dissociação boa e específica, todas as moléculas amplificadas irão se dissociar na mesma</p><p>temperatura e, assim, só um pico é observado no gráfico. Em uma qPCR por SYBR sem especificidade, mais</p><p>de um pico será visto na curva de dissociação, e a reação precisará ser ajustada. Esse é um importante nível</p><p>de controle de qualidade da reação que não deverá ser ignorado.</p><p>A existência de um único pico (a 76,49 °C) indica que há apenas um produto amplificado, o que confirma a</p><p>especificidade da qPCR. Observe:</p><p>Exemplo de resultado de uma curva de dissociação dos produtos de uma qPCR por</p><p>SYBR Green.</p><p>Quantificação absoluta por SYBR</p><p>Confira mais detalhes sobre PCR em tempo real pela metodologia SYBR para fazer uma curva de quantificação</p><p>absoluta.</p><p>Conteúdo interativo</p><p>Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.</p><p>TaqMan</p><p>Outra forma bastante comum de qPCR, cujo nome vem da referência ao jogo de videogame dos anos 1980,</p><p>PacMan. Assim como na técnica SYBR, a quantificação em tempo real na TaqMan ocorre através da emissão e</p><p>detecção de fluorescência a cada ciclo de amplificação. Entretanto, a TaqMan difere do SYBR na forma como</p><p>a emissão da fluorescência acontece: Além de todos os reagentes que uma PCR convencional possui, temos a</p><p>presença de uma sequência extra, complementar à região interna dos iniciadores. Essa sequência extra é</p><p>conhecida como sonda e é curta, com tamanho aproximadamente igual ao dos oligonucleotídeos iniciadores,</p><p>e possui temperatura de anelamento pouco superior à deles. A sonda contém uma molécula fluorescente na</p><p>extremidade 5’, e outra molécula na extremidade 3’, que bloqueia a emissão de fluorescência.</p><p>A existência de uma sonda que se anela à região alvo a ser amplificada não representa muito, se a molécula</p><p>fluorescente não for liberada de seu bloqueador. Para isso, a enzima Taq polimerase usada na TaqMan é</p><p>diferente das outras Taq polimerases. Ela adiciona nucleotídeos (polimerização), como as demais polimerases,</p><p>e remove nucleotídeos (função exonuclease).</p><p>A remoção de nucleotídeos é fundamental para a detecção da fluorescência, pois, quando a enzima chega ao</p><p>nucleotídeo da sonda que contém o fluoróforo e o remove da sequência, o fluoróforo estará livre de seu</p><p>bloqueador e poderá emitir fluorescência detectável. A cada novo ciclo da PCR, as fitas duplas serão</p><p>desnaturadas, os iniciadores e a sonda se anelarão, e a TaqMan polimerase fará síntese do DNA. Com</p><p>remoção dos nucleotídeos da sonda, o fluoróforo nela contida é liberado para emitir fluorescência</p><p>proporcional a cada nova sequência-alvo sintetizada.</p><p>Repare na ilustração que a sonda anelada entre os dois iniciadores é clivada pela TaqMan polimerase durante</p><p>a extensão do DNA, permitindo a emissão de fluorescência.</p><p>Representação esquemática da qPCR pelo método de TaqMan.</p><p>A TaqMan apresenta uma vantagem extra para especificidade da reação: o anelamento da sonda é específico</p><p>para a região alvo a ser amplificada. A especificidade dada pela sonda é tamanha que diferenças de apenas</p><p>um nucleotídeo podem ser detectadas – essas mutações são conhecidas como single nucleotide</p><p>polymorphism (SNP).</p><p>Assim sendo, a TaqMan dispensa técnica complementar para avaliação da especificidade, como a curva de</p><p>dissociação, o que a faz mais rápida do que a técnica de SYBR. Entretanto, as sondas tornam a reação mais</p><p>cara. Outra vantagem que a TaqMan traz em relação ao SYBR é a capacidade de múltiplas detecções na</p><p>mesma reação com maior precisão e confiabilidade. Veremos mais detalhes à frente.</p><p>Tanto a técnica de SYBR quanto a TaqMan são capazes de quantificar o DNA ou cDNA. A técnica como a</p><p>quantificação é obtida varia, mas a maioria das análises posteriores podem ser usadas igualmente – uma vez</p><p>que resultados confiáveis tenham sido obtidos através de rigoroso controle de qualidade.</p><p>Quantificação</p><p>Na qPCR, cada ciclo desnaturação-anelamento-extensão produzirá fluorescência, que será detectada pelo</p><p>aparelho.