Técnicas de Imunoensaios

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IMUNOENSAIOS
MODELOS DE TESTES
Natalia Witzke Testoni – estagiária Laboratório Verner Willrich
IMUNOENSAIOS:
•• IMUNOPRECIPITAÇÃOIMUNOPRECIPITAÇÃO
•• IMUNOENSAIOS DE AGLUTINAÇÃOIMUNOENSAIOS DE AGLUTINAÇÃO
•• RADIOIMUNOENSAIO (RIA)RADIOIMUNOENSAIO (RIA)
•• ENZIMOIMUNOENSAIOENZIMOIMUNOENSAIO
•• IMUNOENSAIOS FLUORESCENTESIMUNOENSAIOS FLUORESCENTES
•• IMUNOENSAIO QUIMIOLUMINESCENTEIMUNOENSAIO QUIMIOLUMINESCENTE
n As técnicas de imunoprecipitação permitem identificar e até quantificar
precipitados resultantes da interação antígeno- anticorpo.
n Entre os principais interferentes, entre físicos-químicos e imunológicos,
o que mais interfere na quantidade de precipitado formado são as
concentrações relativas de antígeno e e de anticorpos.
IMUNOPRECIPITAÇÃO
Estrutura da malha quando há
excesso de Ac
Equivalência Estrutura da malha quando há
excesso de Ag
VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicações. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.
Segundo o princípio da nefelometria, as reações de
precipitação entre antígeno e anticorpo em soluções diluídas
produzem um aumento da reflexão da luz, que pode ser
diretamente medida pela dispersão da luz incidente.
Princípio de Tyndall:
Feixe de Luz
Sensor
Sensor
Sensor
IM
UN
OP
RE
CI
PI
TA
ÇÃ
O
NEFELOMETRIA:
VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicações. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.
IMUNOENSAIOS DE AGLUTINAÇÃO
A característica principal da imunoaglutinação é
que um dos componentes é apresentado na
forma insolúvel em suspensão, de forma natural
em células ou adsorvido artificialmente em
micropartículas ou células.
VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicações. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.
n Fatores que diferem a formação dos
agregados:
• Classe do anticorpo envolvido
• Concentração iônica e pH do meio
• Presença de macromoléculas, íons, enzimas e
conservantes.
• Tempo e temperatura
• Padronização adequada da suspensão de
micropartículas ou células.
• Concentração ótima de antígeno ou Ac a ser fixado
nas micropartículas ou células.
• Estabilidade da ligação do Ag/Ac e acessibilidade
dessa molécula nas micropartículas ou células.
IM
UN
OE
NS
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DE
AG
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O
VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicações. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.
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n AGLUTINAÇÃO DIRETA:
Neste teste, o antígeno faz parte naturalmente da célula, e
haverá aglutinação dessas células promovida por anticorpo
contra esses antígenos (antígeno é naturalmente insolúvel).
Anticorpo conjugado
IMUNOENSAIOS DE AGLUTINAÇÃO
Ex: Identificação de antígenos eritrocitários na tipagem sanguínea, reação de Widal
Complexo precipitadoAntígeno
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AGLUTINAÇÃO INDIRETA:
Esse método emprega a absorção de anticorpos ou
antígenos protéicos solúveis na superfície de
micropartículas inertes (suporte).
As principais partículas usadas como suporte são o
látex, hemácias e gelatina.
IMUNOENSAIOS DE AGLUTINAÇÃO
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IMUNOAGLUTINAÇÃO
Anticorpo conjugado
Antígeno
Antígeno conjugado Anticorpo
A aglutinação ocorre quando há formação de
agregados suficientemente grandes de
micropartículas ou células interligados por
pontes moleculares de anticorpos
IND
IRE
TA
Complexo precipitado
HENRY
VantagensVantagens da técnica de imunoaglutinação:
• Baixo custo
• Elevada sensibilidade
• Leitura visual
• Facilidade de execução
DesvantagensDesvantagens da técnica de imunoaglutinação:
• Reprodutibilidade dos lotes de reagentes.
• Acessibilidade molecular para interação Ag-Ac
• Estabilidade da ligação do Ag/Ac no suporte
IMUNOENSAIOS DE AGLUTINAÇÃO
VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicações. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.
RADIOIMUNOENSAIO (RIA)
• Os Radioimunoensaios utilizam anticorpos
conjugados com radioisótopos para quantificar os
ensaios.
• Os radioisótopos podem ser: Iodo 125 ou 131,
Cobalto, Trício.
