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Metabolismo dos Nucleotídeos Prof. Msc. Andriu Catena - Biomédico DNA – Ácido Desoxirribonucleico Modelo “Escada retorcida” Corrimãos são formados por fosfatos e desoxirribose, enquanto os degraus são constituídos pelos pares de bases nitrogenadas DNA – Ácido Desoxirribonucleico A estrutura da molécula de ADN foi descoberta conjuntamente pelo norte-americano James Watson e pelo britânico Francis Crick em 7 de Março de 1953, o que lhes valeu o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1962, juntamente com Maurice Wilkins. Do ponto de vista químico, o ADN é um longo polímero de unidades simples (monômeros) de nucleotídeos, cuja cadeia principal é formada por moléculas de açúcares e fosfato intercalados unidos por ligações fosfodiéster. Ligada à molécula de açúcar está uma de quatro bases nitrogenadas. A sequência de bases ao longo da molécula de ADN constitui a informação genética. 3 DNA – Ácido Desoxirribonucleico RNA – Ácido Ribonucleico Dogma Central da Biologia Molecular Mutações Epigenética Ctrl + C Ctrl + V Gêmeos idênticos: clones perfeitos? Câncer Síndrome da Lise Tumoral (SLT) Consequência metabólica Resposta ao tratamento do câncer u Quimioterápicos: Antimetabólitos ANÁLOGOS ESTRUTURAIS: bases púricas, pirimídicas e nucleosídeos. 5-fluorouracil (Fura) FUTP FdUMP u Quimioterápicos: Antimetabólitos ANÁLOGOS ESTRUTURAIS: bases púricas, pirimídicas e nucleosídeos. 5-fluorouracil (Fura) FUTP FdUMP u Quimioterápicos 5-fluorouracil (Fura) O Flúor presente na molécula do 5-Fluorouracil inibe a formação de dTMP 16 Quimioterápicos Metotrexato (MTX) Quimioterápicos Metotrexato (MTX) e FdUMP Quimioterápicos Citidina Desoxicitidina Citosina arabinosídeo (AraC) Citosina arabinosídeo trifosfato (araCTP) dCTP Citosina arabinosídeo (AraC) Quimioterápicos Azasserina e Acivicina 2 moléculas de glutamina; IMP XMP GMP Síntese de novo das PURINAS: síntese de carbamoil fosfato; UTP CTP Síntese de novo das PIRIMIDINAS: Diagnóstico de doenças virais e parasitarias (infectocontagiosas) Identificação do defeito genético Diagnóstico Medicina preventiva Farmacogenética Terapêutica Doenças com componente genético Câncer: diagnóstico, prognóstico e tratamento Perícia criminal Teste de Paternidade Diagnóstico de Doenças Metabólicas Ferramentas Moleculares Kary Mullis, geneticista Nobel Prize em Química (1993) pelo desenvolvimento de um método que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. Seus estudos em 1985 permitiram amplificar o DNA PCR PCR é uma técnica que amplifica uma sequência específica de DNA, como objetivo de torná-la abundante e disponível para diversas técnicas de biologia molecular. Os alvos a serem considerados no PCR são as regiões que flanqueiam a sequência específica de DNA a ser amplificada, a qual pode ser um gene inteiro ou somente uma região pequena. Etapas: Desnaturação; Anelamento; Extenção (polimerização). O número de bases nos alvos pode variar. TTAAGGCTCGA . . . . AATTGGTTAA PCR Componentes químicos da PCR Termociclador: equipamento eletrônico para ser utilizado em laboratórios que utilizam técnicas baseadas na manipulação ou identificação de DNA. PCR PCR – como visualizar? RT-PCR qPCR RT-PCR RT-PCR qPCR O PCR em Tempo Real permite o monitoramento do produto de PCR gerado durante a corrida através da ajuda de corantes intercalantes ou oligonucleotídeos marcados com fluorescência. Semelhanças com a PCR convencional A sequência-alvo a ser amplificada é flanqueada por primers. Método de amplificação de ácidos nucléicos, que acontece em um termociclador; Depende da reação em cadeia da polimerase; Diferenças da PCR convencional As medidas são realizadas durante cada ciclo e exibidas na tela em tempo real Corantes fluorescentes e o termociclador é capaz de medir essa intensidade; A fluorescência aumenta de forma proporcional à quantidade de amplicons; qPCR qPCR SYBR Green (2ª Geração) dsDNA + corante livre (fluoróforo fraco) Ligado a dupla fita (fluorescencia 1.000x) Corante é excitado a 497 nm e emite a 520 nm. Corante ligante mostra aumento da fluorescência quando ligado ao esqueleto de dsDNA. CORANTE INTERCALANTE NÃO-SATURANTE qPCR Métodos de detecção – Corantes intercalantes dsDNA Probes de hidrólise qPCR Métodos de detecção – Corantes intercalantes dsDNA Sequenciamento Sequenciamento Eletroferograma parcial de uma sequência de DNA Sequenciamento Investigação do gene; Mutações muito próximas.
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