</p><p>Configuração do aparelho</p><p>Deve-se ajustar o programa do aparelho para que ele saiba qual laser e quais filtros usar para a</p><p>excitação de cada fluoróforo e em qual espectro da emissão ele deverá buscar o sinal para detecção.</p><p>Isto é, você é o responsável em dizer ao aparelho o que ele deve fazer.</p><p>Detecção de ruído</p><p>Deve-se ajustar o aparelho para que ele determine, nos ciclos iniciais de amplificação, qual é o nível</p><p>em que o sinal obtido é superior ao sinal de ruído. Como a qPCR utiliza fluoróforos para a</p><p>quantificação, por vezes existe um “vazamento” de fluorescência no início da reação que não está</p><p>relacionada com a amplificação da sequência-alvo em si.</p><p>Definição do limiar</p><p>Esse sinal inespecífico, geralmente, obtido nos primeiros ciclos, chamamos de sinal de ruído</p><p>(background). O ruído vai ser utilizado para determinar o limiar de detecção (threshold).</p><p>O primeiro ciclo em que a fluorescência de determinada amostra ultrapassa o limiar de detecção acima do</p><p>ruído (ou da fluorescência de base) é chamado de valor de Ct. Esse valor é importante por estar diretamente</p><p>relacionado à quantidade inicial de DNA-alvo da amostra amplificada. A relação entre concentração inicial de</p><p>DNA-alvo na amostra e Ct é inversamente proporcional, o que significa que, quanto menor for o Ct de uma</p><p>amostra, maior a quantidade de DNA que ela originalmente continha.</p><p>Outros dois parâmetros usados pelo aparelho para ajustar (ou normalizar) a reação internamente são</p><p>a ROX, um fluoróforo passivo (cuja fluorescência não aumenta de acordo com a amplificação do</p><p>DNA) usado como referência, e o Rn, que representa um ajuste (ou normalização) entre o sinal do</p><p>fluoróforo de escolha (SYBR ou da sonda TaqMan) e a referência ROX. A maioria dos reagentes para</p><p>qPCR já possuem ROX adicionados ao tampão, cabendo a nós apenas a observação para eventual</p><p>detecção de anomalias que podem invalidar a reação. Mais uma vez, a qPCR tem que manter</p><p>padrões rígidos de controle de qualidade para que diferenças mínimas na quantidade sejam</p><p>confiáveis.</p><p>Com todos esses fatores ajustados corretamente, os aparelhos mais modernos detectarão o sinal emitido a</p><p>cada ciclo e darão, em tempo real, o resultado na tela do computador ao qual ele precisa estar ligado para</p><p>funcionar, em um gráfico chamado de curva de amplificação.</p><p>Veja o exemplo de gráfico de amplificação para o gene Suc2 da Saccharomyces cerevisae. Note a reta</p><p>paralela ao eixo x (horizontal), que representa o valor de limiar de detecção / quantificação. Abaixo dela,</p><p>temos o ruído da reação. As curvas amarelas e vermelhas representam a quantificação das amostras e, como</p><p>você pode observar, existem 4 amostras em duplicata; a com maior quantidade de DNA é a mais à esquerda</p><p>no gráfico, com menor Ct.</p><p>Você consegue dizer qual é o Ct da amostra</p><p>mais concentrada?</p><p>Gráfico de amplificação.</p><p>Existem duas formas de se quantificar o produto amplificado: pela curva padrão e por quantificação relativa,</p><p>ou método de delta-delta-CT (ou ΔΔCt).</p><p>Pela curva padrão</p><p>Em muitos casos, a quantificação absoluta do DNA alvo na amostra é necessária. Para isso, devemos ter em</p><p>mãos uma curva padrão, com concentrações conhecidas do DNA alvo. Essa curva pode ser comprada de</p><p>laboratórios especializados em sua fabricação ou produzida por nós mesmos, através de clonagens e</p><p>purificação. A partir da concentração mais alta, faremos uma diluição seriada. Para isso, colocamos uma</p><p>fração da solução de maior concentração em um tubo contendo apenas água, e depois deste tubo para outro</p><p>com apenas água, e assim sucessivamente até termos pelo menos 5 pontos de curva.</p><p>Diluição seriada usando a escala em mililitro (mL) como exemplo, porém para a</p><p>nossa metodologia é utilizada a escala em microlitro (µL).