Aspectos Teórico-Práticos da Técnica Western Blotting.pptx

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Aspectos Teóricos da Técnica Western Blotting
Aluno: Pedro Nonato da Silva Júnior
Orientadores: Prof.ª Norma Maria Barros Benevides e Valdécio Silvano Monteiro 
Bolsista de Iniciação Científica
Graduando em Farmácia 
Objetivos
Conceituar western blotting, apresentando um pouco do seu histórico;
Citar e descrever os passos do protocolo de western blotting de forma geral; 
Destacar os eventuais problemas que podem ocorrer, sugerindo o que pode ser feito para revertê-los.
Apresentar as vantagens e desvantagens do método;
Conceituando western blotting...
“É um poderoso e importante método em biologia molecular, também conhecido como protein blotting ou immunoblotting, utilizado para imunodetecção de proteínas após a separação destas por eletroforese em gel e transferência para membrana adsorvente.” (KURIEN & SCOFIELD, 2006);
“O western blotting é utilizado para determinar a quantidade relativa e o peso molecular de uma proteína dentro de uma mistura de proteínas ou de outras moléculas.” (ABBAS et al., 2008);
“Esta técnica permite detectar, caracterizar e quantificar múltiplas proteínas, principalmente aquelas que estão em baixas quantidades em determinadas amostras.”(KURIEN & SCOFIELD, 2003);
Mas por que western blotting?
Western Blotting
Southern Blotting
Northern Blotting
Western
Southern
Northern
Objeto de Estudo
Proteína
DNA
RNA
Eletroforese
Vertical
Horizontal
Horizontal
Obtenção das amostras
Mecânica e/ou soluções
Mecânica e/ou soluções
Mecânica e/ou soluções
Tipo do Gel
Acrilamida
Agarose
Agarose
Preparação das Amostras
Desnaturação porβ- mercaptoetanol
Enzimas de Restrição
Desnaturação por Formaldeído
Tipo de suporte de transferência
PVDF ou nitrocelulose
Nylon ou nitrocelulose
Nitrocelulose
Tratamento do Gel
Não
Sim, HCl e sol. alcalina
Sim, formaldeído
Incubação
Tampão
Anticorpo Primário
AnticorpoSecundário
Enzima + Substrato
Tampão + DNA radiomarcado
Tampão + RNA radiomarcado
Detecção
Colorimétrica
Quimioluminescente
Fluorescente
Auto – Radiografia
Auto – Radiografia
Preparação das Amostras
Fontes de proteína
Preparação das Amostras
Precauções
Rápida remoção do tecido, a dessecação e congelamento (Nitrogênio líquido ou -80 °C); 
Tecidos frescos ou provenientes de biopsias: sem sangue, soro, estroma indesejável e gordura;
Adição de proteases e inibidores de fosfatases;
Armazenamento → Homogeneização → Centrifugação;
Fracionamento proteico: ↑[Proteína]. 
Preparação das Amostras 
Homogeneização
Homogeneização mecânica:
Homogeneizador;
Fácil de limpar e esterilizar;
Ossos e cartilagens;
Homogeneização ultrassônica
Sonicador
Pequenos pedaços de tecidos
Sangue, fígado e cérebro;
Homogeneização por pressão → Microrganismos em suspensão;
Lise por detergentes
Triton X-100
Tween 80
Nonidet P-40;
Saponinas
Preparação das Amostras 
Solubilização Proteica
Afeta a qualidade do resultado final e é determinante para o sucesso do processamento;
A ruptura das interações que agregam as proteínas permite a separação das mesmas em solução;
O processo de solubilização de proteínas implica no uso de:
Caotrópicos: uréia ou tiouréia;
Detergentes: 3-[(3-Colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propano sulfonado (CHAPS) ou Trixton – 100;
Agentes redutores: ditiotreitol/ditioeritritol (DTT/DTE) ou tributilfosfina (TBP);
Inibidores de proteases/fosfatases/glicosidades;
Preparação das Amostras 
Remoção de Contaminantes
Diminuir a heterogeneidade da amostra o máximo possível:
SNC → Alto teor de lipídios e ácidos nucleicos;
Remoção = resultados de alta qualidade;
O pH e a força iônica das amostras influências consideravelmente na solubilidade das proteínas e por esse motivo soluções tampões, soluções salinas e detergentes são incluídos nas amostras;
Vale ressaltar que em muitos casos o uso da proteína pura não pode ser feito porque proteínas como albumina e IgGs constituem a grande maioria do concentrado de proteínas nas células.