• Devido a meia-vida dos reagentes utilizados, o risco
operacional e a necessidade de medidas especiais e
de elevado custo de biossegurança e descarte de
material levam a laboratórios optarem por técnicas
que empregam reagentes de maior estabilidade.
MAPHERSON, R.A., PINCUS, M. R. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods
VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicações. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.
http://www.dpcmedlab.com.br/areacientifica/metodologias.asp
1° MÉTODO:
Uma quantidade conhecida de antígenos marcados e Antígenos da
amostras são misturadas e reagem competitivamente com uma
quantidade fixa de Anticorpos fixos na fase sólida.
Depois que a reação imune atinge o equilíbrio, a mistura é lavada
para remover os conjugados não reativos, que são separados do
complexo imune preso na fase sólida. A concentração do analito é
inversamente proporcional ao sinal emitido.
RADIOIMUNOENSAIO (RIA)
Antígeno conjugadoAntígeno da amostra
Lavagem
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2° MANEIRA:
Método do sanduíche, onde um anticorpo ligado a fase sólida
forma um imunocomplexo. Um segundo Anticorpo conjugado se liga ao
imunocomplexo.
É feito uma lavagem para retirar os anticorpos conjugados não
reativos. E em seguida é feita a lavagem
RADIOIMUNOENSAIO (RIA)
Quantificação
MAPHERSON, R.A., PINCUS, M. R. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods
A concentração do
analito é diretamente
proporcional ao sinal
emitido.
RADIOIMUNOENSAIO (RIA)
• Vantagens:
– Alta sensibilidade
– Permite medidas rápidas e precisas
– Limiar de detecção em nanogramas e picogramas.
• Desvantagens:
– Custo
– Vida média dos reagentes
– Risco operacional (radiação)
Ténicas imunológicas -
• É similar a RIA, exceto que é a atividade
enzimática que é quantificada e não a
radioatividade.
• O EIA requer um processo secundário para
obter o sinal através das reações catalíticas
das enzimas.
ENZIMOIMUNOENSAIO (EIA)
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ENZIMOIMUNOENSAIO
Enzima
Enzima
Enzima
Ensaio competitivo Ensaio Não-competitivo (sanduíche)
Ensaio Antígeno
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ENZIMOIMUNOENSAIO (EIA)
Forma ativa
da enzima
ENZIMA
ENZIMA
ENZIMA
ENZIMA
ENZIMA
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Vantagens:
Reagentes são relativamente
baratos e tem uma longa
estabilidade
• Podem ser desenvolvidos
múltiplos ensaios simultâneos
• O equipamento é barato e
facilmente disponível
• Não há riscos de radiação
durante a marcação ou
descarte do teste
Desvantagens:
• A quantificação da enzima
pode ser mais complexa que
a de alguns radioisótopos.
• Atividade enzimática pode
ser afetada por constituintes
do plasma
• Ensaios homogêneos não
são tão sensíveis quanto os
RIA.
• EIA para moléculas protéicas
grandes necessitam de
reagentes imunoquímicos
complexos
MAPHERSON, R.A., PINCUS, M. R. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory MethodsENZIMOIMUNOENSAIO (EIA)
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ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
Baseia-se na imobilização de um dos
componentes, em fase sólida, e na utilização de
um conjugado ligado a uma enzima.
Como o substrato forma um produto colorido,
a alteração de cor é monitorada visualmente ou
por meio de espectrofotômetro que relaciona a
quantidade de substância dosada à intensidade de
cor.
ENZIMOIMUNOENSAIO (EIA)
MAPHERSON, R.A., PINCUS, M. R. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods n httpwww.microvet.arizona.educoursesmic419ToolBoxelisa3.jpg
Variação nos tons
ENZIMOIMUNOENSAIO (EIA)
Ele apresenta:
• Elevada sensibilidade
• Rapidez e baixo custo
• Objetividade na leitura
• Possibilidade de adaptação a diferentes
graus de automação.
• utiliza reagentes estáveis
• não trabalha com radioisótopos
• Não depende de formação de precipitado,
aglutinado, etc.
VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicações. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.
MEIA – Microparticle Enzyme Immuno Assay
n Depois do ELISA, nasceu o MEIA. A tecnologia MEIA
tem como princípio o uso de micropartículas
sensibilizadas com anticorpos ou antígenos
(dependendo da finalidade do produto), sendo sua
técnica utilizada para testes qualitativos e quantitativos.
n O fato de utilizar micropartículas como fase sólida
aumenta a superfície de contato entre as partes da
solução, aumentando a sensibilidade e a especificidade
do método e diminuindo o seu tempo de incubação.