</p><p>Em seguida, informamos ao aparelho em quais posições cada concentração da curva está, de forma que o</p><p>próprio computador calcule os parâmetros de qualidade da curva. Com esses valores, o computador calcula a</p><p>quantidade de DNA existente nas nossas amostras de concentração desconhecida. Alguns dos principais</p><p>valores dados pela curva padrão que usamos para determinar a concentração da amostra-teste são a</p><p>linearidade da curva e a eficiência de amplificação.</p><p>Repare na imagem a seguir que existem 5 quantidades diferentes da curva padrão (em vermelho), obtidas</p><p>pela diluição seriada, e três amostras desconhecidas (em azul) cuja quantidade de DNA foi calculada a partir</p><p>de seus Cts e com base na linearidade da curva padrão.</p><p>Exemplo de curva padrão para quantificação absoluta do DNA.</p><p>Linearidade da curva</p><p>Matematicamente conhecida como R2, deve ser</p><p>superior a 0.985 para que a reação seja</p><p>aceitável, e a quantificação de sua amostra-</p><p>teste seja calculada com máximo de precisão.</p><p>Usando fórmulas de linearidade, calculamos o</p><p>valor preciso de DNA-alvo na amostra antes da</p><p>amplificação começar, baseado no Ct de cada</p><p>uma.</p><p>Eficiência de amplificação</p><p>Com ela, a cada ciclo, espera-se que a</p><p>quantidade de DNA-alvo amplificado dobre, o</p><p>que significaria uma eficiência de 100% da</p><p>reação. Porém, devido a pequenos erros,</p><p>podemos considerar aceitáveis eficiências que</p><p>variem entre 90 e 110%. Esses parâmetros</p><p>serão mais robustos com uso de replicatas</p><p>(repetições da mesma reação em poços</p><p>diferentes.).</p><p>Por quantificação relativa, ou método de delta-delta-CT (ou ΔΔCt)</p><p>Nesse método, você precisará quantificar dois DNA-alvos diferentes: o DNA de interesse, cuja quantidade é</p><p>desconhecida na amostra, e o DNA de referência. A determinação da quantidade de um DNA-alvo de</p><p>interesse é feita a partir da subtração (ou seja, o delta) do Ct (ciclo em que a amostra ultrapassou o limiar)</p><p>pelo Ct do outro DNA quantificado na amostra, o de referência. Isso porque, a quantidade do gene de</p><p>interesse pode variar de acordo com diversos fatores biológicos, mas também pode ser devido à quantidade</p><p>de material usado na extração.</p><p>Nesse caso, o ideal é fazer uma normalização pela quantidade de cDNA total e, para isso, usamos um cDNA</p><p>de referência, que, geralmente, é um gene constitutivo expresso em níveis estáveis nas células. O segundo</p><p>delta, ou a segunda subtração, é feita entre a diferença da primeira subtração na amostra-teste e uma</p><p>amostra controle, usada como calibradora. A amostra calibradora também precisará ter passado pela primeira</p><p>subtração; ou seja, também terá sido normalizada. Dessa forma, temos:</p><p>Essas subtrações são possíveis apenas quando as curvas de quantificação dos dois DNAs-alvo têm eficiência</p><p>entre 90-110%, e não devem diferir em mais de 10% entre si. Por isso, curvas-padrão iniciais para cada gene</p><p>devem ser construídas para se verificar as eficiências da reação, antes de procedermos para a técnica de</p><p>quantificação relativa.</p><p>Se quisermos comparar a expressão de dois genes entre uma amostra e um calibrador, usamos um método</p><p>especial. Você consegue identificar qual? A pista mais importante é: você está investigando a expressão</p><p>gênica, e não a existência do gene em si. Portanto, você não está olhando diretamente o genoma, mas um</p><p>produto dele. Qual produto do DNA podemos detectar via PCR?</p><p>Atenção</p><p>Se você respondeu RNA, acertou! Nesse caso, o nome correto e completo da técnica utilizada é RT-</p><p>qPCR: uma reação de transcrição reversa acoplada a uma reação em cadeia da polimerase quantitativa.</p><p>PCR em multiplex</p><p>Até agora, falamos sobre detectar apenas um DNA-alvo por reação, seja de PCR convencional, nested-PCR,</p><p>RT-PCR ou qPCR. Contudo, podemos detectar mais de um alvo por reação. Precisaremos ajustar as reações</p><p>separadamente, utilizando pares de oligonucleotídeos iniciadores específicos para cada produto desejado, e</p><p>depois fundir as duas PCRs em uma. Esse tipo de PCR em que mais de um produto alvo é identificado</p><p>chamamos de multiplex – múltiplos produtos são detectados, e até quantificados.