Isolamento e Diagnóstico Virológico - RESUMO

Prévia do material em texto

Isolamento e Diagnóstico Virológico 
Resumo 
O diagnóstico laboratorial clássico das viroses tem sido realizado com base em dois 
parâmetros: 
 1)ISOLAMENTO e IDENTIFICAÇÃO DO VÍRUS: o virologista utiliza-se de sistemas vivos nos quais 
os vírus são propagados. Na identificação do vírus isolado, utilizam-se soros padrões 
específicos produzidos em laboratório. 
 2)SOROLOGIA: são utilizados métodos para detecção de anticorpos específicos, produzidos 
pelo hospedeiro em resposta à infecção viral. 
 
Colheita de amostras para o Diagnóstico 
 
 
Transporte das Amostras 
-As amostras devem ser transportadas para o laboratório em recipientes herméticos e 
estéreis. 
-Os swabs devem ser inseridos em tubos com meio de transporte (Hanks, Stuart). 
-Manter as amostras refrigeradas até a inoculação das mesmas em Cultivo celular ou outro 
(temperatura ideal até 2 horas 2ºC). 
Devido à instabilidade das partículas virais frente a fatores do meio ambiente, os espécimes 
clínicos coletados para isolamento de vírus devem ser sempre mantidos no gelo (não 
congelados) e remetidos imediatamente ao laboratório. Se o material for remetido para locais 
distantes, deve ser acondicionado em gelo-seco. 
 
Diagnóstico Virológico 
 Isolamento e identificação do vírus 
 Exame patológico 
 Sorologia 
 Detecção direta do vírus, antígenos 
 Diagnóstico molecular 
Isolamento e Diagnóstico Virológico 
Resumo 
“Isolamento e Identificação do Vírus” 
Inoculação experimental de vírus em sistemas do hospedeiro. 
 
 Ovos Embrionados: a observação da propagação viral em ovos embrionados pode ser 
feita através da técnica da hemoaglutinação (HA) ou da visualização de pocks que são 
lesões esbranquiçadas ou hemorrágicas na membrana corioalantóica. A identificação 
do vírus pode ser feita através de reações sorológicas. 
 
-Produção de vacinas, influenza vírus. 
-Vírus aviários 
-Inoculação - saco vitelino, cavidade alantóica e amniótica. 
 
 Animais de Laboratório: Camundongos e Primatas. 
 
-A camundongos (inoculação intracerebral ou intraperitoneal) está limitado ao 
isolamento do arbovírus, vírus da raiva e alguns Coxsackievírus do grupo A. 
-A primatas, especialmente os chimpanzés, são utilizados em alguns laboratórios de 
pesquisa para o isolamento de vírus humanos não cultiváveis em outros sistemas 
hospedeiros. 
 
 Cultivo/Cultura de Células: Conjunto de técnicas que permitem cultivar ou manter 
células isoladas fora do organismo original, mantendo suas características próprias. 
 
-As células permanecem em um ambiente ideal in vitro, com meio enriquecido, 
temperatura e fornecimento de gases para o seu desenvolvimento. 
-A cultura de tecidos implica a prévia desagregação (mecânica ou enzimática) do 
tecido original e em que as células são cultivadas numa camada aderente, num 
substrato sólido ou em suspensão em meio de cultura. 
-Estratégia essencial para a investigação, tratamento e possível cura para patologias. 
 
Informações importantes: Henrietta Lacks – HeLa tumor uterino. 
-Amostras do raspado celular do tumor foram enviadas a George Gey que preservou as células. 
-A partir destas iniciou uma fase de produção nestas células de isolamento viral. 
-Jonas Salk – vacina contra o vírus da Poliomielite. 
 
Tipos de células: 
-Origem animal ou vegetal 
Uso de células têm suas limitações: Condições físicas e biológicas da amostra viral, efeito 
citopático do vírus. 
 
Outros tipos de células: 
-Rim de macaco – GMK 
-HEp2 –Célula epitelial humana 
-HER293 Célula de Rim Humano- Sarampo 
-Vero (Rim do Macaco Verde) - Vírus herpes 
-BHK- Baby hamster kidney. 
 
Cultivo Celular 
-Isolamento do vírus 
-Ensaios de infecciosidade 
-Estudos bioquímicos 
-Produção de vacinas 
Isolamento e Diagnóstico Virológico 
Resumo 
Tipos de Cultivo Celulares 
 
 
Materiais de Cultivo Celular 
-Garrafa de fundo plano (plástica ou vidro) garrafas T 
-Meio líquido Eagle, íons, vitaminas, aminoácidos, soro fetal bovino, antimicrobianos e 
bicarbonato. 
 
Contaminação de Cultivo Celular 
-As células (cultivo celular) podem ficar contaminadas com bactérias, fungos nas diversas 
etapas de preparação na sua metodologia. 
-Deste a preparação das células como também as soluções (soro fetal bovino). 
-Uso de antimicrobianos: gentamicina, cloranfenicol. 
 
EFEITO CITOPÁTICO: Fusão de células- Formação de células gigantes, multinucleadas chamadas 
de células Sinciciais. 
Exemplos: Vírus Sincicial Respiratório, Raiva, Sarampo e Caxumba. 
 
ISOLAMENTO VIRAL: Repasse e armazenamento. 
Após a produção do efeito CPE, a células juntamente com o substrato é solto ou liberado com 
a tripsina ou EDTA, a partir deste substrato, o mesmo é utilizado para etapas de identificação 
viral. 
 
 
“Métodos Sorológicos – Detecção Direta do Vírus” 
-Diagnosticar a patologia viral 
-Identificar novos sorotipos 
-Padrão epidemiológico 
 Inibição da hemoaglutinação: a capacidade de hemoaglutinação de um vírus é 
bloqueada quando esse vírus reage com o anticorpo específico. 
 ELISA - teste imunoenzimático 
 Reação de neutralização: está fundamentado no princípio de que vírus infecciosos, 
quando interagem com o anticorpo específico, são neutralizados e, por conseguinte 
perdem a capacidade de infectar células permissivas. 
 Imunofluorescência: utiliza anticorpos marcados com corantes fluorescentes. 
 Fixação do Complemento: o complemento, um agente lítico, é ligado (fixado) por um 
complexo antígeno-anticorpo. 
Isolamento e Diagnóstico Virológico 
Resumo 
“Diagnóstico Molecular” 
 Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) 
 Northern Blotting –RNA 
 Southern Blotting –DNA 
 Hibridização