PAULA, T. B. C.; MORONI, A. F.; GUAZZELLI, C.; NONOYAMA, K.; SALZONE, C. M. Efeitos dos contraceptivos hormonais orais de baixa dosagem
estrogênica nas taxas de folato intra-eritrocitário
MAPHERSON, R.A., PINCUS, M. R. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods
n Nos testes de imunofluorescência são
empregados anticorpos ou antígenos
conjugados a moléculas reveladoras
chamadas fluorocromosfluorocromos..
ENSAIOS IMUNOFLUORESCENTES
MAPHERSON, R.A., PINCUS, M. R. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods
Os testes de imunofluorescência podem ser classificados
de acordo com o componente marcado (antígeno ou
anticorpo), pelo método (competitivo ou não competitivo), por
serem homogêneos ou heterogêneos, ou ainda pela
realização em fase sólida ou líquida.
• A principal aplicação da imunofluorescência direta é na
imunocitoquímica (doenças imunológicas renais e de pele).
• A imunofluorescência indireta amplifica o sinal e aumenta a
sensibilidade do teste. Além disso, pode ser empregado na
pesquisa de antígenos (plasmódio em hemácia) e de anticorpos
(sífilis, toxoplasmose, rubéola, citomegalovírus, vírus do herpes
simples, doença de Chagas, malária, etc).
IMUNOFLUORESCENTES
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Técnica imunológicas -
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http://www.labsaluti.com.br/img/fotoifichagas.png
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA IMUNOFLUORESCENTES
• As VANTAGENS da imunofluorescência indireta:
– Sensibilidade
– Especificidade
– Reprodutibilidade
– De simples padronização e execução
• As DESVANTAGENS da imunofluorescência indireta:
– Necessidade de microscópio de fluorescência
– Subjetividade na leitura
– Não-automação
IMUNOENSAIO QUIMIOLUMINESCENTE
Esses teste utilizam como conjugados moléculas
geradoras de quimioluminescência como os derivados
do luminol, ésteres acridinium, derivados de nitrofenil
oxalato ou rutenium tri-bipridyl com tripropilamina(TPA).
Esta reação hidrolisa o substrato quimiluminescente
gerando um produto instável o qual após estabilização
gera emissão de fótons de luz (amplificados) que é
medida através de um fotomultiplicador, que tem a
função de transformar a luz emitida pelos fótons em
impulsos elétricos.
Estes impulsos são lidos em “contagens” de luz por
segundo (cps).
Manual Elecsys 2010 – Roche Diagnosticshttp://www.dpcmedlab.com.br/areacientifica/metodologias.asp
Vantagens sobre o ELISA e MEIA
n O sinal da quimioluminescência é um sinal que
permite verificar muito mais variações que o sinal
colorimétrico emitido pelo ELISA ou MEIA.
n Devido à elevada sensibilidade, os ensaios de
quimiluminescentes são muito usados para a
determinação quantitativa de hormônios, marcadores
tumorais, peptídeos e drogas.
ECLIA
A eletroquimioluminescência ocorre quando é
aplicada uma corrente elétrica em um eletrodo de
platina, cria um campo elétrico que fazendo com que
todos os materiais nesse campo reajam.
Complexo que gera a luminescência:
Rutênio(II)tri(bipiridil) + Tripropilamina
[Ru(bpi)3]2 (TPA)
O rutênio e o TPA são estáveis quando não é
aplicada a voltagem.
Manual Elecsys 2010 – Roche Diagnostics
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Manual Elecsys
Leitura:
1. Utilizando um ímã as micropartículas que se encontram
revestidas com complexos de antígeno - anticorpo são
uniformemente depositadas no eletrodo de trabalho.
2. O ímã é removido e depois é aplicada a voltagem ao
eletrodo onde estão depositadas as micropartículas.
3. A emissão de luz é medida com um fotomultiplicador.
4. Depois da medição as micropartículas são limpas da
superfície do eletrodo usando o Clean Cell
Manual Elecsys 2010 – Roche Diagnostics
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Manual Elecsys 2010 – Roche Diagnostics
Primeira etapa Segunda etapa
Terceira etapa
-Método sanduíche
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VANTAGENS
• Marcação estável permite utilizar reagentes líquidos.
• Tem alta sensibilidade com um período curto de
incubação (Elecsys: 18 minutos)
• Não existem grandes necessidades de diluição.
• É aplicável na detecção de todos os analitos
(métodos)
• A vantagem de iniciar a reação quimioluminescente
eletricamente reside no fato de se possível controlar,
com rigor, toda a reação.
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Manual ElecsysManual Elecsys 2010 – Roche Diagnostics
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