</p><p>Em uma PCR convencional, vamos utilizar todos os reagentes que já conversamos e, é claro, os quatro (ou</p><p>mais) oligonucleotídeos necessários, sendo cada par correspondente à sua sequência-alvo. O mais</p><p>importante para fazermos um multiplex em uma PCR convencional é que os amplicons tenham tamanhos</p><p>distintos o suficiente para serem separados pelo gel de agarose, a fim de que os sinais de ultravioleta não</p><p>sejam confundidos. Normalmente, os produtos menores de 1000 pares de base (pb) devem ter mais de 200</p><p>pb de diferença. Para produtos maiores de 1000 pb, a diferença entre os produtos também deve ser maior.</p><p>Lembre-se de que você deverá levar em consideração o tamanho do maior produto para o tempo de</p><p>extensão. Outro fator ao qual você deverá estar atento é a temperatura de anelamento dos múltiplos</p><p>pares de iniciadores, que devem ter temperaturas o mais próximas possível.</p><p>Em uma qPCR-TaqMan, a amplificação e quantificação de diferentes sequências na mesma reação é possível</p><p>ao utilizarmos duas (ou mais) sondas distintas, cada uma capaz de hibridizar especificamente a sua</p><p>sequência-alvo, e ambas marcadas com fluoróforos que se excitem e emitam fluorescência em comprimentos</p><p>de onda diferentes.</p><p>Você poderá usar um fluoróforo que seja excitado no comprimento de onda azul e emita fluorescência no</p><p>espectro verde, e outro fluoróforo que seja excitado e floresça no comprimento vermelho, e assim por diante.</p><p>Por outro lado, reações multiplex quantitativas usando o sistema SYBR são mais difíceis. Isso porque a</p><p>emissão de fluorescência pelo SYBR é inespecífica e ocorre sempre que o fluoróforo intercala com fitas duplas</p><p>do DNA. Assim, a reação multiplex fica limitada e, muitas vezes, não é possível distinguirmos entre os sinais</p><p>dos diferentes produtos.</p><p>Em alguns casos, entretanto, a distinção é possível graças à curva de dissociação. Isso ocorre quando os</p><p>produtos distintos têm sequências diferentes o suficiente para terem temperaturas de dissociação de 50%.</p><p>Então, observamos dois picos na curva de dissociação, em temperaturas diferentes. No entanto, sequências</p><p>distintas sem diferença suficiente em seus conteúdos CG não poderão ser multiplexadas, pois não veremos</p><p>diferenças em suas curvas de dissociação.</p><p>Vem que eu te explico!</p><p>Os vídeos a seguir abordam os assuntos mais relevantes do conteúdo que você acabou de estudar.</p><p>Conhecendo nested-PCR</p><p>Conteúdo interativo</p><p>Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.</p><p>O que é e qual função de uma sonda TaqMan?</p><p>Conteúdo interativo</p><p>Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.</p><p>O que é valor de Ct (cycle threshold)?</p><p>Conteúdo interativo</p><p>Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.</p><p>Verificando o aprendizado</p><p>Questão 1</p><p>A PCR possui diversas aplicações, sejam elas práticas ou na pesquisa. A respeito da aplicação da PCR e de</p><p>suas variações, é correto afirmar que</p><p>A</p><p>na nested-PCR, fazemos duas reações em um único tubo, amplificando regiões diferentes que geram</p><p>produtos de tamanhos distintos.</p><p>B</p><p>o SYBR é um fluoróforo presente em PCR multiplex que dá maior estabilidade à reação.</p><p>C</p><p>na RT-PCR, ocorrem duas reações subsequentes: uma de síntese de cDNA a partir de RNA, e outra de</p><p>amplificação da sequência-alvo presente no cDNA.</p><p>D</p><p>uma PCR multiplex consiste em utilizar duas reações subsequentes, sendo que o produto amplificado da</p><p>primeira serve como molde para amplificação na segunda.</p><p>E</p><p>a reação de transcrição reversa utiliza uma polimerase especial, capaz de sintetizar RNA a partir de DNA.</p><p>A alternativa C está correta.</p><p>A Taq polimerase usada para amplificação de DNA não é capaz de reconhecer e polimerizar RNA. Quando</p><p>queremos analisar RNAm, precisamos que o cDNA seja sintetizado pela DNA-polimerase RT dependente,</p><p>ou transcriptase reversa. Então, usamos o cDNA sintetizado como molde em uma PCR.