Eletroforese em Gel
“A eletroforese é processo analítico de separação de proteínas e outras moléculas, em que a migração de partículas acontece em um campo elétrico (matriz). Para tal evento é necessário que essas partículas sejam dotadas de carga elétrica.” (VESTERBERG, 1989);
 A separação de proteínas por tamanho é obtida com o uso do gel de dodecilsulfato de sódio – poliacrilamida (SDS – PAGE);
Eletroforese em Gel
Pré-tratamento com β-mercaptoetanol e SDS:
β-mercaptoetanol → agente redutor → cliva as ligações dissulfeto;
SDS → detergente aniônico→ desnatura as proteínas;
Eletroforese em Gel
O gel age como uma peneira molecular:
Quanto mais alta a concentração de acrilamida, menores são os poros do gel e as proteínas se movem mais lentamente;
Géis com alta concentração de acrilamida são usados para determinar proteínas de tamanho pequeno, ao passo que géis com baixas concentrações de acrilamida são usados na determinação de proteínas grandes;
Transferência para a Membrana
Objetivo: tornar as proteínas acessíveis à detecção por anticorpos;
Tipos de Membranas:
Nitrocelulose;
Polivinildina diflourada (PVDF);
Papel ativado;
Nylon;
Formas de transferência:
Difusão simples;
Transferências à vácuo;
Electroblotting (transferência úmida ou semi-seca);
Bloqueio de Ligações Inespecíficas
Etapa necessária para prevenir a interação entre a membrana anticorpo utilizado para detectar a já que o anticorpo é uma proteína;
Bloqueio de sítios não - específicos é possível colocando a membrana em uma solução diluída de proteínas (tipicamente soro albumina bovina ou leite desnatado em pó);
A proteína na solução diluída ataca membrana em todos os locais onde a proteína - alvo não foi transferida;
Isso reduz o ruído no produto final do WB tornando os resultados mais claros e eliminando falsos positivos;
Adição do Anticorpo
Anticorpos (monoclonais ou policlonais) são utilizados para detectar uma proteína (antígeno ou epítopo) específica;
Posteriormente, esta reação antígeno/ anticorpo primário será exposta a um anticorpo secundário direcionado à porções espécie-específicas do anticorpo primário;
Normalmente, o anticorpo secundário está ligado à uma enzima reveladora - HRP que gera uma mudança de coloração ou um sinal fotométrico
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Detecção de Antígenos
Detecção em duas fases:
Uma solução de anticorpo primário é incubada com a membrana sobre uma gentil agitação de 30min a overnight em temperaturas diferentes;
A solução é composta pela solução de bloqueio;
Lavar para remover o excesso do primário;
A membrana é exposta a outro anticorpo dirigido para a porção específica do anticorpo primário, comumente conjugado a biotina ou a uma enzima repórter (FA/HRP);
Também pode-se usar um anticorpo secundário conjugado a peroxidase → cliva agente quimiluminescente para produzir luminescência proporcional a quantidade de proteínas;
Detecção em uma fase
Detecção de Antígenos
Detecção colorimétrica:
Depende da incubação do western blotting com o substrato que reage com a enzima reveladora que é ligada ao anticorpo secundário;
Corante solúvel → Corante insolúvel → Precipita e colore a membrana;
Densitometria ou espectrofotometria;
Detecção quimioluminescente:
Preconiza a incubação de um substrato fluorescente que ao ser exposto a uma enzima reveladora associada ao anticorpo secundário gera uma coloração;
A luz é detectada por um filme fotográfico ou por câmeras CCD, que capturam uma imagem digital do western blotting;
Densitometria → avalia a quantidade de proteína colorida e quantifica os resultado em termos de intensidade óptica;
Detecção de Antígenos
Detecção flourescente:
Marcador fluorescente é excitados por luz e a emissão da excitação é detectada por um fotosensor ou câmara CCD;
Método de detecção mais específico → quantitativo;
Detecção radioativa:
Ionização e subsequente autorradiografia para visualização da interação antígeno-anticorpo;
Alto custo
e muitos riscos à saúde → Desuso;
Solução de Problemas
sddgsgsgs
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Vantagens do Western Blotting
Membranas maleáveis e de fácil uso;
As proteínas encontram-se rápida e uniformemente disponíveis a diferentes ligantes, pois estão imobilizadas numa membrana;
Alta sensibilidade e especificidade;
É possível fazer múltiplas réplicas do gel;
Somente uma pequena quantidade de reagentes são necessários para a análise de transferência;
O armazenamento da amostra transferida pode ser prolongado;
A mesma proteína transferida pode ser usada para múltiplas análises sucessivas;
Desvantagens do Western Blotting
Custo médio alto;
 Procedimento longo;
Grandes chances de erro em diversos pontos;
Problemas de segurança/biossegurança dependendo do sistema de revelação;
Referências Bibliográficas
MIGUEL, M.P.; MENEZES, L.B.; ARAÚJO; E.G. Western Blotting: a técnica e aplicações na pesquisa e rotina diagnóstica em medicina veterinária. Enciclopédia Biosfera. Goiania. v.8, p. 1704 – 1719, 2012
MAHMOOD, T.; YANG, P. Western Blot: Technique, Theory and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. Hamilton. v.4, p. 429 – 434, 2012