</p><p>Questão 2</p><p>Existem diferentes técnicas de PCR com aplicações variadas. Considerando isso, leia as afirmativas abaixo e,</p><p>em seguida, assinale a alternativa correta.</p><p>I – Podemos usar PCR convencional para amplificar um gene e cloná-lo em um vetor, e modificarmos</p><p>geneticamente um organismo simples.</p><p>II – Pelo uso de diferentes sondas marcadas com sinais diferentes, a qPCR TaqMan pode ser usada na</p><p>identificação e quantificação de mutações em diferentes alelos.</p><p>III – As técnicas moleculares são de pouca importância na rotina clínica, pois são demoradas e de aplicações</p><p>muito restritas.</p><p>IV – O tamanho de STRs é relevante no diagnóstico de doenças genéticas.</p><p>A</p><p>Somente as afirmativas I, II e IV estão corretas.</p><p>B</p><p>Somente as afirmativas I e IV estão corretas.</p><p>C</p><p>Somente as afirmativas III e IV estão corretas.</p><p>D</p><p>Somente as afirmativas I e II estão corretas.</p><p>E</p><p>Somente as afirmativas I, III e IV estão corretas.</p><p>A alternativa A está correta.</p><p>A PCR convencional pode ser utilizada para clonar um gene através de um vetor, como plasmídeo. Na</p><p>qPCR-TaqMan, as sondas auxiliam na quantificação de mutações de alelos diferentes. O tamanho e</p><p>conteúdo das STRs oferecem grande precisão na identificação de indivíduos. As técnicas moleculares,</p><p>como a PCR e as suas variações, têm ganhado muito espaço na rotina clínica. Há situações em que o</p><p>diagnóstico por amplificação de ácidos nucleicos é o padrão-ouro e, às vezes, é a única opção. Suas</p><p>aplicações vão de diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas ao acompanhamento da evolução e</p><p>tratamento de cânceres e infecções crônicas, assim como determinação de riscos genéticos e</p><p>aconselhamentos.</p><p>3. Aplicações apropriadas ao uso de cada método</p><p>Aplicações da PCR</p><p>Até agora, vimos os reagentes necessários à amplificação exponencial de uma sequência específica de DNA</p><p>até termos milhões e bilhões de cópias da mesma exata sequência, ou amplicon, que pode ser visualizada a</p><p>partir de técnicas especiais. Também vimos algumas variações da PCR que a tornam ainda mais relevante e</p><p>útil em diversos contextos.</p><p>Mas, afinal, para que precisamos de tantas sequências idênticas? Quais são as aplicações disso? Para ilustrar</p><p>melhor o quão útil a PCR é, veremos alguns exemplos a seguir.</p><p>A PCR e as suas variantes em ciências forenses</p><p>A primeira, e talvez uma das mais famosas para o grande público, é a aplicação forense. Você já deve ter</p><p>entrado em contato com a identificação de um criminoso a partir do seu DNA deixado na cena do crime, seja</p><p>por ter assistido a alguma série policial, seja por ter lido alguma reportagem da vida real. Isso só é possível</p><p>porque cada ser humano possui um genoma completamente único, exceto de gêmeos idênticos.</p><p>Em nosso genoma, temos regiões especiais nas quais um cientista forense pode olhar para confirmar a origem</p><p>do DNA. Denominadas marcadores moleculares, elas são conhecidas pela alta frequência de polimorfismos</p><p>genéticos – regiões com grande variação na sequência de DNA entre indivíduos sem causar nenhum tipo de</p><p>interferência funcional, pois são mais frequentes em regiões não codificantes.</p><p>Um dos principais marcadores moleculares utilizados em análises forenses são as repetições curtas em</p><p>tandem (ou STRs – short tandem repeats).</p><p>As STRs variam em tamanho e em conteúdo entre as pessoas e oferecem grande precisão na</p><p>identificação de indivíduos se a detecção de várias STRs for usada em conjunto.</p><p>As regiões de interesse são amplificadas por PCR e, em seguida, o perfil genético pode ser visualizado por</p><p>separação das bandas em gel de agarose e coloração por brometo de etídio.</p><p>Existem casos em que é necessário aumentar o material genético a ser usado para, assim, aumentarmos o</p><p>sinal durante a revelação. Nesse caso, o perito pode optar pelo uso de uma nested-PCR, lembrando que os</p><p>primers externos e interno precisam de regiões não repetidas para se anelarem. Um cientista forense, além de</p><p>fazer a extração do DNA e sua amplificação por PCR, fará a identificação de indivíduos através do seu perfil</p><p>genético.</p><p>Ilustração de um gel de agarose mostrando múltiplas bandas e representando os</p><p>marcadores moleculares.</p><p>A PCR e as variações usadas no diagnóstico de doenças genéticas</p><p>Existe uma gama de aplicações de PCR e suas variações na Medicina, de prevenção ao diagnóstico,</p><p>acompanhamento e prognóstico, ou evolução, de doenças. Ao amplificarmos certas regiões do DNA, podemos</p><p>identificar a presença ou ausência de sequências que deveriam ou não existir em determinado contexto. Seu</p><p>uso pode auxiliar, ou até mesmo determinar, o diagnóstico de diversas doenças que variam desde genéticas a</p><p>infecciosas. As doenças genéticas podem ser muito complexas em sua apresentação e possuir diferentes</p><p>perfis – autossômico dominante ou recessivo, ligado ao cromossomo X, multifatoriais e multigênicas. O uso da</p><p>PCR no diagnóstico dessas doenças pode ser feito de diversas maneiras, dependendo de qual é a doença e</p><p>de seu perfil genético.</p><p>O PCR multiplex pode ser utilizado para</p><p>verificar qual alelo está sendo expresso, dentre</p><p>dois alelos distintos, em uma mesma reação e</p><p>assim ajudar no reconhecimento de pequenas</p><p>mutações que levariam ao desenvolvimento de</p><p>uma doença genética. Mas temos outras</p><p>aplicações, usando PCR convencional.</p><p>Vamos usar a doença de Huntington como</p><p>exemplo. Nessa doença genética autossômica</p><p>dominante, ocorre um excesso de repetição de</p><p>três nucleotídeos (CAG) do DNA que codifica</p><p>uma proteína chamada Huntingtina. Esse excesso leva a uma doença neurodegenerativa sem cura que causa</p><p>perdas motoras, cognitivas e psiquiátricas ainda na idade adulta, apesar de poder aparecer em forma juvenil</p><p>também. A PCR torna-se uma importante ferramenta diagnóstica, pois, ao amplificar sequências próximas da</p><p>região de repetição, pode nos dizer seu tamanho e, assim, informar o risco e até o prognóstico da doença em</p><p>si.</p><p>Em um gene saudável, é normal ter cerca de 20 repetições (CAG); em pessoas portadoras de Huntington, o</p><p>número de repetições aumenta para 35 ou mais. De modo geral, quanto maior o número de repetições, maior</p><p>o risco de aparecimento e de progressão da doença. Essa gradação de fenótipo – no caso da doença de</p><p>Huntington, de sintomas – é algo conhecido em genética como penetrância.</p><p>Atenção</p><p>Lembre-se de que, para regiões repetitivas, é necessário usar iniciadores que se anelem próximo a STRs,</p><p>mas não nas STRs em si, pois isso geraria inespecificidade e muitas bandas em um gel de agarose.</p><p>A PCR e as variações usadas no diagnóstico de doenças infecciosas</p><p>Outro exemplo diagnóstico que você já pode ter ouvido falar é o uso da PCR para diagnóstico de doenças</p><p>infecciosas. Ao utilizar a técnica para amplificar o DNA (ou RNA) de algum agente infeccioso, podemos</p><p>diagnosticar uma infecção, já que o material genético de tal agente não deveria estar presente naquela</p><p>amostra biológica. Sua simples presença pode indicar o agente etiológico e, assim, descobrir a causa da</p><p>doença.</p><p>A PCR é especialmente útil no diagnóstico de organismos fastidiosos, que não crescem bem em cultivo, como</p><p>o Mycobacterium tuberculosis, por possuir alta sensibilidade e especificidade. Em outros casos, a presença do</p><p>material genético de determinado microrganismo não é suficiente para seu diagnóstico como agente causador</p><p>da doença, e testes complementares a PCR podem ser necessários, assim</p><p>como técnicas de PCR mais</p><p>elaboradas que darão maiores informações.</p><p>Temos, como exemplo, o diagnóstico molecular da covid-19. O SARS-CoV2 (severe acute respiratory</p><p>syndrome coronavirus 2), assim como os demais coronavírus, tem RNA fita simples como material genético.</p><p>Dessa forma, usamos a transcrição reversa para sintetizarmos um cDNA viral, e o utilizamos em qPCR – ou</p><p>seja, fazemos uma RT-qPCR.</p><p>Esse é considerado o melhor teste, ou padrão-ouro, para a identificação de casos ativos de infecção pelo</p><p>SARS-CoV2. Isso porque, o material genético viral é identificado de forma relativamente rápida – entre coleta,</p><p>extração, RT e qPCR, o resultado pode sair em algumas horas. Além disso, esse método é muito sensível e</p><p>específico, conseguindo detectar nas amostras pequenas concentrações do vírus (carga viral).</p><p>A RT-qPCR também é utilizada no diagnóstico e acompanhamento de outras infecções virais. A efetividade do</p><p>tratamento para HIV pode ser monitorada através de RT-qPCR, sendo esperadas reduções drásticas na carga</p><p>viral após introdução da terapia. O mesmo princípio de quantificação de cDNA obtido por transcrição reversa</p><p>também é aplicado em tratamentos oncológicos, especialmente, em leucemias e linfomas: o oncologista pode</p><p>requerer uma RT-qPCR para acompanhamento de determinado marcador gênico do câncer em questão.</p><p>Nos dois casos, a redução (ou não) das sequências alvo na RT-qPCR ao longo do tempo podem ser cruciais no</p><p>tratamento e evolução do paciente. A PCR convencional multiplex também pode ser utilizada no diagnóstico</p><p>diferencial entre dois patógenos que possam causar os mesmos sintomas, mas que exigem abordagens</p><p>clínicas diferentes.</p><p>Exemplo</p><p>Um paciente transplantado renal pode apresentar alteração em exames bioquímicos que levem o</p><p>nefrologista a pensar em duas possibilidades: na primeira, uma infecção por um vírus sem gravidade</p><p>pode estar acontecendo no órgão, e nenhum tratamento seria necessário; na segunda, pode estar</p><p>acontecendo uma infecção viral grave no rim transplantado que poderia rapidamente levar à perda do</p><p>órgão e até mesmo ao óbito do paciente.</p><p>A PCR e as suas variantes em pesquisa científica</p><p>Outro campo que utiliza a PCR é a pesquisa científica. Em diversas ocasiões, a PCR pode ser utilizada para</p><p>manipulação genética de organismos simples, como bactérias, leveduras e células em cultivo. Nesse contexto,</p><p>podemos usar a PCR para, por exemplo, clonarmos um gene. Fazemos isso ao amplificarmos a sequência</p><p>gênica que desejamos clonar usando oligonucleotídeos longos que têm duas regiões distintas. A primeira</p><p>região liga-se ao gene que queremos manipular – deletar, adicionar ou mutar – no organismo alvo; a segunda é</p><p>a região que se liga ao DNA molde do vetor dentro do qual queremos colocar nosso gene clonado.</p><p>O vetor é, em muitos casos, uma sequência independente do genoma do organismo alvo, mas que é capaz de</p><p>se replicar autonomamente quando inserido na célula. Um exemplo de vetores muito usados são os</p><p>plasmídeos, pequenos DNA circulares autorreplicantes e transferíveis de uma célula a outra, comuns em</p><p>bactérias.</p><p>Representação esquemática de uma técnica de clonagem por restrição, com a</p><p>inserção (ou clonagem) de um gene de origem diferente, que foi amplificado por</p><p>PCR, ao vetor original.</p><p>Normalmente, usamos a clonagem por PCR em duas etapas: uma para amplificarmos o gene alvo que</p><p>queremos clonar; na segunda etapa, usamos o produto amplificado, juntamente com o vetor, para inserirmos o</p><p>gene clonado no vetor. Outra forma de clonagem inclui o uso de enzimas de restrição para cortar o DNA em</p><p>pontos específicos, após amplificação por PCR.</p><p>A pesquisa científica é uma área de atuação muito grande e, por vezes, ela está interessada em</p><p>entender mecanismos complexos de regulação genética sob diversas condições. A RT-qPCR é uma</p><p>ferramenta muito útil nesse caso, para a avaliação dos níveis de expressão de genes em células</p><p>submetidas a diversas condições diferentes.</p><p>É comum utilizarmos a quantificação relativa (em que comparamos a quantidade de um gene de interesse com</p><p>um gene constitutivo de expressão estável) para avaliarmos como o metabolismo celular pode mudar</p><p>mediante o meio que se encontra. Em geral, você pode considerar que qualquer aplicação que determinado</p><p>método ou técnica tenha em rotinas laboratoriais das mais diversas áreas não apenas é usada em pesquisa</p><p>científica, como, provavelmente, foi originada de uma.</p><p>Quantificação relativa de genes por RT-qPCR e seu uso em pesquisa</p><p>Veja mais sobre quantificação relativa usando RT-qPCR pelo método de SYBR.</p><p>Conteúdo interativo</p><p>Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.</p><p>Vem que eu te explico!</p><p>Os vídeos a seguir abordam os assuntos mais relevantes do conteúdo que você acabou de estudar.</p><p>Diagnóstico molecular de covid-19 por PCR</p><p>Conteúdo interativo</p><p>Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.</p><p>A PCR e as variações usadas no diagnóstico de doenças genéticas</p><p>Conteúdo interativo</p><p>Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.</p><p>A PCR e as suas variantes em pesquisa científica (plasmídeos)</p><p>Conteúdo interativo</p><p>Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.</p><p>Verificando o aprendizado</p><p>Questão 1</p><p>A PCR possui diversas aplicações, sejam elas práticas ou na pesquisa. A respeito da aplicação da PCR e de</p><p>suas variações em ciências forenses, é correto afirmar que:</p><p>A</p><p>a nested-PCR não é útil, uma vez que o material genético é encontrado em abundância em situações forenses.</p><p>B</p><p>a PCR pode nos dar informações importantes, mas não pode determinar a identidade de indivíduos.</p><p>C</p><p>as STRs são regiões cuja variabilidade as tornam úteis para distinguir indivíduos geneticamente.</p><p>D</p><p>a qPCR é uma ferramenta necessária para amplificação do material genético de uma amostra antes de seu</p><p>sequenciamento.</p><p>E</p><p>o sequenciamento do genoma não é uma ferramenta viável para a identificação de indivíduos, além de ser</p><p>trabalhoso e caro.</p><p>A alternativa C está correta.</p><p>Short tandem repeats (STRs) apresentam grande variação de sequência e de tamanho entre indivíduos.</p><p>Pela identificação de diferentes padrões de um conjunto de STRs, podemos correlacionar amostras com</p><p>grande precisão, além ser possível também estabelecer grau de parentesco.</p><p>Questão 2</p><p>A técnica de PCR e suas variações são metodologias importantes para amplificações na pesquisa e</p><p>diagnósticos. Sobre a PCR, escolha a alternativa correta:</p><p>A</p><p>Um dos principais métodos utilizados em análises forenses é o sequenciamento de genes conservados dentro</p><p>de um DNA.</p><p>B</p><p>As STRs variam em tamanho e em conteúdo entre genes diferentes dentro de um mesmo organismo e</p><p>oferecem grande precisão na identificação de cromossomos se a detecção de várias STRs for usada em</p><p>conjunto.</p><p>C</p><p>Ao utilizar a técnica para amplificar o DNA (ou RNA) de algum agente infeccioso, podemos diagnosticar uma</p><p>infecção, já que o material genético de tal agente não deveria estar presente naquela amostra biológica.</p><p>D</p><p>Normalmente, para usarmos a clonagem por PCR basta a amplificação do gene alvo que queremos clonar.</p><p>E</p><p>O diagnóstico molecular da covid-19, o SARS-CoV2, assim como os demais coronavírus, tem o DNA como</p><p>material genético. Isso facilita o processo de laboratório porque o material já está disponível para qPCR.</p><p>A alternativa C está correta.</p><p>Um dos principais marcadores moleculares utilizados em análises forenses são as repetições curtas em</p><p>tandem e não sequências conservadas. As STRs variam em tamanho e em conteúdo entre as pessoas e</p><p>oferecem grande precisão na identificação de indivíduos se a detecção de várias STRs for usada em</p><p>conjunto. Este processo não compara genes entre cromossomos de um único indivíduo, mas vários.</p><p>Normalmente, usamos a clonagem por PCR para amplificar o gene alvo e depois inserir o gene clonado no</p><p>vetor. O diagnóstico molecular da covid-19, o SARS-CoV2, assim como os demais coronavírus, tem RNA fita</p><p>simples como material genético. Dessa forma, usamos a transcrição reversa para sintetizarmos um DNA</p><p>viral, e o utilizamos em qPCR – ou seja, fazemos uma RT-qPCR.</p><p>4. Conclusão</p><p>Considerações finais</p>